慢性應(yīng)激所致抑郁大鼠Treg細(xì)胞和Th17細(xì)胞表達(dá)水平的變化*

谷世娜， 趙 琳， 任慧聰， 張 一， 李文強(qiáng)， 宋景貴， 張朝輝

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院, 河南 新鄉(xiāng)453002)

慢性應(yīng)激所致抑郁大鼠Treg細(xì)胞和Th17細(xì)胞表達(dá)水平的變化*

谷世娜， 趙 琳， 任慧聰， 張 一， 李文強(qiáng)， 宋景貴， 張朝輝△

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院, 河南 新鄉(xiāng)453002)

目的了解慢性應(yīng)激所致抑郁大鼠外周血Treg細(xì)胞和Th17細(xì)胞比例的變化。方法篩選16只同質(zhì)性均一的健康成年雄性SD大鼠，按照隨機(jī)數(shù)字表法分為正常對(duì)照組和模型組(n=8)。正常對(duì)照組不給予任何干預(yù)處理，模型組采用慢性不可預(yù)知溫和刺激(CUMS)和孤養(yǎng)法來(lái)制備抑郁模型。在造模的第7天、14天、21天運(yùn)用蔗糖水偏好實(shí)驗(yàn)、曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)和體重變化率進(jìn)行行為學(xué)評(píng)估，采用流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測(cè)兩組大鼠外周血Treg細(xì)胞與Th17細(xì)胞比例的變化。結(jié)果與正常組相比，應(yīng)激第7天，抑郁組體重變化率及曠場(chǎng)評(píng)估結(jié)果無(wú)明顯差異，應(yīng)激第14天、21天，抑郁組體重變化率及曠場(chǎng)各項(xiàng)結(jié)果明顯低于正常組(P<0.05，P<0.01)。應(yīng)激第7天、14天，抑郁組蔗糖水偏好指數(shù)較正常組無(wú)明顯差異；應(yīng)激第21天，抑郁組蔗糖水偏好指數(shù)明顯低于正常組(P<0.01)。應(yīng)激第7天、14天，抑郁組Treg細(xì)胞水平與正常組比較無(wú)明顯差異，應(yīng)激第21天，抑郁組Treg細(xì)胞水平顯著低于正常組(P<0.01)。應(yīng)激第7天、14天、21天兩組Th17細(xì)胞水平無(wú)顯著差異。結(jié)論慢性應(yīng)激所致抑郁大鼠的Treg細(xì)胞水平降低，可能影響機(jī)體的免疫功能。

抑郁癥；Treg細(xì)胞；Th17細(xì)胞

depression; regulatory T cells; T helper 17 cells

有證據(jù)表明免疫系統(tǒng)紊亂在抑郁癥的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用[1]。研究發(fā)現(xiàn)T細(xì)胞亞群與抑郁癥的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系[2]。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cells, Treg)和輔助性T細(xì)胞17型(T helper 17 cells, Th17)是CD4+T細(xì)胞的亞群，但作用截然不同。Treg細(xì)胞具有免疫抑制作用，參與免疫應(yīng)答或免疫抑制的調(diào)控[3]；Th17細(xì)胞參與多種炎癥性、自身免疫性疾病，并促進(jìn)小鼠的抑郁樣行為[4]。研究發(fā)現(xiàn)抑郁癥患者存在Treg細(xì)胞和Th17細(xì)胞的失衡，但在抑郁形成的過(guò)程中兩者水平的變化及與抑郁樣行為的關(guān)系并未明確。因此，本研究通過(guò)觀察慢性應(yīng)激所致大鼠抑郁形成的過(guò)程中Treg細(xì)胞和Th17細(xì)胞水平的變化來(lái)探討抑郁癥的可能病理機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)儀器和試劑

曠場(chǎng)箱(100 cm×100 cm×40 cm)；Smart Version2.5.16軌跡圖像分析系統(tǒng)；APC/Cy7 anti-rat CD4(BioLegend)；FITC anti-rat CD25(BioLegend)；APC anti-rat CD3(BioLegend)；PE mouse/rat Foxp3(Ebioscience)；

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

動(dòng)物采用SPF級(jí)SD大鼠32只，雄性，體重(200.0±10.0)g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司供給，許可證號(hào)：SCXK(京)2012-0001，質(zhì)量合格證號(hào)：11400700139252。實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性喂養(yǎng)2周，飼養(yǎng)環(huán)境：溫度(22±2)℃，濕度55%～56%，標(biāo)準(zhǔn)光照條件(7: 00-19: 00)，每籠4只。給予自由飲水和攝食，飼養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)環(huán)境保持安靜清潔。

首先進(jìn)行蔗糖水偏好實(shí)驗(yàn)和開(kāi)放曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)并進(jìn)行行為學(xué)評(píng)分[5]。從中篩選出得分均一的大鼠16只，將大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和模型組(n=8)。模型組采用孤籠結(jié)合，每天給予1種刺激，總周期21 d。對(duì)照組保持在正常飼養(yǎng)條件下，每籠4只，不遭受任何刺激。每周進(jìn)行1次行為學(xué)評(píng)估和眼眶取血。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 抑郁模型制備方法 依據(jù)Willner等人[6]模型制備方法，運(yùn)用孤養(yǎng)結(jié)合CUMS，具體包括：禁食24 h、禁水24 h、晝夜顛倒24 h(光照交替開(kāi)關(guān)/3 h)、間歇性白噪音(80 dB)1 h、束縛2 h、4℃冰水游泳5 min、夾尾2 min共7種刺激，7種刺激每周隨機(jī)出現(xiàn)，為使動(dòng)物不可預(yù)知同一種刺激不可連續(xù)出現(xiàn)。

1.3.2 眼眶靜脈叢采血 使用乙醚將大鼠麻醉后，左手拇食兩指從背部較緊地握住大鼠頸部(大鼠采血帶上紗布手套，防止動(dòng)物窒息)。取血時(shí)輕輕壓迫動(dòng)物的頸部?jī)蓚?cè)，使眶后靜脈叢充血。右手持毛細(xì)管，使毛細(xì)管與鼠面成45°夾角，由眼內(nèi)角刺入，針頭斜面指向眼球，刺入后再轉(zhuǎn)180°使斜面對(duì)著眼眶后緣。刺入深度約4～5 mm，遇阻則止，同時(shí)將毛細(xì)管退出約0.1～0.5 mm，穿刺適當(dāng)則血液能自然流入毛細(xì)管中，待得到所需血量即可去除頸部壓力，同時(shí)將采血器拔出，用無(wú)菌棉球壓迫止血。

1.4 觀測(cè)指標(biāo)及方法：

1.4.1 體重測(cè)量 采用體重變化評(píng)估大鼠的抑郁程度[5]。對(duì)兩組大鼠進(jìn)行體重測(cè)量，按照公式(1)評(píng)估大鼠體重變化趨勢(shì)。

(1)

1.4.2 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn) 采用曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)大鼠的探索及焦慮樣行為[5]。觀察時(shí)間為5 min，評(píng)估指標(biāo)包括水平運(yùn)動(dòng)距離、垂直直立次數(shù)、修飾次數(shù)(修飾臉、舔或搔抓身體多個(gè)部位的次數(shù))。

1.4.3 蔗糖偏好實(shí)驗(yàn)采用蔗糖水偏好實(shí)驗(yàn)評(píng)估大鼠的快感缺失程度[7]。按公式(2)測(cè)定兩組大鼠蔗糖偏好指數(shù)。

(2)

1.4.4 Treg細(xì)胞與Th17細(xì)胞的檢測(cè)：根據(jù)文獻(xiàn)測(cè)定結(jié)果為CD3+CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的比例與CD3+CD4+IL-17+Th17細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的比例[8]。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 體重增長(zhǎng)率

應(yīng)激第7天，與正常組相比，抑郁組大鼠體重變化無(wú)明顯差異，應(yīng)激第14天和第21天，抑郁組體重增長(zhǎng)率較正常組顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，表1)。

Tab. 1 Weight measurement(%, ±s, n=8)

**P<0.01vscontrol group

2.2 蔗糖偏好指數(shù)

應(yīng)激前及應(yīng)激第7天、14天，兩組大鼠蔗糖偏好指數(shù)無(wú)顯著差異，應(yīng)激21天，抑郁組大鼠蔗糖偏好指數(shù)顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，表2)。

Tab. 2 Sucrosepreference(%, ±s, n=8)

**P<0.01vscontrol group

2.3 曠場(chǎng)評(píng)估結(jié)果

應(yīng)激前及應(yīng)激第7天，與正常組相比，抑郁組大鼠水平運(yùn)動(dòng)距離和直立次數(shù)比較無(wú)明顯差異，應(yīng)激第14天、第21天，抑郁組水平運(yùn)動(dòng)距離和垂直直立次數(shù)較正常組顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，表3、表4)。

Tab. 3 Horizontal movement (cm/5 min, ±s, n=8)

**P<0.01vscontrol group

Tab. 4 Vertical movement (n/5 min, ±s, n=8)

**P<0.01vscontrol group

2.4 大鼠外周血中Treg細(xì)胞比例結(jié)果

應(yīng)激前及應(yīng)激第7天、14天，兩組大鼠外周血Treg細(xì)胞比例無(wú)顯著差異；應(yīng)激第21天，抑郁組大鼠外周血Treg細(xì)胞比例較正常組顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表5、圖1)。

Tab. 5 Treg proportion(%, ±s, n=8)

*P<0.05vscontrol group

2.5 大鼠外周血中Th17細(xì)胞比例結(jié)果

應(yīng)激前及應(yīng)激第7天、14天、21天，兩組大鼠外周血Th17細(xì)胞比例無(wú)顯著差異(表6、圖2)。

Tab. 6 Th17 Proportion(%, ±s, n=8)

Fig.1Treg proportion during theprogression of CUMS (Control group: A、C、E、H; Depression group: B、D、F、I). On day 0、day 7、day 14、day 21 of being given CUMS(A、B; C、D; E、F;H、I respectively)

Fig.2Th17 proportion during the progression of CUMS(Control group: J、L、N、P； Depression group: K、M、O、Q). On day 0、day 7、day 14、day 21 of being given CUMS(J、K; L、M; N O;P、Q respectively)

3 討論

抑郁癥的發(fā)病機(jī)制目前尚未明確，許多研究表明抑郁癥存在免疫抑制與免疫激活[2, 3, 9]。研究發(fā)現(xiàn)抑郁患者常表現(xiàn)為獲得性免疫應(yīng)答受損，尤其是T細(xì)胞應(yīng)答。抑郁和壓力會(huì)激活神經(jīng)內(nèi)分泌和炎癥途徑，繼而導(dǎo)致T細(xì)胞功能障礙。與之相反的是，T細(xì)胞亞群包括自身反應(yīng)性T細(xì)胞和Treg細(xì)胞可通過(guò)與中樞神經(jīng)系統(tǒng)特異性抗原的免疫反應(yīng)來(lái)逆轉(zhuǎn)應(yīng)激所引起的海馬神經(jīng)再生減少以及嚙齒類動(dòng)物的抑郁樣行為[10]。因此T細(xì)胞在抑郁癥的發(fā)生發(fā)展和恢復(fù)過(guò)程中發(fā)揮重要作用[2]。

Treg細(xì)胞主要表達(dá)CD4、CD25以及特異性核轉(zhuǎn)錄因子FoxP3。Treg細(xì)胞是一種負(fù)性免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞，通過(guò)分泌一些抑制性細(xì)胞因子，例如IL-10，TGF-β1等而發(fā)揮其免疫抑制功能[11]。本項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)與正常組相比，在給予CUMS的第21天，模型組大鼠的各項(xiàng)行為學(xué)評(píng)分均較正常組顯著減少，同時(shí)模型組大鼠的Treg細(xì)胞比例明顯降低。結(jié)果表明Treg細(xì)胞水平變化可能與抑郁的病理過(guò)程有關(guān)。這與以往研究相符[7, 10, 12]。除此之外，研究發(fā)現(xiàn)抑郁癥Treg細(xì)胞的Foxp3表達(dá)減少，提示抑郁癥存在Treg細(xì)胞的水平及功能的減退。Treg細(xì)胞參與抑郁病理變化的可能機(jī)制是多巴胺(DA)可以通過(guò)作用于D1、D5受體抑制細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶ERK1/2信號(hào)通路, 進(jìn)而抑制Treg細(xì)胞的遷徙和粘附[13]；余慶皋等人發(fā)現(xiàn)抑郁癥中5-HT、DA可能通過(guò)5-HT1a受體, D3受體直接或間接影響Treg上 Foxp3 mRNA的表達(dá), 從而導(dǎo)致免疫激活[14]。因此對(duì)于慢性刺激所致抑郁的大鼠在給予常用的抗抑郁劑治療同時(shí)，進(jìn)行與Treg相關(guān)的免疫干預(yù)將有助于提高治療效果。

研究發(fā)現(xiàn)Th17細(xì)胞通過(guò)分泌炎癥因子IL-17、IL-23在多種炎癥性和自身免疫性疾病的發(fā)病機(jī)制中起到主要作用[15]。許多臨床研究及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)抑郁常伴有外周血促炎因子TNF-α、IL-6的升高，而IL-6、IL-23能夠促進(jìn)Th17的產(chǎn)生。對(duì)長(zhǎng)期處于應(yīng)激狀態(tài)的小鼠模型進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)呈糖皮質(zhì)激素抵抗的小鼠IL-17等炎性因子分泌上調(diào)，提示下丘腦-垂體-腎上腺軸的調(diào)節(jié)異常與Th17細(xì)胞的活化及炎癥的發(fā)展密切相關(guān)[16]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在給予慢性刺激的第7天，14天及21天，與正常組相比，模型組大鼠Th17水平無(wú)顯著的變化，這與以往研究不一致[4、7、17]?？赡茉蚴荰GF-β是調(diào)控Treg/Th17失衡的主要因素，TGF-β介導(dǎo)初始CD4+T細(xì)胞分化為T(mén)h17細(xì)胞或者Treg細(xì)胞，但Th17細(xì)胞分化與Treg細(xì)胞誘導(dǎo)存在相互排斥的關(guān)系。當(dāng)有較低濃度的TGF-β存在時(shí)，TGF-β與IL-6、IL-21共同作用促進(jìn)IL-23受體(IL-23r)表達(dá)來(lái)誘導(dǎo)Th17分化；而高濃度的TGF-β則會(huì)抑制IL-23r的表達(dá)，從而支持Treg細(xì)胞的Foxp3+表達(dá)[18]。因此根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果推測(cè)抑郁模型大鼠的TGF-β濃度呈現(xiàn)高濃度變化進(jìn)而出現(xiàn)了上述的結(jié)果。

綜上所述，慢性應(yīng)激所致抑郁大鼠的Treg細(xì)胞水平降低，而Th17細(xì)胞水平無(wú)明顯變化，提示Treg細(xì)胞可能影響機(jī)體的免疫功能，而影響免疫功能的因素是多方面的。

[1] Hoeck AD. Review: Vitamin D3 deficiency results in dysfunctions of immunity with severe fatigue and depression in a variety of diseases[J].InVivo, 2014, 28(1): 133-145.

[2] Toben C, Baune BT. An act of balance between adaptive and maladaptive immunity in depression: pression: a role for T lymphocytes[J].JNeuroimmunePharmacol, 2015, 10(4): 595-609.

[3] Kim SJ, Lee H, Lee G,etal. CD4+ CD25+ regulatory T cell depletion modulates anxiety and depression-like behaviors in mice[J].PLoSOne, 2012, 7(7): e42054.

[4] Beurel E, Harrington LE, Jope RS. Inflammatory T helper 17 cells promote depression-like behavior in mice[J].Biolpsychiatry, 2013, 73(7): 622-630.

[5] 任慧聰, 谷世娜, 趙 琳, 等. 重復(fù)經(jīng)顱磁刺激對(duì)抑郁模型大鼠行為學(xué)及海馬區(qū)糖皮質(zhì)激素受體表達(dá)的影響[J]. 中國(guó)神經(jīng)精神疾病雜志, 2016, 42(7): 420-425.

[6] Willner P, Towell A, Sampson D,etal. Reduction of sucrose preference by chronic unpredictable mild stress, and its restoration by a tricyclic antidepressant[J].Psychopharmacol(Berl), 1987, 93(3): 358-364.

[7] Hong M, Zheng J, Ding Z,etal. Imbalance between Th17 and Treg cells may play an important role in the development of chronic unpredictable mild stress-induced depression in mice[J].Neuroimmunomodulation, 2012, 20(1): 39-50.

[8] McGeachy MJ, Chen Y, Tato CM,etal. The interleukin 23 receptor is essential for the terminal differentiation of interleukin 17 producing effector T helper cellsinvivo[J].NatImmunol, 2009, 10(3): 314-324.

[9] Blume J, Douglas SD, Evans DL. Immune suppression and immune activation in depression[J].BrainBehavImmun, 2011, 25(2): 221-229.

[10]Miller AH. Depression and immunity: a role for T cells[J].BrainBehavImmun, 2010, 24(1): 1-8.

[11]Siqueira-Batista R, Gomes AP, Azevedo SFM,etal. CD4+ CD25+ T lymphocytes and regulation of the immune system: perspectives for a pathophysiological understanding of sepsis[J].RevBrasTerintensiva, 2012, 24(3): 294-301.

[12]Ronaldson A, Gazali AM, Zalli A,etal. Increased percentages of regulatory T cells are associated with inflammatory and neuroendocrine responses to acute psychological stress and poorer health status in older men and women[J].Psychopharmacology(Berl), 2016, 233(9): 1661-1668.

[13]Kipnis J, Cardon M, Avidan H,etal. Dopamine, through the extracellular signal-regulated kinase pathway, downregulates CD4+ CD25+ regulatory T-cell activity: implications for neurodegeneration[J].JNeurosci, 2004, 24(27): 6133-6143.

[14]余慶皋, 楊 歡, 楊 樂(lè), 等. 抑郁癥中Foxp3的變化及其與神經(jīng)遞質(zhì)的關(guān)系[J]. 神經(jīng)疾病與精神衛(wèi)生, 2008, 8(5): 341-344.

[15]Rostami A, Ciric B. Role of Th17 cells in the pathogenesis of CNS inflammatory demyelination[J].JNeurolSci, 2013, 333(1): 76-87.

[16]Schmidt D, Reber SO, Botteron C,etal. Chronic psychosocial stress promotes systemic immune activation and the development of inflammatory Th cell responses [J].BrainBehavImmun, 2010, 24(7): 1097-1104.

[17]Slyepchenko A, Maes M, K?hler CA.,etal. T helper 17 cells may drive neuroprogression in major depressive disorder: proposal of an integrative model[J].NeurosciBiobehavRev, 2016, 64: 83-100.

[18]Zhon L, Lopes JE, Chong MM. TGF-beta-induced Foxp3 inhibits Thl7 cell differentiation by antagonizing ROR gammatfunc-tionEJ[J].Nature, 2008, 453: 236-240.

R749

A

1000-6834(2017)04-315-04

國(guó)家自然科學(xué)基金(81471349)；河南省科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目(162102310489);新鄉(xiāng)市科技局重點(diǎn)科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目(ZG15019)；河南省高等學(xué)校重點(diǎn)科研項(xiàng)目計(jì)劃(16A320044)；2015年研究生科研創(chuàng)新支持計(jì)劃資助項(xiàng)目(YJSCX201520Y)

2016-12-10

2017-02-19

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