濱海鹽土自生固氮菌的篩選及其對(duì)玉米幼苗生長(zhǎng)的影響

王慧橋，陳為峰，諸葛玉平，賀明榮，王振林，張吉旺，董元杰*

(山東農(nóng)業(yè)大學(xué)1 資源與環(huán)境學(xué)院，2 農(nóng)學(xué)院；山東 泰安，271018)

濱海鹽土自生固氮菌的篩選及其對(duì)玉米幼苗生長(zhǎng)的影響

王慧橋1，陳為峰1，諸葛玉平1，賀明榮2，王振林2，張吉旺2，董元杰1*

(山東農(nóng)業(yè)大學(xué)1 資源與環(huán)境學(xué)院，2 農(nóng)學(xué)院；山東 泰安，271018)

為篩選有利于濱海鹽土植株生長(zhǎng)的自生固氮菌，以山東省濱州市無棣縣濱海鹽土為供試土壤，采用Ashby無氮培養(yǎng)基富集篩選自生固氮菌，乙炔還原法測(cè)定其固氮酶活性，玉米盆栽試驗(yàn)研究其固氮效能。以菌形態(tài)、生理生化特征和16S rDNA序列分析鑒定菌種。從供試土壤中篩選得到菌株A2和B1，經(jīng)鑒定為粘著劍菌Ensiferadhaerens，固氮酶活性分別為4.63和12.66 μmol·(h·mL)-1。通過玉米幼苗盆栽試驗(yàn)，菌株A2和B1對(duì)玉米幼苗株高、莖粗、鮮質(zhì)量和干質(zhì)量都有顯著的增加，其中B1增加最顯著。不同處理下植株氮含量均高于CK，其中B1菌株對(duì)玉米氮素含量增加效應(yīng)最大。接種固氮菌劑均不同程度地提高了植株磷含量，其中B1菌株提高了36.22%，差異顯著。說明B1菌株能夠很好的促進(jìn)濱海鹽土環(huán)境下玉米對(duì)N元素和P元素的吸收，菌株B1固氮能力、競(jìng)爭(zhēng)適應(yīng)能力更強(qiáng)。篩選得到的2株菌固氮性能較高，具備作為生產(chǎn)固氮微生物肥料菌種的潛力。

自生固氮菌；玉米；生物固氮；濱海鹽土；固氮酶活性

進(jìn)入21世紀(jì)，我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)既要求高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)，又要求品質(zhì)優(yōu)良、環(huán)境友好[1]。長(zhǎng)期以來，為追求農(nóng)作物的高產(chǎn)，人們大量施用化肥和農(nóng)藥，使得土壤質(zhì)量下降、生態(tài)環(huán)境惡化，嚴(yán)重影響了農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展與人類健康[2]。固氮微生物通過生物固氮把空氣中的氮?dú)廪D(zhuǎn)化成氨供給農(nóng)作物利用，因其具有提高土壤肥力、改善農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)、綠色環(huán)保、能夠自我更新增殖等特點(diǎn)，已成為新型肥料發(fā)展的重要方向之一[3]，世界各國學(xué)者對(duì)固氮微生物肥料的研究和應(yīng)用都予以高度重視[4,5]。菌種是微生物肥料生產(chǎn)的基礎(chǔ)，新型固氮微生物肥料的研制急需廣譜、高效、抗逆的菌種。自生固氮菌較共生固氮菌的應(yīng)用范圍更廣泛，可為小麥、玉米、水稻、蔬菜、棉花、果樹等主要農(nóng)作物提供氮素養(yǎng)分，在固氮微生物肥料方面有重要的應(yīng)用價(jià)值[6～8]。因而，選育適用于廣泛農(nóng)作物品種、具備高效固氮和強(qiáng)競(jìng)爭(zhēng)性的自生固氮菌菌種，研發(fā)固氮微生物肥料對(duì)生態(tài)農(nóng)業(yè)的發(fā)展具有重要科學(xué)意義和應(yīng)用價(jià)值。李文鳳[9]從西藏林芝地區(qū)偏弱酸性土壤中分離出了固氮酶活達(dá)66.5 μmol·h-1的自生固氮菌；Jos Vanderleyden等[10]將自生固氮菌K.pneumoniae324接種小麥植株上，接種的小麥與對(duì)照相比，長(zhǎng)得更高、莖稈更強(qiáng)健、葉綠素含量更高，其地下根系和地上苗系的干質(zhì)量比對(duì)照高50%；劉劍君[11]從烤煙根際分離到了一株糞產(chǎn)堿菌N05制成固氮菌肥，在氮肥減施20%條件下，煙葉中氮含量仍很高。而有關(guān)在我國分布廣泛的濱海鹽土自生固氮菌篩選的研究卻鮮見報(bào)道。

筆者從濱海鹽土中篩選高效自生固氮菌，并對(duì)其進(jìn)行生理生化試驗(yàn)及16S rDNA分子鑒定，再將其擴(kuò)大培養(yǎng)制成菌劑，接種到盆栽玉米的鹽堿土中，研究不同自生固氮菌對(duì)盆栽玉米幼苗生長(zhǎng)的影響，篩選適應(yīng)性強(qiáng)、固氮性能高的自生固氮菌，為固氮微生物肥料的研發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株與試劑

對(duì)照固氮菌微生物肥料購自蘇柯漢(濰坊)生物工程有限公司，從中篩選已有的固氮菌菌種，作為對(duì)照。試驗(yàn)所用生化反應(yīng)管、自生固氮菌培養(yǎng)基等耗材購自山東青島海博化學(xué)試劑有限公司。

*通訊作者，男，博士，副教授。主要研究方向：土壤生態(tài)與植物營(yíng)養(yǎng)。E-mail：yuanjiedong@163.com。

1.2 自生固氮菌分離與篩選

供試土壤采自山東省無棣縣渤海糧倉試驗(yàn)示范基地，土壤類型是濱海鹽土。采樣深度為5～15 cm。將從田間取得的新鮮土樣放入密封袋中，帶回實(shí)驗(yàn)室過2 mm篩，4 ℃保存。稱取混合土樣6 g，放入盛有60 mL無菌水的三角瓶中，28 ℃的搖床180 r·min-1振蕩2 h制成菌懸液。取上清液在試管中進(jìn)行濃度梯度稀釋，選取3個(gè)稀釋度(10-4，10-5，10-6)的稀釋液0.1 mL涂布于Ashby無氮固體培養(yǎng)基上，每個(gè)濃度重復(fù)3皿。將接種過的培養(yǎng)基放入恒溫箱內(nèi)，28 ℃恒溫培養(yǎng)4 d，用于自生固氮菌的分離。購買的微生物菌肥也做同樣處理。

4 d后，取出培養(yǎng)皿，統(tǒng)計(jì)固氮菌的菌落數(shù)量，仔細(xì)觀察培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)，鏡檢進(jìn)行確認(rèn)。挑取生長(zhǎng)較大及不同形態(tài)的菌落劃線純化數(shù)次，至有規(guī)則單菌落出現(xiàn)。將單菌落接種到斜面培養(yǎng)基，直至菌落長(zhǎng)起，置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 菌株復(fù)篩

1.3.1菌株固氮量測(cè)定 將初篩菌株分別接入固氮液體培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)，28 ℃，180 r·min-1振蕩培養(yǎng)4 d，采用半微量凱氏定氮法[12]測(cè)定各菌株菌液固氮量，復(fù)篩固氮量高的菌株。

1.3.2菌株固氮酶活性測(cè)定 固氮酶活性測(cè)定參考姜瑛等[13,14]的乙炔還原法，作如下改動(dòng)：將復(fù)篩純化后的菌株，接種在裝有2 mL無氮液體培養(yǎng)基的青霉素小瓶中，28 ℃下培養(yǎng)48 h；將棉塞換為反口膠塞密封，用密封性好的注射器先從培養(yǎng)有菌的青霉素小瓶抽取2 mL空氣，再注入2 mL C2H2，用膠布密封針眼；繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，取1 mL氣樣在氣相色譜儀上測(cè)定C2H4峰值，標(biāo)準(zhǔn)氣C2H4濃度為1.96 μg·mL-1。

采用GC-9A型氣相色譜儀，其工作條件設(shè)置為：氫焰電離檢測(cè)器FID，檢測(cè)室氣化溫120 ℃；H2流量50 mL·min-1，壓力20 kPa；色譜柱為2 m×3 mm玻璃柱，固體固定相為高分子多孔微球GDX-502，柱溫70 ℃；載氣高純N2，流量20 mL·min-1，壓力20 kPa；空氣流量500 mL·min-1。

1.4 自生固氮菌鑒定

1.4.1形態(tài)學(xué)特征分析 將復(fù)篩菌株接種在Ashby無氮固體培養(yǎng)基上，觀察菌落形態(tài)特征；挑取部分菌體細(xì)胞進(jìn)行顯微觀察，觀察菌株細(xì)胞形態(tài)、革蘭氏染色等結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。

1.4.2生理生化特征測(cè)定 參考《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[15]和《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》[16]測(cè)定自生固氮菌生理生化特征。

1.4.3菌株16S rDNA序列分析 提取細(xì)菌基因組總DNA后，采用細(xì)菌16S rDNA通用引物27f (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′) 和1492r (5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′) 進(jìn)行16S rDNA的PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增片斷長(zhǎng)度為1.5 kb。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min，進(jìn)入熱循環(huán)，94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72℃ 延伸10 min，共35個(gè)循環(huán)。取PCR產(chǎn)物在質(zhì)量濃度為10 g·L-1的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后回收純化。PCR產(chǎn)物由北京六合華大基因科技有限公司進(jìn)行測(cè)序，并將獲得的16S rDNA序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對(duì)，Blast搜索同源序列，使用DNAMAN 8.0軟件，以Maximum-Likelihood法建立系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.5 盆栽玉米固氮菌效能研究

1.5.1供試材料 供試土壤取自山東省濱州市渤海糧倉試驗(yàn)示范基地，有機(jī)質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)7.30 g·kg-1，全氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.67 g·kg-1，有效磷質(zhì)量分?jǐn)?shù)14.34 mg·kg-1，速效鉀質(zhì)量分?jǐn)?shù)67.31 mg·kg-1，全鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.23 g·kg-1，pH 7.87。供試玉米品種為“花糯1號(hào)”。

1.5.2試驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法

接菌處理：將從土中復(fù)篩的兩株具有較高固氮能力的菌(A2和B1)接種于無氮液體培養(yǎng)基(對(duì)從商品菌肥中篩選的菌C2做相同處理)，在28 ℃搖床中180 r·min-1恒溫培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，在無菌操作臺(tái)將菌液轉(zhuǎn)入滅過菌的離心管中，5 000 r·min-1離心5 min，倒掉上清液，用無菌水反復(fù)洗滌(重懸-離心-去上清液)離心管底部菌體后，將其重懸于無菌水中，制成濃度大約為107cfu·mL-1的細(xì)菌懸液待用。

盆栽試驗(yàn)：設(shè)4個(gè)處理，(1)空白對(duì)照(CK)；(2)107cfu·mL-1菌劑A2處理(A2)；(3)107cfu·mL-1菌劑B1處理(B1)；(4)107cfu·mL-1菌劑C2處理(C2)。試驗(yàn)在山東農(nóng)業(yè)大學(xué)植物營(yíng)養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，采用直徑13 cm，高14 cm的塑料盆，每盆裝土1 kg。每盆種植5顆經(jīng)催芽處理的種子，按106cfu·g-1土的接種量(即每盆接種100 mL)接種供試菌株，空白對(duì)照接種等量無菌水。每個(gè)處理設(shè)置5次重復(fù)，每天澆無菌水以保持土壤含水量的穩(wěn)定。出苗20 d后收獲、分析并測(cè)試。1.5.3植株生長(zhǎng)情況測(cè)定 株高、鮮質(zhì)量和干質(zhì)量采用常規(guī)直尺測(cè)量和天平稱量方法。植物氮、磷、鉀測(cè)定方法：全氮采用H2SO4-H2O2消煮-凱氏定氮法測(cè)定；全磷采用H2SO4-H2O2消煮-鉬銻抗比色法測(cè)定；全鉀采用H2SO4-H2O2消煮-火焰光度法測(cè)定[17]。葉綠素含量采用乙醇提取、紫外分光光度法測(cè)定[18]。

1.6 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2003軟件處理數(shù)據(jù)和繪表，DPS 7.05軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，最小顯著極差法(LSD)進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)(p<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 自生固氮菌篩選

試驗(yàn)從土壤中共分離獲得17株自生固氮菌，挑選其中菌落數(shù)較多、較典型菌落進(jìn)一步分離純化及傳代培養(yǎng)，共篩選獲得仍可保持原菌落特點(diǎn)的固氮菌4株(A1，A2，B1，B2)。從對(duì)照菌肥中篩選得到固氮菌2株(C1，C2)。將其分別轉(zhuǎn)入固氮菌液體培養(yǎng)基，測(cè)定各菌株固氮量。結(jié)果表明，4株菌都具有一定的固氮能力(圖1)。從濱海鹽土中篩選的菌株，B1和A2固氮能力最強(qiáng)，固氮量分別為1.94和1.32 μg·mL-1，培養(yǎng)基含氮量為0。而從商品菌肥中篩選的菌株C1和C2固氮能力差異不顯著，分別為1.06和1.07 μg·mL-1。依據(jù)該結(jié)果，將A2，B1和C2作為復(fù)篩菌株，對(duì)其進(jìn)行固氮酶活性測(cè)定，分別達(dá)到了4.63，12.66和5.72 μmol·(h·mL)-1，后續(xù)對(duì)此3株菌進(jìn)行生理生化試驗(yàn)、16S rDNA分析鑒定及盆栽玉米試驗(yàn)。

圖1 自生固氮菌固氮量比較

2.2篩選菌株的形態(tài)特征、生理生化特性及16S rDNA序列分析

經(jīng)平板劃線、革蘭氏染色，觀察菌株培養(yǎng)特征及菌體形態(tài)特征。選育的菌株A2在無氮培養(yǎng)基平板上形成圓形、灰白色不透明的隆起菌落，直徑1～3 mm，表面光滑粘稠，濕潤(rùn)有光澤，質(zhì)地不均勻，邊緣整齊(圖2 a)。菌體呈桿狀，單個(gè)、成對(duì)或不規(guī)則的堆狀(圖2 d)。革蘭氏染色呈紅色。

菌株B1菌落直徑1～2 mm，呈圓形、較小、半透明、灰白色、隆起菌落，表面光滑濕潤(rùn)，粘稠，邊緣整齊，質(zhì)地較均勻(圖2 b)。菌體呈桿狀，單個(gè)，成對(duì)或成堆排列(圖2 e)。革蘭氏染色陰性呈紅色。

菌株C2形成的菌落較大、無色透明、扁平，表面光滑濕潤(rùn)，粘稠似油滴，邊緣較整齊，并且能分解該培養(yǎng)基呈透明(圖2 c)。菌體較小呈短桿狀(圖2 f)。革蘭氏染色紅色。

3株自生固氮菌所具有的酶系統(tǒng)不相同，對(duì)營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)的分解能力也不一樣。A2脲酶反應(yīng)強(qiáng)烈，證明該菌具有較強(qiáng)的分解尿素的能力；淀粉水解實(shí)驗(yàn)呈陽性反應(yīng)，說明該菌可以產(chǎn)生分解淀粉的酶；其他的生理生化反應(yīng)呈陰性反應(yīng)。B1尿素反應(yīng)較強(qiáng)烈；其明膠液化反應(yīng)呈陽性，說明該菌具有明膠酶，可以將明膠水解；觸酶試驗(yàn)呈陽性，證明其具有過氧化氫酶；該菌具有淀粉水解酶，淀粉反應(yīng)呈陽性。C2能利用廣泛的碳源，尿素反應(yīng)呈陽性，可以水解明膠，能分解過氧化氫。具體生理生化指標(biāo)如表1所示。

圖2 自生固氮菌菌落與菌體形態(tài)

對(duì)篩選得到的3株菌，利用細(xì)菌16S rDNA通用引物27f和1492r對(duì)自生固氮菌基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，得到3條1 500 bp左右的特異性條帶(圖3)。經(jīng)16S rDNA序列分析和NCBI數(shù)據(jù)庫在線比對(duì)，結(jié)果表明A2和B1與Ensiferadhaerens同源性分別達(dá)到95.7%和95.8%，C2與Enterobacteramnigera同源性達(dá)到100%。采用NCBI數(shù)據(jù)庫高同源性菌株進(jìn)行的16S rDNA系統(tǒng)學(xué)發(fā)育樹分析也表明，A2和B1與Ensiferadhaerens親緣關(guān)系較近，而C2與Enterobacteramnigera親緣關(guān)系較近(圖4)。根據(jù)菌株的形態(tài)特征、生理生化特性，以及16S rDNA基因比對(duì)結(jié)果，參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[15]，菌株A2和B1被初步鑒定為粘著劍菌Ensiferadhaerens，菌株C2被初步鑒定為腸桿菌科Enterobacteramnigera。

表1 固氮菌生理生化特征

注：“+”，陽性反應(yīng)或長(zhǎng)勢(shì)良好；“-”，陰性 反應(yīng)或不生長(zhǎng)。

圖3 篩選自生固氮菌16S rDNA瓊脂糖凝膠電泳圖譜

圖4 根據(jù)16S rDNA序列分析構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 不同自生固氮菌對(duì)玉米幼苗生長(zhǎng)及養(yǎng)分積累量的影響

將菌劑接入玉米盆栽土壤，研究接種菌劑對(duì)玉米幼苗生長(zhǎng)的影響。20 d后，接種菌劑的玉米植株生長(zhǎng)健壯，葉片長(zhǎng)，葉片色澤濃綠。由表2可知，添加菌劑的3個(gè)處理玉米株高、莖粗和鮮質(zhì)量含量均顯著高于對(duì)照。添加菌劑A2和B1的玉米株高均顯著高于菌劑C2處理，且B1處理下玉米株高比A2處理提高了6.71%，差異達(dá)到顯著水平。菌劑B1處理玉米莖粗、鮮質(zhì)量和干質(zhì)量顯著高于A2和C2處理，較C2分別增加5.56%，12.29%和7.50%。A2處理玉米莖粗和鮮質(zhì)量較C2處理分別增加了2.78%和3.04%。說明本試驗(yàn)篩選得到的2菌株優(yōu)于試驗(yàn)選用商品菌肥，并且以菌株B1試驗(yàn)效果更好。

表2 固氮菌劑對(duì)盆栽玉米生長(zhǎng)指標(biāo)的影響

注：同一列中不同字母表示差異顯著(p<0.05)。

葉綠素直接參與光能吸收和能量的轉(zhuǎn)化，其含量的高低直接影響玉米的光合能力。由表2可知，不同菌劑處理均不同程度地提高了玉米葉綠素含量，各處理玉米葉綠素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)由高到低的順序表現(xiàn)為： A2，B1，C2。 A2和B1處理較C2分別增加了6.12%和2.55%，但差異不顯著。

由表3可見，不同處理下植株氮含量均高于CK，但差異未達(dá)顯著水平。其中B1菌株對(duì)玉米氮素含量增加最大，各菌劑處理之間玉米N的質(zhì)量分?jǐn)?shù)由高到低的順序?yàn)椋築1，C2，A2。接種固氮菌劑均不同程度地提高了植株磷含量，其中B1菌株與對(duì)照相比提高了36.22%，差異達(dá)到顯著水平。綜上說明，B1菌株能夠很好地促進(jìn)濱海鹽土環(huán)境下玉米對(duì)N和P元素的吸收。

表3 接種固氮菌劑后玉米植株中氮磷鉀的質(zhì)量分?jǐn)?shù)

3 結(jié)論與討論

自生固氮菌是一類在土壤或培養(yǎng)基中，可以固定空氣中分子態(tài)氮的細(xì)菌。它們不與其他生物形成共生體系，并以土壤有機(jī)質(zhì)和礦質(zhì)養(yǎng)分為碳源和養(yǎng)料進(jìn)行生物固氮作用。這類細(xì)菌固氮的全過程都在其自身細(xì)胞中進(jìn)行。所固定的氮在細(xì)菌死亡腐解后釋放到土壤中供植物利用。一般自生固氮菌的固氮能力較共生固氮菌低，但由于其不受宿主等因素限制，其生產(chǎn)和使用都很方便。

自生固氮菌的固氮研究遠(yuǎn)不如豆科植物共生固氮菌的研究那樣深入[19]。研究發(fā)現(xiàn)大部分自生固氮菌都可以促進(jìn)植株生長(zhǎng)。Bahrani 等[20]研究發(fā)現(xiàn)接種褐球固氮菌可以提高冬小麥(Triticumaestivum)的籽粒產(chǎn)量與蛋白質(zhì)含量。Kizilkaya 等[21]采用分離于土耳其安納托利亞北部的11株褐球固氮菌接種春小麥，結(jié)果表明褐球固氮菌可以促進(jìn)春小麥生長(zhǎng)并提高植株氮含量。接種固氮微生物為農(nóng)作物提供氮素養(yǎng)分具有實(shí)踐指導(dǎo)意義[22]。

試驗(yàn)用土未經(jīng)滅菌，試驗(yàn)條件更接近玉米生長(zhǎng)的自然條件，所得結(jié)果對(duì)應(yīng)用該固氮菌制作微生物固氮菌肥更有參考價(jià)值。本試驗(yàn)通過觀察細(xì)菌形態(tài)和生理生化特征以及16S rDNA基因序列分析，鑒定得出A2和B1均為劍菌屬粘著劍菌Ensiferadhaerens，C2為腸桿菌屬Enterobacteramnigera。試驗(yàn)結(jié)果表明經(jīng)過A2或B1處理的玉米幼苗期形態(tài)指標(biāo)與生理指標(biāo)均高于C2處理。在株高方面，接種菌劑都可促進(jìn)其生長(zhǎng)，可能是由于固氮菌除了固氮之外，分泌的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)，刺激了植物根系的生長(zhǎng)發(fā)育，這與李春儉等[23]的研究結(jié)果基本一致。并且數(shù)據(jù)表明A2和B1菌株在單位時(shí)間內(nèi)固氮量比C2分別增加23.15%和81.49%，這說明在無棣濱海鹽土中提取的固氮菌其固氮能力要強(qiáng)于所購買的固氮菌肥中的固氮菌，且更加適合鹽分含量較高條件下玉米幼苗的生長(zhǎng)。

接種的2株自生固氮菌A2和B1均能有效提高玉米幼苗葉綠素含量，可能是分泌生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)的刺激作用，提高了玉米幼苗根系活力，從而提高了植株光合效率。國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)固氮菌株促進(jìn)植物生長(zhǎng)的重要原因之一是其能分泌植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)。Okeny[24]研究發(fā)現(xiàn)，接種巴西固氮螺菌對(duì)植物根系的促生作用明顯高于接種其IAA缺失菌株(對(duì)照)；陳明[25]報(bào)道，接種固氮菌與施用外源植物激素具有相類似的效應(yīng)，對(duì)糞產(chǎn)堿桿菌(Acaligenesfeacalis)的研究發(fā)現(xiàn)，該菌具有分泌IAA的功能。根際中的自生固氮菌可以固定空氣中的氮?dú)?，供給植物無機(jī)及有機(jī)氮源。作為一類特殊的固氮微生物，自生固氮菌在土壤中與植物和其他微生物存在一定的互作關(guān)系，如自生固氮菌代謝產(chǎn)物可供其他土壤微生物的生長(zhǎng)。其次，自生固氮菌可以促進(jìn)植物根系的生長(zhǎng)發(fā)育，如促進(jìn)植物根系生物量提高和根系分叉數(shù)目增多，進(jìn)而使得根系活力增加，根系分泌物增多，加速土壤養(yǎng)分轉(zhuǎn)化。此時(shí)，根際微域環(huán)境中其他細(xì)菌可利用的生存附著空間和能量物質(zhì)(植物殘?bào)w或者根系分泌物、菌絲分泌的蛋白類物質(zhì))顯著提高，從而細(xì)菌數(shù)量有所增加。在根際土壤中，自生固氮菌固定氮?dú)獾乃俾室仍谌鄙僦参锏耐寥乐锌斓亩?，這是因?yàn)橹参镆环矫婺苡行У匚展潭ㄤ@態(tài)氮，另一方面植株根分泌的一些有機(jī)物可作為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)供自生固氮菌利用。

我國屬于農(nóng)業(yè)大國，化學(xué)肥料每年的施用量非常大，尤其是氮肥出現(xiàn)嚴(yán)重的濫用現(xiàn)象[26]。而玉米作為一種對(duì)氮肥需求量很大的作物，在實(shí)際生產(chǎn)過程中也不可避免地對(duì)氮肥有著很強(qiáng)的依賴性。由于氮肥的大量施用會(huì)對(duì)土壤造成一些不可逆的損傷，所以探究一種新型的無污染的氮肥施用方式勢(shì)在必行。試驗(yàn)分離獲得的2株自生固氮細(xì)菌，將為研制、開發(fā)新型生物氮肥提供菌種資源為其在大田的實(shí)際應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。試驗(yàn)也將進(jìn)一步研究菌株的固氮能力和固氮條件，以期為該菌在濱海鹽土的下一步應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)和參考。

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(責(zé)任編輯：朱寶昌，陳于和)

Abstract:The objective of the study was to isolate and screen the azotobacter which was beneficial to plant growth in coastal saline soil. The test soil sample was marine solonchak in Wudi, Shandong province. Ashby nitrogen-free medium was used to isolate nitrogen-fixers. Nitrogenase activity was determined by acetylene reduction assay. Inoculation effects were tested with corn pot cultured in greenhouse. Strain identification was carried out based on morphology and physiology, biochemical tests and 16S rDNA sequences analysis. Two strains termed as A2 and B1 with relative high nitrogenase activity (4.63 and 12.66 μmol·h-1·mL-1) were isolated, which were both identified asEnsiferadhaerens. The pot trial showed that the biomass of maize seedlings inoculated with two trains significantly increased compared with the control, while B1 treatment showed the best beneficial effects. The nitrogen content of corn was promoted after inoculation and the value caused by B1 were raised greatly. The phosphorus content of corn was improved by the inoculation of nitrogen-fixing bacteria and the difference of B1 was significantly increased by 36.22%. This indicated that strain B1 could promote absorption of both N and P in corn in coastal saline environment. The results revealed the strain B1 had stronger competition ability than the strain A2. However, both strains B2 and A1 had strong nitrogen-fixing ability and significant effect in promoting growth of corn, which was possible to be developed further as the excellent strains for microbial fertilizer production.

Keywords:azotobacter; corn; biological nitrogen fixation; seashore saline soil; nitrogenase activity

IsolationandIdentificationofAzotobacterandItsInfluenceonGrowthofCornSeedlingsinSeashoreSalineSoil

WANG Huiqiao1, CHEN Weifeng1, ZHUGE Yuping1, HE Mingrong2, WANG Zhenlin2, ZHANG Jiwang2, DONG Yuanjie1

(1 College of Resources and Environment, 2 College of Agronomy; Shandong Agricultural University, Tai’an Shandong, 271018, China)

S143.1; S513

A

1672-7983(2017)02-0060-08

10.3969/J.ISSN.1672-7983.2017.02.010

山東省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃(項(xiàng)目編號(hào)：2016CYJS05A02)；史丹利功能性生物肥料基金項(xiàng)目(項(xiàng)目編號(hào)：380078)；山東省自主創(chuàng)新及成果轉(zhuǎn)化專項(xiàng)(項(xiàng)目編號(hào)：2014ZZCX07402)。

2017-06-26

王慧橋(1992-)，女，碩士研究生。主要研究方向：土壤生態(tài)與植物營(yíng)養(yǎng)。