Tolprocarb衍生物的合成和對(duì)稻瘟病的活性

侯文君 編譯

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Tolprocarb衍生物的合成和對(duì)稻瘟病的活性

侯文君 編譯

(上海市農(nóng)藥研究所，上海 200032)

子囊菌亞門稻瘟病菌()是對(duì)水稻造成毀滅性的，分布廣泛的病原菌之一。稻瘟病菌在侵染過程中產(chǎn)生單細(xì)胞侵染結(jié)構(gòu)附著胞，附著胞產(chǎn)生纖細(xì)的“入侵絲”，刺穿寄主的細(xì)胞壁。附著胞的細(xì)胞壁含有由1,8-二羥萘(1,8-DHN)合成的黑色素致密層。黑色素的積累是稻瘟病菌附著胞穿透寄主植物的重要一步。研究也表明缺乏黑色素的稻瘟病菌突變體不能侵染被損傷的寄主植物。不同真菌的黑色素生物合成途徑已被報(bào)道。真菌中黑素色生物合成途徑起始于在聚酮合酶作用下1,3,6,8-四羥萘的生成。隨后，相繼發(fā)生還原和脫水得到中間體1,8-DHN，最后發(fā)生聚合反應(yīng)生成黑色素。

黑色素生物合成抑制劑早已被用于防治稻瘟病。根據(jù)所抑制的酶(還原酶和脫水酶)將此類抑制劑分為2類。環(huán)丙酰菌胺、咯喹酮或氰菌胺等還原酶抑制劑作用于黑色素生物合成中的2個(gè)羥萘還原酶。

Tolprocarb(2,2,2-三氟乙基[(1)-2-甲基-1-[[(4-甲基苯甲酰)氨基]甲基]丙基]氨基甲酸酯)由日本三井化學(xué)公司開發(fā)，對(duì)稻瘟病高效。其作用靶標(biāo)點(diǎn)為聚酮合酶，與傳統(tǒng)殺菌劑不同。因此其被殺菌劑抗性行動(dòng)委員會(huì)分為新的作用機(jī)制類別。本文評(píng)估了一系列tolprocarb衍生物對(duì)稻瘟病菌聚酮合酶抑制活性(PKS-A)、黑色素生物合成抑制活性(MBI-A)和對(duì)稻瘟病的防效(RBC-E)，來確定其作用靶點(diǎn)，研究其構(gòu)-效關(guān)系(SARs)和活性-活性關(guān)系(activity-activity relationship)。本文以tolprocarb為參考，將其衍生物分為3類進(jìn)行構(gòu)效關(guān)系研究(圖1)。

1 材料和方法

1.1 化合物、培養(yǎng)基和稻瘟病菌品系

本文中所有tolprocarb衍生物都是三井化學(xué)公司根據(jù)文獻(xiàn)中的常規(guī)方法合成(圖2)。一般，其衍生物都是從各自的氨基酸或氨基醇合成，如-叔丁氧羰基(-Boc)保護(hù)的氨基酸酯a或氨基醇b。Tolprocarb衍生物g可用不同的試劑或反應(yīng)合成，如氯甲酸酯衍生物、對(duì)硝基苯酚、-(4-硝基苯基)硫代碳酸鹽、異氰酸酯、異硫氰酸酯、氨基甲酰氯、氯酸、酸酐，或混合酸酐，或二環(huán)己基碳二亞胺或羰二咪唑等耦合劑與酸直接耦合。用Mettler FP62熔點(diǎn)儀(加熱速率3 ℃/min)測定熔點(diǎn)(ms)，未校正。以四甲基硅烷為內(nèi)標(biāo)，用JEOL JNM-400 FT-NMR或JEOL JNM-ECA-500測定質(zhì)子核磁共振譜(400或500 MHz)。丙二酰輔酶A和麥片瓊脂從Sigma購買。馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)和馬鈴薯葡萄糖肉湯(PDB)分別從Kyokuto Seiyaku和Difco實(shí)驗(yàn)室購買。所用的稻瘟病菌為三井化學(xué)公司所培養(yǎng)。

圖1 tolprocarb的結(jié)構(gòu)和SAR設(shè)計(jì)

1.2 對(duì)聚酮合酶活性的無細(xì)胞生測(Cell-free assay of PKS)

用已有的方法從異源表達(dá)稻瘟病菌聚酮合酶的米曲霉()中提取含有聚酮合酶的無細(xì)胞提取物(cell-free extract)，對(duì)聚酮合酶的活性進(jìn)行無細(xì)胞測定。含有50 mM磷酸鉀(pH 7.2)、500 μM丙二酰輔酶A、450 μg/mL蛋白和1個(gè)tolprocarb衍生物的反應(yīng)混合液(總體積200 μL)在25 ℃反應(yīng)2 h。然后加入到6 M HCl，使1,3,6,8-四羥萘氧化為淡黃霉素，終止反應(yīng)。用0.2 μm膜過濾，用高效液相色譜分析淡黃霉素。用四參數(shù)邏輯曲線擬合法(Prism Graph Pad 6.00)確定聚酮合酶被抑制的IC50。

1.3 用馬鈴薯葡萄糖瓊脂平板法測定黑色素生物合成被抑制活性

在含有或沒有tolprocarb衍生物的馬鈴薯葡萄糖瓊脂平板上接種稻瘟病菌菌碟(直徑6 mm)。在25 ℃培養(yǎng)7 d后，測定了500、100、5、1和0.04 mg/L tolprocarb衍生物對(duì)馬鈴薯葡萄糖瓊脂平板上菌絲黑化的最小抑制濃度(MICs)。肉眼觀察菌絲顏色的變化來確定黑色素生物合成的MICs，因?yàn)榭捎^察到菌絲中合成的黑色素為深灰色，而黑色素生物合成被抑制后產(chǎn)生的菌絲無色，如被tolprocarb抑制。發(fā)現(xiàn)所有化合物對(duì)真菌生長沒有抑制作用。

注：alkyl為乙基或甲基；Boc為叔丁基羰基；DEAD為偶氮二甲酸二乙酯；X為N(脲)、O(氨基甲酸酯)、C(酰胺)或S(硫代氨基甲酸酯)；A為氯甲酸酯、對(duì)硝基苯酚、-(4-硝基苯基)硫代碳酸鹽、異氰酸酯、異硫氰酸酯、氨基甲酰氯、氯酸、酸酐，或混合酸酐

圖2 tolprocarb衍生物合成的總反應(yīng)途徑

1.4 盆栽試驗(yàn)評(píng)估對(duì)稻瘟病的防效

在室溫，把水稻種子在水中浸泡2 d，然后在裝滿土壤的直徑6 cm的塑料盆中種植約30顆種子，培養(yǎng)10~14 d。在燕麥瓊脂平板上培養(yǎng)稻瘟病菌至產(chǎn)生分生孢子。把50 mg tolprocarb衍生物溶解于10 mL的丙酮中，然后用水稀釋為所需濃度。對(duì)2葉期水稻苗分別噴250、50、12.5、3.13、0.781和0.195 mg/L的藥液，噴藥量為50 mL/3個(gè)盆栽。自然干燥后，在受藥植物上噴稻瘟病菌孢子懸浮液(1×105個(gè)孢子/mL)，在25 ℃，12 h光照/12 h黑暗、高濕的培養(yǎng)室中培養(yǎng)7 d。計(jì)算10個(gè)接種病原菌苗(1個(gè)單元)的受損情況，病指：0為無癥狀，1為1~5個(gè)侵染斑，2為6~10個(gè)，3為11~20個(gè)，4為＞20個(gè)。按以下方程計(jì)算病害的嚴(yán)重程度和防治效果。

病害嚴(yán)重性（DS）=[∑(病指×每個(gè)病指的單元數(shù))/(4×單元總數(shù))]×100

防效=[(未處理植物的DS-處理植物的DS)/未處理植物的DS]×100

表1中的指數(shù)為tolprocarb衍生物防治稻瘟病的活性水平。

1.5 代謝生測

在21 ℃，在含有1個(gè)測試化合物的馬鈴薯葡萄糖肉湯中旋轉(zhuǎn)震蕩(110 rpm)培養(yǎng)稻瘟病菌，以孢子懸浮液為接種體(1×104孢子/mL)。用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法分析母體化合物和其代謝產(chǎn)物。用0.45 μm膜過濾，把稀釋的培養(yǎng)液注射入液相色譜柱，液相色譜柱通過Valco閥與質(zhì)譜相連，前2.4 min的洗滌液(注射后)以廢物從此閥排出。以正離子多反應(yīng)監(jiān)測方式測定母體和代謝化合物的量。

1.6 計(jì)算機(jī)分析

用偏最小二乘法的遺傳算法(ver.5.07)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，選擇最可能的變量。按以下方法定義經(jīng)驗(yàn)參數(shù)值對(duì)遺傳算法的影響：群數(shù)量500，選擇率0.3，交叉頻率0.05，突變頻率0.01。

2 結(jié) 果

2.1 對(duì)聚酮合酶抑制活性和對(duì)黑色素生物合成抑制活性間的關(guān)系

Tolprocar衍生物的活性和ms列于表2－4。除了無活性化合物(圖3)外，表2-4中所有化合物以對(duì)數(shù)形式表達(dá)時(shí)對(duì)聚酮合酶的抑制活性(pIC50)和對(duì)黑色素生物合成抑制活性(pMIC)間的線性關(guān)系(2=0.90)顯而易見。此外，除了化合物34外，聚酮合酶生測中無活性化合物在抑制黑色素生物合成的生測中活性非常弱或無。根此，筆者證實(shí)聚酮合酶是tolprocarb在黑色素生物合成途徑中的靶標(biāo)點(diǎn)。計(jì)算所得Alog也列于表2－4。Alog與對(duì)聚酮合酶抑制活性呈正相關(guān)性，特別是對(duì)于A(2=0.77)和C部分(2=0.67)。這些相關(guān)性表明化合物的A或C部分含有較多疏水基時(shí)對(duì)聚酮合酶具有較高的抑制活性。

2.2 對(duì)稻瘟病防效與對(duì)聚酮合酶抑制活性或?qū)谏厣锖铣梢种苹钚蚤g的相關(guān)關(guān)系

進(jìn)行GAPLS計(jì)算來確定對(duì)聚酮合酶抑制活性或?qū)谏厣锖铣梢种苹钚耘c對(duì)稻瘟病防效間關(guān)系的參數(shù)。用MOE計(jì)算了可能的二維形狀描述符。雖然GAPLS計(jì)算涉及許多二維描述符如極性分子表面面積和摩爾折射率，但選ms作為連接對(duì)稻瘟病防效(指數(shù))和對(duì)聚酮合酶抑制活性(pIC50)或?qū)谏厣锖铣梢种苹钚?pMIC)間關(guān)系的參數(shù)。對(duì)稻瘟病防效指數(shù)用m和pIC50或pMIC來表示。

指數(shù)=2.52 pIC50－0.041 8m+6.42

=29，2=0.651，=1.65，2.26=24.2 (1)

指數(shù)=1.45 pMIC－0.045 3m+11.5

=29，2=0.659，=1.63，2.26=25.1 (2)

其中，pIC50=log[1/IC50(mg/L)]，pMIC=log[1/MIC(mg/L)]，m為攝氏熔點(diǎn)，式(1)和(2)中，為化合物的數(shù)量，為相關(guān)系數(shù)，為標(biāo)準(zhǔn)差，為菲舍爾統(tǒng)計(jì)。

表1 盆栽試驗(yàn)指數(shù)

2.3 在稻瘟病菌菌絲群落中的代謝作用

黑色素生物合成抑制生測涉及稻瘟病菌對(duì)tolprocarb衍生物的代謝作用，然而，聚酮合酶無細(xì)胞生測不涉及。因此，通過對(duì)聚酮合酶抑制活性與黑色素生物合成抑制活性的對(duì)比來揭示稻瘟病菌的代謝作用。C部分為甲基酯基團(tuán)的化合物(34)對(duì)聚酮合酶的抑制活性和對(duì)黑色素生物合成抑制活性間不存在線性關(guān)系。一般，甲基酯代謝為羧酸。評(píng)估了有或無稻瘟病菌的馬鈴薯葡萄糖肉湯中化合物34和其預(yù)期的無活性代謝物(36)以及tolprocarb(1)的穩(wěn)定性，以此來研究此菌的代謝作用。表5列出了這幾個(gè)化合物隨時(shí)間的增加被稻瘟病菌代謝的情況。從表可知，化合物34的甲基酯被完全代謝為羧酸，即化合物34被代謝為36，但只是在稻瘟病菌的處理中。相比較，在稻瘟病菌的處理中，在140 h內(nèi)化合物1和36穩(wěn)定。

表2 tolprocarb衍生物(A部分)的活性和物理參數(shù)

序號(hào)RPKS-A IC50/μMMBI-A MIC/(mg·L-1)RBC-E指數(shù)Tm/℃AlogP 1OCH2CF33.05×10-20.28132.23.51 2O-i-Pr9.75×10-215132.43.30 3OCH31.04×10-155112.02.54 4O-i-Bu4.15×10-215117.63.75 5OCH(CH3)CF32.05×10-218155.93.93 6OCH2Ph8.30×10-30.25134.04.32 7CH31.765002143.91.91 8CF35.61×10-11002151.43.03 9CH2CF37.06×10-11001193.92.96 10CH2CH2CF31.64×10-151172.03.20 11CH2-p-Cl-Ph1.82×10-20.24190.54.28 12SCH2CH34.38×10-256128.53.23 13SCH2CF36.18×10-254122.13.86 14S-i-Bu3.02×10-216109.84.10 15NHCH2CF35.66×10-11001207.72.86 164-morpholinyl2.97×101＞5000171.91.79

2.4 化合物結(jié)構(gòu)和對(duì)聚酮合酶抑制活性的關(guān)系

2.4.1 A部分

對(duì)A部分進(jìn)行修飾后化合物的活性列于表2和3。如表2和圖3(b)所示疏水基團(tuán)如苯甲基(化合物6和11)的化合物對(duì)聚酮合酶具有高的抑制活性。A部分為三氟乙基的化合物(化合物1，26和28)對(duì)聚酮合酶的抑制活性要高于異丙基化合物(2，27和29)。通過比較2組化合物(7和3，9和1)發(fā)現(xiàn)氨基甲酸酯鍵化合物比酰胺鍵的對(duì)聚酮合酶的抑制活性高。引入脲鍵后化合物對(duì)聚酮合酶的抑制活性降低，如化合物15和1。比較化合物14和4，以及13和1，發(fā)現(xiàn)硫代氨基甲酸酯鍵和氨基甲酸酯鍵化合物對(duì)聚酮合酶的抑制活性相同。

2.4.2 B部分

對(duì)B部分進(jìn)行修飾后化合物的活性列于表3。R1和R2為氫原子(17)或二甲基(18)，化合物對(duì)聚酮合酶的抑制活性降低。對(duì)映體的活性大不同，-異構(gòu)體(1)是對(duì)聚酮合酶抑制活性最高的化合物之一，而-異構(gòu)體(19)沒有活性。R1為體積大的取代基如環(huán)己烷(24)和叔丁基(22)時(shí)，化合物對(duì)聚酮合酶的抑制活性高，這表明R1取代基周圍的空間位阻相當(dāng)大，然而，B部分為大的取代基時(shí)化合物的活性不會(huì)增加。親水甲基酯(25)化合物對(duì)聚酮合酶的抑制活性也高。R1為-分支的取代基比直鏈(21)或-分支取代基(23)化合物的活性高。

表3 tolprocarb衍生物(B部分)的活性和物理參數(shù)

化合物AR1R2PKS-A IC50/μMMBI-A MIC/(mg/L-1)RBC-E指數(shù)Tm/℃AlogP 1CH2CF3i-PrH3.05×10－20.28132.23.51 2i-Pri-PrH9.75×10－215132.43.30 17CH2CF3HH2.01×10－152169.32.23 18i-PrCH3CH31.395002110.02.50 19CH2CF3Hi-Pr＞1005002129.03.51 20i-PrHi-Pr＞100＞5001159.73.30 21CH2CF3n-PrH6.93×10－213170.83.51 22CH2CF3t-BuH2.82×10－20.212101.04.02 23CH2CF3t-BuH4.68×10－11001147.53.84 24CH2CF3c-HexH4.32×10－213155.04.20 25CH2CF3COOCH3H2.87×10－213139.32.12 26CH2CF3CH2SCH3H3.03×10－152153.02.58 27i-PrCH2SCH3H1.655002162.22.36 28CH2CF3CH2SOCH3H1.04×101＞5000153.71.44 29i-PrCH2SOCH3H＞100＞5000192.71.22

pMIC????????Alog

注：(a)pIC50[=log(1/IC50(mg/L))]和pMIC[=log(1/MIC(mg/L))]，tolprocarb衍生物列于表2－4，測定的線性擬合系數(shù)2=0.90；(b) pIC50[=log(1/IC50(mg/L))]，用Accelrys Draw (4.1 SP1)計(jì)算Alog。

圖3 對(duì)聚酮合酶的抑制活性與對(duì)黑色素生物合成抑制活性(a)和與Alog(b)間的關(guān)系

2.4.3 C部分

對(duì)C部分進(jìn)行修飾后化合物的活性列于表4。疏水取代基(甲基，1；乙基，31；氯代，32；三氟甲基，33)比親水取代基(甲磺?；?，35；羧基，36) 化合物對(duì)聚酮合酶的抑制活性高。相比，親水甲基酯化合物(34)是對(duì)聚酮合酶抑制活性最高的化合物之一，這表明C部分非疏水相互作用也增加化合物對(duì)聚酮合酶的抑制活性。供電子基團(tuán)(甲基，1)比吸電子基團(tuán)(三氟甲基，33)化合物對(duì)聚酮合酶的抑制活性高。

表4 tolprocarb衍生物(C部分)的活性和物理參數(shù)

3 討 論

稻瘟病菌會(huì)侵染水稻發(fā)生稻瘟病，此病是水稻的重要病害之一。在此病菌侵染的過程中，黑色素的積累對(duì)稻瘟病菌穿透侵入寄主植物很重要。黑色素生物合成抑制劑是廣泛用于防治稻瘟病的殺菌劑。然而，抑制脫水酶的傳統(tǒng)黑色素生物合成抑制劑抗性的發(fā)展已成為稻瘟病防治的一大問題。三井公司開發(fā)的tolprocarb育苗箱應(yīng)用和水稻田應(yīng)用對(duì)稻瘟病有高的防效。筆者已進(jìn)行的研究表明tolprocarb抑制聚酮合酶的活性，其IC50為0.03 μM。本文評(píng)估了一系列tolprocarb衍生物對(duì)聚酮合酶、黑色素生物合成的抑制活性和對(duì)稻瘟病的防效。研究發(fā)現(xiàn)化合物對(duì)聚酮合酶的抑制活性和對(duì)黑色素生物合成的抑制活性間存在線性關(guān)系，2=0.90。此進(jìn)一步證實(shí)tolprocarb和其衍生物抑制聚酮合酶的活性，進(jìn)而直接抑制稻瘟病菌的黑色素的生物合成。

表5 稻瘟病菌對(duì)化合物1、34和36的生物轉(zhuǎn)化(摩爾比率)

注：a不加稻瘟病菌菌絲；b沒有測定。

對(duì)稻瘟病的防效與對(duì)聚酮合酶抑制活性存在正相關(guān)性(2=0.51)，進(jìn)一步證實(shí)聚酮合酶是tolprocarb的靶標(biāo)點(diǎn)。對(duì)稻瘟病的防效指標(biāo)可用m與對(duì)聚酮合酶的抑制活性，或m與對(duì)黑色素生物合成抑制活性表示。m與溶解度有關(guān)，有較多的應(yīng)用。包括tolprocarb在內(nèi)的黑色素生物合成抑制劑不直接影響稻瘟病菌的發(fā)育，而抑制病原菌穿透寄主植物的能力。因此，稻瘟病菌能夠穿透葉子中不存在黑色素生物合成抑制劑的寄主植物，葉子上有均勻的黑色素生物合成抑制劑層可能對(duì)于保護(hù)寄主免受稻瘟病菌的侵染很重要。推測具有高m的易于結(jié)晶的化合物可能不易在植物葉子表面形成均勻的黑色素生物合成抑制劑層，因此在盆栽試驗(yàn)中藥效低。有必要進(jìn)行進(jìn)一步試驗(yàn)來驗(yàn)證以上推測，例如通過添加擴(kuò)展劑或其他助劑阻止黑色素生物合成抑制劑結(jié)晶。

C部分具有甲基酯基團(tuán)的tolprocarb衍生物，即化合物34對(duì)聚酮合酶的抑制活性與對(duì)黑色素生物合成的抑制活性之間不存在線性關(guān)系，也就是化合物34對(duì)聚酮合酶有高的抑制活性，而對(duì)黑色素生物合成沒有抑制活性，化合物34的甲基酯在稻瘟病菌菌絲中被徹底代謝為羧酸。代謝物36對(duì)聚酮合酶和黑色素生物合成都沒有抑制活性。因此，化合物34對(duì)黑色素生物合成沒有抑制活性應(yīng)該是由于稻瘟病菌解毒甲基酯為羧酸所致。而B部分為甲基酯基團(tuán)的化合物(25)對(duì)聚酮合酶和黑色素生物合成都具有高的抑制活性，這表明B部分的甲基酯代謝速率慢或其預(yù)期的代謝產(chǎn)物羧酸(B部分)也對(duì)聚酮合酶和黑色素生物合成有高的抑制活性高。此外，對(duì)聚酮合酶的抑制活性和對(duì)黑色素生物合成的抑制活性具有密切相關(guān)性，這表明本研究中的大多數(shù)tolprocarb衍生物在稻瘟病菌菌絲中沒有被顯著代謝。對(duì)聚酮合酶的抑制活性和對(duì)黑色素生物合成抑制活性的比較表明真菌代謝是設(shè)計(jì)新穎殺菌劑的一個(gè)重要因素。

化合物被活體運(yùn)輸?shù)男阅芤话阋詌og表示。如果用全細(xì)胞進(jìn)行對(duì)黑色素生物合成抑制的生測試驗(yàn)，會(huì)受到活體運(yùn)輸?shù)挠绊?，而?duì)聚酮合酶的活性進(jìn)行無細(xì)胞測定可能不受此影響。因此，本研究中發(fā)現(xiàn)的疏水性(Alog)與對(duì)聚酮合酶的抑制活性間的線性關(guān)系可能在存在活體運(yùn)輸影響的試驗(yàn)中并不如此。此外，對(duì)聚酮合酶的抑制活性與對(duì)黑色素生物合成抑制活性間強(qiáng)的相關(guān)性表明對(duì)黑色素生物合成抑制活性不受活體運(yùn)輸?shù)挠绊憽?/p>

總的來說，對(duì)聚酮合酶的抑制活性與對(duì)黑色素生物合成抑制活性間具有的強(qiáng)的相關(guān)性證實(shí)tolprocarb在稻瘟病菌體內(nèi)的靶標(biāo)點(diǎn)為聚酮合酶。比較靶標(biāo)點(diǎn)和離體和活體活性，能發(fā)現(xiàn)化合物的代謝和物理參數(shù)對(duì)其活性的影響，這對(duì)于設(shè)計(jì)新穎殺菌劑具有一定的價(jià)值。此外，構(gòu)效關(guān)系和活性-活性關(guān)系會(huì)為新穎聚酮合酶抑制劑的開發(fā)結(jié)構(gòu)要求提供靈感和信息。

10.16201/j.cnki.cn31-1827/tq.2017.04.05

TQ450

A

1009-6485(2017)04-0027-05

侯文君，女，工程師，碩士。Tel: 021-64387891-201。

2017-07-31。