上饒市乙型流感病毒耐藥基因分析

張艷燕， 賴 宇， 朱 琳， 熊 英， 李健雄， 程暢河

上饒市乙型流感病毒耐藥基因分析

張艷燕1， 賴 宇2， 朱 琳1， 熊 英3， 李健雄3， 程暢河2

目的分析上饒市乙型流感病毒耐藥基因，為臨床用藥和疾病控制提供依據(jù)。方法從哨點(diǎn)醫(yī)院采集疑似流感患者咽拭子樣本，接種犬腎傳代細(xì)胞（Madin-Darby Canine Kidney，MDCK）及進(jìn)行分離培養(yǎng)。選擇分離到的乙型（即B型）流感病毒株進(jìn)行核酸提取后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR），擴(kuò)增神經(jīng)氨酸酶（neuraminidase，NA）基因并進(jìn)行核苷酸測序，采用DNA Star6.0、Mage5.0生物軟件對(duì)測序結(jié)果進(jìn)行分析處理，推導(dǎo)出氨基酸序列，進(jìn)行基因特性分析。結(jié)果7 株乙型流感病毒NA基因同源性高達(dá)99.5%以上，NA蛋白催化活性位點(diǎn)和輔助位點(diǎn)均無氨基酸替換。結(jié)論7株毒株均對(duì)流感病毒NA抑制劑藥物敏感，但仍應(yīng)加強(qiáng)對(duì)流感病毒的耐藥性監(jiān)測。

乙型流感病毒； 耐藥； 神經(jīng)氨酸酶基因

Abstract: ObjectiveTo characterize the neuraminidase (NA) genes of in fluenza B virus in Shangrao.MethodsThe specimens of nasopharyngeal swabs were collected from patients with in fluenza-like symptoms in in fluenza sentinel hospital. Seven strains of in fluenza B virus were randomly selected for culture and isolation in Madin-Darby Canine Kidney Epithelial Cells (MDCK Line).Viral RNA was extracted. Fragments of NA genes were ampli fied by one-step RT-PCR and then were sequenced. The data obtained were analyzed with software DNAStar 6.0 and Mage 5.0. The deduced amino acid sequences were examined to explore the features of NA gene.ResultsThe NA gene showed high homology of nucleotides between the 7 strains of in fluenza B virus. No amino acid substitution was found in catalytic or framework residues of the deduced amino acid sequences of NA gene.ConclusionsAll the 7 strains of in fluenza B virus were sensitive to neuraminidase inhibitors. However, ongoing resistance surveillance is necessary for control and prevention of in fluenza.

Key words:in fluenza B virus; resistance; neuraminidase gene

流感病毒分為甲型、乙型和丙型3類，以甲型和乙型流感病毒最為常見。其中乙型即B型流感病毒是感染人類的主要病原體之一，雖然對(duì)人類致病性較低，呈暴發(fā)和小流行，不引起世界性流感大流行，但在某些特定情況下造成危害不應(yīng)忽視[1]。其臨床主要治療藥物為神經(jīng)氨酸酶抑制劑（NAI），隨著長時(shí)間的使用該類藥物，耐藥毒株也隨之出現(xiàn)并引起重視。本研究分析江西省上饒市乙型流感病毒神經(jīng)氨酸酶（NA）基因特征，從而分析了我市乙型流感病毒的耐藥性，為臨床用藥和疾病控制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本選擇

從上饒市人民醫(yī)院采集的疑似流感患者咽拭子樣本接種于犬腎傳代細(xì)胞（Madin-Darby Canine Kedney，MDCK），細(xì)胞進(jìn)行病毒分離，采用血凝試驗(yàn)（HA）和血凝抑制試驗(yàn)（HI）鑒定出陽性毒株，按照樣本采集的時(shí)間分層抽樣隨機(jī)選取7株乙型流感病毒毒株（所有毒株均經(jīng)國家流感中心復(fù)核鑒定）。

1.2 方法

1.2.1病毒核酸提取和擴(kuò)增 用德國Qiagen 公司的QIAamp Viral RNA Mini Kit 試劑提取以上選取的7株乙型流感病毒毒株的RNA；采用QIAGEN One Step RT-PCR Kit 試劑盒并加入引物（NA-5’[2]上引物 GCAGAAGCAGAGCATATTCTTAG，下引物 ATGGACAAATCCTCCCTTGATGC ；NA-3’[3]上引物 GCACTCCTAATTAGCCCTCATAGA，下引物 AGGACAATTGTTCAAAC）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）（基因擴(kuò)增反應(yīng)條件[4]：60 ℃，1 min ；42 ℃，10 min ；50 ℃，30 mim ；95 ℃，15 min。PCR 循 環(huán) 如 下 ：94 ℃，40 s；50 ℃，40 s； 72 ℃，1 min，30 s；35次 循 環(huán)，72 ℃，10 min.）。

1.2.2核苷酸序列測定 PCR產(chǎn)物送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行雙向測定。

1.2.3序列分析 采用DNAStar6.0、Mage5.0序列分析軟件[5]對(duì)測序后核苷酸進(jìn)行分析，以B/Beijing/1/1987（國家流感中心指定）的NA基因序列作為參比分析，序列收錄號(hào)為M54967[4]。

2 結(jié)果

2.1 基因遺傳進(jìn)化分析

選取的7株上饒市乙型流感病毒均為Yamagata系，其編號(hào)分別為：B/j i a n g x i x i n z h o u/1 1 9/2 0 1 4、B/j i a n g x i x i n z h o u/1 1 4 1/2 0 1 4、B/ j i a n g x i x i n z h o u/1 1 6 6/2 0 1 4、B/ j i a n g x i x i n z h o u/1 2 1 7/2 0 1 4、B/ j i a n g x i x i n z h o u/1 2 3 9/2 0 1 4、B/ j i a n g x i x i n z h o u/1 2 5 2/2 0 1 4、B/ j i a n g x i x i n z h o u/1 3 3 2/2 0 1 4。

在NA基因氨基酸序列的種系進(jìn)化樹（圖1）上可見7株毒株與B/beijing/1/1987比較均在同一個(gè)分支上，其中B/jiangxixinzhou/1166/2014與其他6株有略微差異，因此存在一個(gè)小的分支。

2.2 基因核苷酸和氨基酸同源性

經(jīng)生物軟件分析，與B/Beijing/1/1987的序列進(jìn)行比較，核苷酸同源在93.4%～93.7%，氨基酸同源性均為92.5%，而這7株病毒之間NA基因核苷酸序列的同源性為99.5%～100%；氨基酸序列的同源性達(dá)到99.4%～100%（表1和表2）。

圖1 上饒市乙型流感病毒NA基因進(jìn)化樹Figure 1 Phylogenetic tree for 7 strains of in fl uenza B virus detected in Shangrao in terms of neuraminidase gene

表1 7株乙型流感病毒NA基因核苷酸的同源性分析Table 1 Nucleotide homology of NA gene between 7 strains of in fl uenzaBvirus（%）

2.3 NA基因耐藥性位點(diǎn)分析

根據(jù)核苷酸序列推導(dǎo)出NA基因氨基酸序列前500位，其中對(duì)NA基因酶催化活性位點(diǎn)（B Numbering）（R-116、D-149、R-150、R-223、E-275、R-292、 R374和406）氨基酸和輔助位點(diǎn)（E-117、R-154、W-177、S-178、D-197、I-221、E-226、H-273、E-276和N-294，E428位）氨基酸7株毒株均未發(fā)生替換，說明當(dāng)前情況下NA基因耐藥性未發(fā)生變化。

3 討論

乙型流感病毒變異進(jìn)化的主要機(jī)制是基因片段重配和堿基的插入或缺失，這既可以發(fā)生在Victoria系和Yamagata系之間，也可發(fā)生在同一系別不同分支的病毒之間[6]。雖然乙型流感病毒Victoria系和Yamagata系進(jìn)化特點(diǎn)不盡相同，但它們具有在人群中共存、共同進(jìn)化的特征[7]。流感病毒NA是流感病毒重要的表面糖蛋白，具有抗原性，可以催化唾液酸水解，協(xié)助成熟流感病毒脫離宿主細(xì)胞感染新的細(xì)胞[8]。NA通過抗原性轉(zhuǎn)變可以改變病毒的毒力和耐藥性，當(dāng)病毒發(fā)生變異從而使它們更有利于生存或更有利于逃避宿主免疫應(yīng)答時(shí)，新毒株會(huì)代替老毒株，導(dǎo)致病毒進(jìn)化[6]。本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)7株乙型流感病毒NA基因的測序分析，從進(jìn)化樹、核苷酸和氨基酸的同源性等3方面比較，均表明7株毒株與標(biāo)準(zhǔn)株B/beijing/1/1987之間的差距很小，在進(jìn)化樹上處于同一分支上；核苷酸和氨基酸的同源性均在90%以上；從氨基酸序列上看，影響耐藥的基因位點(diǎn)均未發(fā)生改變；說明當(dāng)前乙型流感病毒NA基因仍未發(fā)生變異。

表2 7株乙型流感病毒NA基因氨基酸序列的同源性分析Table 2 Homology of the deduced amino acid sequence of NA gene between 7 strains of in fl uenza B virus（%）

臨床上治療乙型流感的藥物僅有依賴NAI，流感病毒NA被作為藥物靶點(diǎn)[9]。全基因組分析證明影響病毒耐藥性的主要是NA基因酶催化活性 位 點(diǎn)（B Numbering）（R-116、D-149、R-150、R-223、E-275、R-292、 R374和 406）氨基酸和輔助 位 點(diǎn)（E-117、R-154、W-177、S-178、D-197、I-221、E-226、H-273、E-276和N-294，E428位）氨基酸[7，10]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些影響耐藥性的位點(diǎn)均未發(fā)生改變，表明流感病毒對(duì)NAI藥物敏感。這也和熊英等[4]報(bào)道的江西省內(nèi)2009－2012年乙型流感病毒耐藥基因分析相一致，說明在本地區(qū)范圍內(nèi)迄今為止尚未出現(xiàn)乙型流感病毒耐藥現(xiàn)象。另外，有報(bào)道NA基因在198、222、250、402等位點(diǎn)基因突變可以降低NAI的靈敏度[11]。本次實(shí)驗(yàn)亦發(fā)現(xiàn)除B/jiangxixinzhou/1166/2014外其他6株毒株基因在氨基酸402位都發(fā)生了A402T的替換，這些替換點(diǎn)位說明乙型流感病毒的變異可能已經(jīng)影響了NAI的靈敏度，但具體對(duì)臨床使用藥物的影響，尤其耐藥性的影響，仍有待進(jìn)一步的研究。

[1] HAI R，MARTINEZ-SOBRIDO L，F(xiàn)RASER KA，et al.Influenza B virus NS1-truncated mutants ：live-attenuated vaccine approach[J]．J Virol，2008， 82 （21） ：10580-10590.

[2] WHO. WHO information for laboratory diagnosis of pandemic（H1N1） 2009 virus in humans -revised[R]. Geneva： WHO.2009：15.

[3] WHO. WHO information for molecular diagnosis of influenza virus in humans-update[R]. Geneva：WHO，2011：16.

[4] 熊英，龔甜，李健雄，等. 江西省2009年－2012年B型流感病毒耐藥基因分析[ J] .中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志， 2014， 18 （15）：158-160.

[5] TAMURA K， PETERSON D， PETERSON N， et al. MEGA5：molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood，evolutionary distance， and maximum parsimony methods [J]. Mol Biol Evol， 2011，28（10）：2731-2739.

[6] 成艷輝，王釗，肖寧，等. 2013－2014年中國B型流感病毒抗原性及基因特性分析[ J] .中華實(shí)驗(yàn)和臨床病毒學(xué)雜志，2015，29（5）.385-390.

[7] LIN YP，GREGORY V，BENNETT M，et a1．Recent changes among human in fl uenza viruses[J]．Virus Res，2004，103（1-2）：47-52．

[8] 黃維娟，李希妍，譚敏菊，等. 2013-2014年流感流行季節(jié)中國大陸B(tài)型流感病毒對(duì)NA的敏感性[ J].病毒學(xué)報(bào)，2015，6（2）：152-156.

[9] BURNHAM AJ， BARANOVICH T，Goverkoca EA.Neuraminidase inhibitors for influenza B virus infection[J].Antiviral Research，2013，100（2）：520-534.

[10] 郭元吉，程小雯.流行性感冒及其實(shí)驗(yàn)技術(shù)[M] .北京：中國三峽出版社，1997：1-43.

[11] 岳秀芳，夏咸柱，于志君，等.兩株B型流感病毒的基因組序列分析[J]. 中國人獸共患學(xué)報(bào)，2013，29（3）：267-273.

Neuraminidase gene pro filing of in fluenza Bvirus in Shangrao

ZHANG Yanyan, LAI Yu, ZHU Lin, XIONG Ying, LI Jianxiong, CHENG Changhe. （Department of Laboratory Medicine, Shangrao Center for Disease Control and Prevention, Shangrao Jiangxi 334000, China）

R373.13

A

1009-7708 ( 2017 ) 05-0538-03

10.16718/j.1009-7708.2017.05.010

2017-01-03

2017-02-27

2014年江西省醫(yī)學(xué)學(xué)科省市共建計(jì)劃項(xiàng)目（201412）。

1. 上饒市疾病預(yù)防控制中心檢驗(yàn)科，江西上饒 334000；

2. 江西醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校藥學(xué)系；

3. 江西省疾病預(yù)防控制中心檢驗(yàn)科。

張艷燕（1984—），女，本科，主管技師，主要從事病毒的檢測工作。

程暢河，E-mail：chengchanghe@hotmail.com。