β片層阻斷肽H102對雙轉基因AD小鼠海馬腦區(qū)APP代謝酶的影響*

蔣 方， 孫鳳仙， 徐淑梅

(天津醫(yī)科大學生理學教研室， 天津 300070)

β片層阻斷肽H102對雙轉基因AD小鼠海馬腦區(qū)APP代謝酶的影響*

蔣 方， 孫鳳仙， 徐淑梅△

(天津醫(yī)科大學生理學教研室， 天津 300070)

目的探討β片層阻斷肽H102對APP/PS1雙轉基因小鼠(AD小鼠)海馬腦區(qū)β淀粉樣蛋白前體蛋白(APP)代謝分泌酶以及學習記憶能力的影響。方法將6月齡大小的30只AD模型小鼠隨機分為AD組和H102組，相同月齡、數量和背景的C57BL/6J小鼠作為對照組(n=15)。H102組每日經鼻腔給予H102溶液(5.8 mg/kg) 5 μl，對照組及AD組每日給予輔料溶液5 μl。給藥30 d后，使用Morris水迷宮的方法檢測各組小鼠的空間記憶能力變化，采用免疫組織化學方法及Western blot技術測定海馬腦區(qū)α分泌酶(ADAM10和ADAM17)、 β分泌酶(BACE1)及γ分泌酶(PS1， APH1a， PEN2)在小鼠海馬中的表達。結果與對照組比較，AD組小鼠海馬腦區(qū)BACE1、PS1、PEN-2、APH1-a蛋白表達顯著升高，ADAM10、ADAM17蛋白表達顯著降低(P<0.05)；與模型組相比，H102能夠明顯提高AD小鼠的空間學習記憶能力，明顯降低海馬腦區(qū)BACE1、PS1、PEN-2、APH1-a蛋白的表達，明顯提高ADAM10、ADAM17蛋白的表達(P<0.05)。結論β片層阻斷肽H102能夠減少海馬腦區(qū)Aβ的生成，提高海馬腦區(qū)α分泌酶的活性，降低β和γ分泌酶的活性，改善AD小鼠的學習記憶能力。

H102；APP；α分泌酶； β分泌酶； γ分泌酶； 阿爾茨海默?。?APP/PS1雙轉基因小鼠

阿爾茨海默病(alzheimer’s disease, AD)是一種破壞性的疾病， 多發(fā)生于老年人。關于AD的發(fā)病機制有很多，其中β淀粉樣蛋白的生成和沉積是影響AD發(fā)病的核心，這一說法是被大家廣泛認可的，因此，防止Aβ的形成和聚集成為治療AD的關鍵[1]。Aβ二級結構中的β折疊及自由卷曲是影響 Aβ聚集

和纖維形成的重要因素。根據Aβ的結構及性質，本課題組研究并設計出專門針對Aβ的治療老年癡呆的新型候選藥物，即β片層阻斷肽H102，前期研究表明能與Aβ1-42特異結合，穩(wěn)定其正?？臻g結構，抑制其形成β折疊，阻止可溶性β淀粉樣蛋白寡聚體和β淀粉樣蛋白斑塊形成，減少AD模型小鼠腦內Aβ的含量，降低Aβ的神經毒性[2]。Aβ是由β淀粉樣蛋白前體蛋白(β-amyloid precursor protein，APP)首先經過β-secretase再通過γ-secretase裂解而產生的，而APP還可以通過α-secretase途徑不產生Aβ[3，4]。有研究表明這兩條途徑存在競爭關系[5]。因此減少或抑制Aβ的形成可以有3條途徑：(1)α-分泌酶激動劑；(2) β-分泌酶抑制劑；(3)γ-分泌酶抑制劑。相關研究已經證明β-分泌酶抑制劑和γ-分泌酶抑制劑有很大的副作用，均未取得很好的療效，因此對α-分泌酶的研究成為治療AD的新的方向。因此本研究旨在觀察H102對α、β、γ分泌酶的影響，以探討H102是通過何種途徑來減少Aβ的生成，以尋求治療AD的更有效的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

健康雄性SPF級APP/PS1雙轉基因小鼠30只，體重(25.4±1.6)g，相同月齡以及相同背景的雄性C57BL/6J小鼠15只， 購自中國協(xié)和醫(yī)科大學實驗動物研究中心，飼養(yǎng)于天津醫(yī)科大學實驗動物中心SPF級鼠房。ADAM10、 ADAM17、 BACE1、presenilin-1(PS1)、presenilin enhancer-2(PEN-2)、anterior-pharynx-defective-1a(APH1a)抗體均是購自于北京博奧森生物科技有限公司，β-actin抗體購自北京中杉金橋生物技術有限公司，生物素二抗購自北京鼎國生物公司。藥物H102純度> 95 %，由上海吉爾生化有限公司使用固相合成法合成。DAB 顯色試劑盒、即用型 SABC免疫組化試劑盒均購自于武漢博士德生物公司。Morris水迷宮視頻跟蹤分析系統(tǒng)購買于成都泰盟科技有限公司。

1.2 給藥與實驗分組

30只APP/PS1雙轉基因小鼠隨機分為AD組和H102組，另外選取相同年齡和背景的C57BL/6J小鼠15只，作為對照組。H102組每天同樣時間段經鼻腔給予H102溶液(5.8 mg/kg)5 μl， AD組和對照組每日同樣時間給予空白輔料溶液(0.5% 殼聚糖、0.1% 牛血清白蛋白(BSA，Genview公司))5 μl，連續(xù)給藥30 d。

1.3 Morris水迷宮測試

給藥結束后， 進行Morris水迷宮測試(morris water maze，MWM)實驗。(1)定位航行實驗：在水迷宮第三象限中間位置放置小鼠的平臺， 每天游泳兩次，每次90 s，共測試5 d，在相同時間段記錄小鼠尋找并爬上平臺所需要的時間即逃避潛伏期。(2)空間探索實驗：在MWM實驗的第6天撤去平臺，將小鼠在平臺對側象限放入，記錄90 s的時間小鼠在第三象限停留時間(RTQ)，跨越隱匿平臺的次數及入水朝向角。

1.4 制備腦組織樣本

小鼠定位航行和空間探索實驗結束后，行腹腔注射麻醉，用0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)灌注，然后處死在冰上取腦，將小鼠的腦組織以矢狀縫為界分為兩半，一半用4%多聚甲醛溶液固定48 h 后做蠟塊包埋及切片(厚度5 μm)使用，另一半將海馬和皮質分離后，做好標記并投入液氮，然后保存于-80℃冰箱做Western blot 蛋白質印跡分析。

1.5 免疫組化染色

將組織切片用梯度酒精脫蠟后，按照以下所述順序進行免疫組化實驗。用3%的H2O2孵育30 min，在室溫條件下同時要避光；枸櫞酸緩沖液用微波沸騰的方法進行抗原修復；室溫條件下，5% BSA封閉；30 min后滴加按照一定比例稀釋好的一抗(ADAM10 1∶100，ADAM17 1∶200，BACE1 1∶300，PS1 1∶100，APH1a 1∶400，PEN-2 1∶100)，4℃過夜。實驗的第2天，在組織切片上滴加相應二抗，室溫條件下避光孵育30 min，；然后用辣根酶標記物孵育30 min；在室溫避光的條件下完成后開始DAB顯色，在顯微鏡下控制染色所需時間；隨后用蘇木素復染，時間為40 s；復染結束后使用蒸餾水沖洗，最后用中性樹膠封片。使用倒置顯微鏡(奧林巴斯CKX41，日本)觀察并且拍攝組織切片相同層次的海馬。陰性對照使用PBS代替一抗進行染色，其余步驟相同。用IPP 6.0軟件對染色結果進行累積分光密度(integral optical density，IOD)分析。

1.6 Western blot 分析

取出小鼠的海馬組織，采取以下步驟進行Western blot試驗，測定蛋白濃度并調成等濃度；煮沸變性，然后制膠、上樣、電泳、轉膜、封閉、加入稀釋的一抗(ADAM17 1∶400，ADAM10 1∶300，BACE1 1∶300，PS1 1∶500，PS1 1∶400，PEN-2 1∶200)，4℃搖床過夜。加入稀釋的二抗(1∶5 000)，在暗室進行曝光。用Image J軟件分析所得條帶的光密度(OD)值。

1.7 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 Morris水迷宮測試結果

2.1.1 定位航行實驗結果 對照組的逃避潛伏期明顯少于AD組(P<0.05)，從定位航行實驗的第2天開始， H102組逃避潛伏期明顯比AD組縮短(P<0.05，表1)。

Tab. 1 Comparison of average escape latency in navigation test among three groups of mice (±s，n=15)

AD: APP/PS1 double transgenic

*P<0.05vscontrol；#P<0.05vsAD

2.1.2 空間探索實驗結果 結果表明，對照組RTQ明顯長于AD組(P<0.05)，與AD組相比，H102給藥組RTQ要長(P<0.05)，但仍少于對照組。AD組跨越隱匿平臺的次數與對照組相比明顯減少(P<0.05)，H102組跨越隱匿平臺的次數與AD組相比明顯增多(P<0.05)。入水朝向角指標表明AD組明顯大于正常組(P<0.05)，H102組入明顯小于AD組 (P<0.05)，但仍大于對照組。H102組和對照組之間的比較均無統(tǒng)計學意義(表2)。

GroupRTQ(S)NumberOrientationangle(°)Control27．54±5．232．27±0．8030．77±17．42AD19．57±4．41?0．47±0．52?59．47±12．40?H10225．67±3．25#1．67±0．98#35．84±10．59#

AD: APP/PS1 double transgenic; RTQ: Residence time in the third quadrant

*P<0.05vscontrol；#P<0.05vsAD

2.2免疫組織化學法測定海馬CA1區(qū)α、β、γ分泌酶的表達

2.2.1 ADAM10、ADAM17蛋白海馬CA1區(qū)的免疫組化的變化 ADAM10和ADAM17蛋白主要分布于于細胞膜上，對照組海馬CA1區(qū)陽性細胞表達水平較高，與對照組相比，AD組海馬CA1區(qū)陽性細胞表達減少，染色較淺(P<0.05)，H102組海馬CA1區(qū)陽性表達水平比AD組顯著增高(P<0.05, 圖1，表3，圖1見彩圖頁Ⅰ)。

GroupADAM10ADAM17BACE1Control4．24±0．5610．54±1．313．06±0．76AD2．92±0．62?7．73±0．93?5．18±0．99?H1023．42±0．29#8．23±0．99#3．39±0．78#

AD: APP/PS1 double transgenic

*P<0.05vscontrol；#P<0.05vsAD

2.2.2 BACE1蛋白海馬CA1區(qū)的免疫組化檢測 BACE1蛋白主要存在于細胞膜上，對照組海馬陽性細胞表達減少，AD組與正常組相比陽性海馬CA1區(qū)細胞表達水平較高(P<0.05)，與AD組相比，H102組海馬CA1區(qū)陽性細胞表達明顯減少(P<0.05, 圖2，表3，圖2見彩圖頁Ⅰ)。

2.2.3 PS1、PEN-2、APH1a蛋白海馬CA1區(qū)的變化 PS1主要位于胞漿和胞膜，PEN-2和APH1a蛋白主要存在于細胞膜，對照組小鼠海馬CA1區(qū)陽性細胞表達水平較少，AD組與對照組相比海馬CA1區(qū)陽性細胞水平明顯較高(P<0.05)，與AD組相比，H102組海馬CA1區(qū)陽性細胞表達明顯減少(P<0.05, 圖3，表4，圖3見彩圖頁Ⅰ)。

GroupPS1PEN?2APH1aControl2．13±0．588．22±1．191．69±0．13AD4．41±0．76?18．69±2．11?3．97±0．89?H1022．53±0．80#11．58±1．80#2．02±0．65#

AD: APP/PS1 double transgenic; PS1: Presenilin-1;presenilin; PEN-2: Enhancer-2; APH1a: Anterior-pharynx-defective-1a

*P<0.05vscontrol；#P<0.05vsAD

2.3 Western blot測定α、β 、γ分泌酶的表達

2.3.1 ADAM10、ADAM17蛋白表達的變化 結果表明，ADAM10、ADAM17蛋白均為膜蛋白，AD組小鼠海馬內ADAM10、ADAM17蛋白表達量明顯少于對照組(P<0.05)，H102組蛋白表達量明顯增加(P<0.05), 對照組與H102組之間比較無統(tǒng)計學意義(圖4，表5)。

2.3.2 BACE1蛋白表達的變化 結果表明，BACE1蛋白主要位于細胞膜，AD組腦內BACE1蛋白的表達量明顯多于對照組，H102組蛋白表達量明顯低于AD組(P<0.05, 圖4，表6)

Fig.4Expressions of ADAM10、ADAM17、 BACE1 protein level in mice hippocampus A： Control； B： AD； C： H102； AD: APP/PS1 double transgenic

GroupADAM10ADAM17BACE1Control0．98±0．110．66±0．010．40±0．05AD0．46±0．01?0．40±0．02?0．85±0．03?H1020．89±0．09#0．57±0．02#0．71±0．07#

AD: APP/PS1 double transgenic; ADAM: α-secretase;BACE1; β-secretase

*P<0.05vscontrol；#P<0.05vsAD

2.3.3 PS1、PEN-2、APH1a蛋白表達的變化 結果表明，AD組小鼠腦內PS1、PEN-2、APH1a蛋白表達量明顯多于對照組(P<0.05)，H102組小鼠腦內蛋白表達量明顯低于AD組(P<0.05), 對照組與H102組之間相比無統(tǒng)計學意義(圖5，表6)。

Fig.5Expressions of PS1、PEN-2 and APH1a protein level in mice hippocampus A： Control； B： AD； C： H102； AD: APP/PS1 double transgenic

GroupPS1PEN?2APH1aControl0．35±0．040．28±0．050．38±0．05AD1．08±0．15?0．59±0．08?0．93±0．08?H1020．47±0．08#0．44±0．04#0．49±0．07#

AD: APP/PS1 double transgenic; PS1: Presenilin-1; PEN-2: Enhancer-2; APH1a: Anterior-pharynx-defective-1a

*P<0.05vscontrol；#P<0.05vsAD

3 討論

在阿爾茨海默病中，海馬是最先受到損傷的部位，海馬在大腦中主要負責記憶和學習，阿爾茨海默病是一種最常見的與年齡相關的癡呆癥，導致發(fā)生AD的關鍵因素就是腦內的老年斑，而老年斑的核心成分就是Aβ，Aβ是一個約42個氨基酸的短片段，它能夠使海馬內突觸和神經元最先受到損害，因此首先減少或抑制海馬腦區(qū)Aβ的形成是治療AD的一個重要途徑。前期研究發(fā)現β片層阻斷肽 H102能與Aβ1-42疏水氨基酸特異結合，穩(wěn)定其正常空間結構，抑制其形成β折疊，阻止可溶性Aβ寡聚體和Aβ斑塊形成且對Aβ纖維具有分解作用，從而改善其學習記憶能力[6]。6月齡AD轉基因模型小鼠會表現出老年癡呆的病理特征，此時給藥對AD小鼠具有治療作用，而AD病人早期便會出現認知障礙，因此檢測AD小鼠的認知能力是很有必要的。Morris水迷宮是公認的也是用的較多的檢測空間學習記憶能力的方法。本研究均表明AD小鼠的空間學習記憶能力能夠被H102改善。但是APP在腦內的主要代謝途徑有2條，β片層阻斷肽H102在海馬腦區(qū)是通過何種途徑來減少Aβ的生成是本次研究想要探討的課題。

α-分泌酶是一類膜結合蛋白， APP和Notch分子均是它的底物，后者對細胞的生長發(fā)育很重要[7]。sAPPα對神經有營養(yǎng)和保護的作用，它是經過α-分泌酶裂解產生的[8]，因此治療AD的一種新的方法是增加sAPPα分泌或者使α-分泌酶的活性提高。ADAM9，ADAM10，ADAM17被認為是α-分泌酶活性的代表[8]，但是 ADAM9對α-分泌酶來說并不是必須的[9], ADAM10主要參與sAPPα的組成性分泌過程，而ADAM17參與調節(jié)性分泌[10]。本實驗研究結果顯示AD組ADAM10、ADAM17的表達量均較少，而H102組ADAM10、ADAM17的表達量均比AD組明顯增高，說明給予H102后能夠提高模型小鼠腦內α-分泌酶的活性。產生Aβ的第一步是通過β-分泌酶，從而使它受到很多研究人員的關注。BACE1能夠代表β-分泌酶的活性。小鼠敲除BACE1基因后，腦內無異常的病理特征及Aβ的產生[11]。目前治療阿爾茨海默病以β-分泌酶為關鍵的藥物主要有以下幾類: 一是化學藥和肽類、 擬肽類。二是生物制劑和天然產物[12]。然而BACE1抑制劑有很長的路要走，完全抑制β-分泌酶的活性可能有有害的副作用[13]。本實驗研究表明，AD組小鼠腦內BACE1的表達量在AD組小鼠腦內要明顯高于對照組，而H102組與AD組相比能夠顯著減少BACE1的表達量，表明H102通過減少BACE1的表達，使β-分泌酶的活性減低，而不是讓它的活性受到抑制。γ-分泌酶廣泛存在于人體內，能切割許多I 型跨膜蛋白，它是 Aβ產生的根源。γ-分泌酶有四個亞基組成PS(presenilin)、NCT(nicastrin)、APH1(anterior-pharynx-defective-1)和PEN-2(presenilin enhancer-2)[14]。四個亞基的功能各不相同，各自發(fā)揮著自己的作用。其中PS突變是引起AD的重要原因，它有PS1和PS2兩個亞基，PS1表達在多種組織中，在中樞神經系統(tǒng)的神經元中量較多，心臟和骨骼肌中則以PS2居多。APH1a能夠使有活性的PS1保持穩(wěn)定。PEN-2是γ-分泌酶發(fā)揮活性的必要條件。已經有研究證明，γ-分泌酶在只有PS1，APH1a和PEN-2的情況下，也能夠正常發(fā)揮作用，而NCT對γ-分泌酶來說只是起到穩(wěn)定的作用[15]。本實驗研究結果顯示H102組PS1、APH1a和PEN-2的表達均比AD組明顯減少，且差異具有統(tǒng)計學意義。提示H102可以降低γ-分泌酶的活性。

綜上所述，本實驗研究表明β片層阻斷肽H102可以改善AD模型小鼠的學習記憶能力。其機制可能與H102能夠提高α-分泌酶的活性，同時又能夠降低β-和γ-分泌酶的活性有關。

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EffectofβsheetblockingpeptideH102onAPPmetabolicenzymesinhippocampalbrainofdoubletransgenicADmice

JIANG Fang, SUN Feng-xian, XU Shu-mei△

(Department of Physiology， Tianjin Medical University， Tianjin 300070， China)

Objective: To investigate the effect of β-sheet breaker peptide H102 on APP associated secretase in the hippocampus brain regions of APP/PS1 double transgenic mice(AD mice).MethodsThirty 6-month-old APP/PS1 double transgenic mice were randomly divided into AD group and H102 group, a group of C57BL/6J mice with the same age, number and background was set as controls(n=15). H102 (5.8 mg/kg) 5 μl was infused by intranasal administration to mice in H102 treatment group, and equal volume of blank solution of H102 was given to mice in control group and AD group. The ability of spatial reference memory was tested by Morris water maze after 30 days of treatment. And then immunohistochemistry tests and Western blot were used to detect the content of α-secretase (ADAM10, ADAM17), β-secretase (BACE1), γ-secretase (PS1, APH1a, PEN2) in the hippocampus brain regions.ResultsCompared with the control group, the expression of BACE1, PS1, PEN-2 and APH1-a protein in the hippocampus of AD group were significantly increased, ADAM10, ADAM17 protein expression were significantly reduced (P<0.05); Compared with the model group, H102 could significantly improve the spatial learning and memory ability of AD mice, significantly decreased the expression of BACE1, PS1, PEN-2 and APH1-a protein in the hippocampus, significantly increased the expression of ADAM10 and ADAM17 protein(P<0.05).Conclusionβ sheet peptides blocked H102 can reduce the formation of Aβ in the hippocampus brain area, improve the activity of α-secretase in the hippocampus brain region, decrease the activity of β-and γ-secretase, improve the learning and memory ability of AD mice.

H102; APP; α-secretase; β-secretase; γ-secretase; Alzheimer's disease; APP/PS1 double transgenic mice

R338.8

A

1000-6834(2017)04-299-05

國家科技重大專項基金資助(2009ZX09103029)；天津市科技支撐重點項目基金資助(16YFZCSY01000)

2016-10-08

2017-02-14

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Tel: 13012268139； E-mail: xushm@tijmu.edu.cn

10.12047/j.cjap.5516.2017.073