老年與青年小鼠慢性應(yīng)激后抑郁樣行為的觀察*

江 巖， 李 亞

(1. 曲阜師范大學(xué)醫(yī)院， 2. 曲阜師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 山東 曲阜 273165)

老年與青年小鼠慢性應(yīng)激后抑郁樣行為的觀察*

江 巖1， 李 亞2△

(1. 曲阜師范大學(xué)醫(yī)院， 2. 曲阜師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 山東 曲阜 273165)

目的探討慢性應(yīng)激后不同月齡小鼠抑郁樣行為的變化，以及海馬和前腦皮層胰島素樣神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子-II (IGF-II)的作用。方法昆明品系小白鼠3月齡(青年)和14月齡(老年)，隨機(jī)分為青年對(duì)照組和青年應(yīng)激組、老年對(duì)照組和老年應(yīng)激組，每組12只、雌雄各半。多因素慢性應(yīng)激21 d，建立抑郁小鼠模型。采用懸尾實(shí)驗(yàn)和蔗糖偏好實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)小鼠的抑郁樣行為；并且檢測(cè)小鼠海馬和前腦皮層IGF-Ⅱ的表達(dá)水平。結(jié)果與青年對(duì)照組相比，老年對(duì)照組小鼠的累積不動(dòng)時(shí)間明顯增多(P<0.05)，蔗糖消耗度明顯降低(P<0.05)，并且IGF-II陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)目在海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)、齒狀回(DG)和前腦皮層均明顯減少(P<0.01 或P<0.05)；慢性應(yīng)激后，青年應(yīng)激組小鼠的第一次靜止不動(dòng)時(shí)間、累積不動(dòng)時(shí)間和蔗糖消耗度與其對(duì)照組比較均有顯著性差異(P均<0.01)，IGF-II陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)目在CA1、DG和前腦皮層均顯著減少(P<0.05 或P<0.01)；與老年對(duì)照組比較，老年應(yīng)激組小鼠的第一次靜止不動(dòng)時(shí)間明顯減少(P<0.05)、累積不動(dòng)時(shí)間顯著增加(P<0.05)和蔗糖消耗度明顯減少(P<0.05)，海馬CA1、CA3和DG區(qū)IGF-II陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)目均顯著減少(P<0.05 或P<0.01)。結(jié)論慢性應(yīng)激后小鼠的抑郁樣行為可能與海馬和前腦皮層IGF-II表達(dá)的下調(diào)密切相關(guān)。

慢性應(yīng)激；抑郁；小鼠；胰島素樣神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子-II；海馬；前腦皮層

chronic stress; depression; mice; IGF-II; hippocampus; PFC.

抑郁癥(depression)是一種常見的精神障礙性疾病，以情緒低落、行為絕望、焦慮不安以及認(rèn)知功能損傷等為主要癥狀表現(xiàn)[1]，它與各類生活事件及環(huán)境應(yīng)激事件相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，在長(zhǎng)期的慢性應(yīng)激狀態(tài)下，可引起前額葉皮層和海馬的選擇性損傷，從而導(dǎo)致動(dòng)物出現(xiàn)癡呆、抑郁以及學(xué)習(xí)記憶障礙等[2]。胰島素樣神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子-II(insulin-like growth factor-II，IGF-II)是神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子家族中的重要成員。IGF-II能夠促進(jìn)腦內(nèi)多種類型神經(jīng)元的增殖、存活和分化，減少細(xì)胞的程序性死亡[3]。有研究報(bào)道，IGF-II在幼年和成年的大腦中均有表達(dá)[4]，并且是IGF家族中表達(dá)量最多的一種生長(zhǎng)因子，特別是在腦內(nèi)海馬區(qū)的濃度水平最高。慢性應(yīng)激后，不同年齡小鼠腦內(nèi)IGF-II的表達(dá)如何變化，IGF-II的表達(dá)與應(yīng)激所致的損傷是否有關(guān)及可能的機(jī)制，目前尚不清楚。已經(jīng)明確，海馬和前額葉皮層是行為調(diào)控、情緒、內(nèi)分泌以及學(xué)習(xí)記憶等重要區(qū)域，也是大腦參與調(diào)控應(yīng)激反應(yīng)的主要區(qū)域，在抑郁的病因?qū)W研究和抗抑郁治療中具有重要作用。因此，本研究通過(guò)懸尾實(shí)驗(yàn)和蔗糖偏好實(shí)驗(yàn)，觀察慢性應(yīng)激后青年和老年小鼠抑郁樣行為的變化，并且測(cè)定IGF-II在小鼠海馬和前腦皮層的表達(dá)，探討IGF-II在慢性應(yīng)激所致小鼠抑郁樣行為變化中的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和慢性應(yīng)激抑郁小鼠模型的建立

昆明品系小白鼠3月齡(青年)和14月齡(老年)，清潔級(jí)，雌雄各半，由山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。不同年齡段小鼠按體重隨機(jī)分為兩組(n=12)：對(duì)照組和應(yīng)激組。多因素慢性應(yīng)激源采用：足底電擊(底部鋪有銅柵的刺激器，電壓33 V，每次刺激持續(xù)10 s，累計(jì)刺激時(shí)間3 min)、高臺(tái)(1 h/d，高1.6 m)、冷水刺激(6℃冷水游泳3 min)、斜籠飼養(yǎng)(24 h)、束縛+熱刺激(1 h/d，30℃)。應(yīng)激時(shí)程21 d，每天隨機(jī)選擇一種應(yīng)激源對(duì)小鼠進(jìn)行應(yīng)激。對(duì)照組小鼠不接受慢性應(yīng)激源刺激。

1.2 行為學(xué)檢測(cè)

慢性應(yīng)激21 d后，對(duì)各組小鼠進(jìn)行行為學(xué)檢測(cè)。

1.2.1 懸尾實(shí)驗(yàn)(tail suspension test) 在檢測(cè)箱中將小鼠尾端2 cm處固定，并懸掛于支架上，頭部離箱底10 cm。觀察記錄6 min內(nèi)：小鼠從懸掛開始到第一次靜止不動(dòng)時(shí)間(不動(dòng)潛伏期，latency immobility)和后4 min內(nèi)小鼠的累計(jì)不動(dòng)時(shí)間(immobility time)。判定靜止不動(dòng)的標(biāo)準(zhǔn)：小鼠停止掙扎，身體倒懸呈垂直狀態(tài)，靜止不動(dòng)。

1.2.2 蔗糖消耗實(shí)驗(yàn)(sucrose preference test) 各組小鼠已禁水10 h 但不禁食，同時(shí)給予2%蔗糖水和純水各一瓶，7 h 后調(diào)換蔗糖水和純水的位置，14 h 后取走兩瓶并稱重。計(jì)算動(dòng)物的蔗糖消耗度：蔗糖消耗度(%)= 蔗糖水消耗量/[蔗糖水消耗量(g)+純水消耗量(g)]×100%。

1.3 小鼠海馬和前腦皮層IGF-II的表達(dá)

行為學(xué)檢測(cè)結(jié)束后，進(jìn)行小鼠海馬和前腦皮層IGF-Ⅱ的表達(dá)水平檢測(cè)。小鼠腹腔注射0.4%的戊巴比妥鈉麻醉，暴露心臟，經(jīng)心先灌注生理鹽水，再以事先冰上預(yù)冷的多聚甲醛溶液(4%)灌注，完整取腦；置于固定液中后固定，梯度酒精脫水、透明和石蠟包埋，對(duì)腦組織進(jìn)行連續(xù)冠狀切片(片厚5 μm)。采用SABC(鏈霉素過(guò)氧化復(fù)合物)免疫組織化學(xué)試劑盒，DAB顯色劑進(jìn)行免疫組化染色，兔抗小鼠IGF-II多克隆抗體(編號(hào)BA0941)，購(gòu)于武漢博士德生物工程有限公司。以PBS(磷酸鹽緩沖液)代替一抗作陰性對(duì)照。每只小鼠選擇切片4張，顯微鏡下觀察海馬CA1、CA3區(qū)、齒狀回(dangerous cargo, DG)和前額葉皮層(prefrontal cortex, PFC)各區(qū)IGF- II的分布，顯微拍照(×400)。采用Motic Images Advanced 3.2圖像分析處理系統(tǒng)，分析計(jì)算IGF-Ⅱ陽(yáng)性神經(jīng)元的數(shù)目。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠的行為學(xué)檢測(cè)

懸尾實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示(表1)：與青年對(duì)照組小鼠比較，老年對(duì)照組小鼠的累計(jì)不動(dòng)時(shí)間明顯增多(P<0.05)。慢性應(yīng)激21 d后，與青年對(duì)照組比較，青年應(yīng)激組小鼠的第一次靜止不動(dòng)時(shí)間顯著減少(P<0.01)和累計(jì)不動(dòng)時(shí)間顯著增加(P<0.01)；與老年對(duì)照組小鼠比較，老年應(yīng)激組小鼠的第一次靜止不動(dòng)時(shí)間明顯減少(P<0.05)和累計(jì)不動(dòng)時(shí)間均顯著增加(P<0.05)。結(jié)果表明，慢性應(yīng)激可引起青年和老年小鼠的行為絕望程度增加；而老年小鼠行為絕望程度變化稍弱。

蔗糖消耗度的變化顯示：與青年對(duì)照組小鼠比較，老年對(duì)照組小鼠的蔗糖消耗度明顯降低(P<0.05)。慢性應(yīng)激后，青年應(yīng)激組小鼠的蔗糖消耗度與青年對(duì)照組小鼠比較顯著降低(P<0.01)；與老年對(duì)照組小鼠比較，老年應(yīng)激組小鼠的蔗糖消耗度亦明顯降低(P<0.05)。結(jié)果表明，慢性應(yīng)激可引起小鼠蔗糖偏好程度降低、快感缺失明顯。

Tab. 1 The changes of behaviors in different ages mice(±s)

*P<0.05,**P<0.01vscontrol;#P<0.05vsyoung control

2.2 各組小鼠腦內(nèi)IGF-II的表達(dá)

統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，與青年對(duì)照組比較(表 2)，老年對(duì)照組小鼠在海馬CA1、CA3、 DG和PFC各區(qū)的IGF-II陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)顯著減少(P<0.01 或P<0.05)。慢性應(yīng)激后，與各自的對(duì)照組小鼠比較，青年應(yīng)激組小鼠海馬CA1、DG區(qū)和PFC的IGF-II陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)明顯減少(P<0.01或P<0.05)；老年應(yīng)激組小鼠在海馬CA1、CA3和DG區(qū)的IGF-II陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)亦顯著減少(P<0.01 或P<0.05)。

Tab. 2 The numbers of IGF-II positive neurons in different ages mice brain(±s)

DG: Dangerous cargo; PFC: Prefrontal cortex

*P<0.05,**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsyoung control

3 討論

有研究報(bào)道，過(guò)強(qiáng)或長(zhǎng)期的慢性應(yīng)激，可引起機(jī)體的功能紊亂，從而導(dǎo)致某些疾病的產(chǎn)生[5]。多因素慢性應(yīng)激可使海馬神經(jīng)元樹突和軸突的生長(zhǎng)出現(xiàn)異常[6]，進(jìn)而影響突觸傳遞效能，導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶功能障礙并且出現(xiàn)快感缺乏、絕望等抑郁樣行為[7]。前額葉皮層在行為調(diào)控、工作記憶等高級(jí)功能中具有關(guān)鍵性作用；不同的應(yīng)激刺激，亦可引起前額葉皮層功能損傷[8]。在本研究中，給予慢性應(yīng)激后，青年和老年小鼠表現(xiàn)出行為絕望、快感缺失等明顯的抑郁樣行為。多因素慢性應(yīng)激是一種常見的建立抑郁動(dòng)物模型的方法，通過(guò)懸尾實(shí)驗(yàn)和蔗糖偏好實(shí)驗(yàn)可以有效的評(píng)價(jià)小鼠的抑郁樣行為表現(xiàn)。本實(shí)驗(yàn)室早先的研究顯示，給予小鼠應(yīng)激刺激21 d后，小鼠在開場(chǎng)環(huán)境中的緊張焦慮程度、運(yùn)動(dòng)能力和探究行為都出現(xiàn)明顯改變，并且其空間學(xué)習(xí)記憶能力顯著降低[9]。

IGF-II屬于胰島素多肽超家族中的重要成員。研究發(fā)現(xiàn)，IGF-II及其受體，以及IGF結(jié)合蛋白在嚙齒類動(dòng)物大腦的主要發(fā)育時(shí)期都有豐富表達(dá)；在幼年和成年的動(dòng)物腦內(nèi)，IGF-II的表達(dá)表現(xiàn)為隨年齡的增高而降低[4]，具有增齡性變化，推測(cè)IGF-II可能影響神經(jīng)元的生長(zhǎng)發(fā)育以及腦的老化過(guò)程。IGF-II的水平從12月齡大鼠起出現(xiàn)顯著下降，到24月齡大鼠(老年)時(shí)趨于穩(wěn)定；在成年動(dòng)物大腦中，IGF-II有廣泛的表達(dá)，其中在海馬區(qū)的濃度最高；通過(guò)增加海馬IGF-II的表達(dá)，亦可產(chǎn)生明顯的抗抑郁效應(yīng)[10]。近年的研究報(bào)道，慢性限制性應(yīng)激可減少大鼠海馬IGF2的表達(dá)水平，而在海馬過(guò)表達(dá)IGF2則可減輕大鼠的抑郁樣行為[11]。而前額葉皮層IGFs家族(包括IGF-II)基因的表達(dá)，可能參與皮層神經(jīng)元的保護(hù)作用[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，慢性應(yīng)激后，青年和老年小鼠海馬和前腦皮層IGF-II陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)目均減少，說(shuō)明海馬各區(qū)和前腦皮層IGF-II的表達(dá)降低。因此，本研究結(jié)果提示，慢性應(yīng)激后小鼠的抑郁樣行為可能與海馬和前腦皮層IGF-II表達(dá)的下調(diào)密切相關(guān)。

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R338

A

1000-6834(2017)04-313-03

山東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(ZR2009DL009)

2016-08-02

2017-05-17

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10.12047/j.cjap.5485.2017.076