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    地黃基因RghBNG轉(zhuǎn)化地黃過表達(dá)研究

    2017-10-13 08:35:19周延清楊珂張喻張丹丹李夢辰余萌
    湖北農(nóng)業(yè)科學(xué) 2017年17期
    關(guān)鍵詞:檢測

    周延清+楊珂+張喻+張丹丹+李夢辰+余萌

    摘要:用RT-PCR技術(shù)從地黃[Rehmannia glutinosa (Gaertn.) Libosch.]幼葉中克隆地黃基因RghBNG,使用Pst I和Hind Ш分別酶切地黃基因RghBNG和植物表達(dá)載體pCAMBIA302-GFP,經(jīng)過重組,構(gòu)建其過表達(dá)載體,轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌菌株GV3101,獲得其工程菌;采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法,將該基因轉(zhuǎn)入地黃幼葉細(xì)胞,再生轉(zhuǎn)化地黃植株。經(jīng)過潮霉素抗性篩選、PCR和qRT-PCR檢測,獲得過表達(dá)基因RghBNG地黃植株。這些結(jié)果為進(jìn)一步闡明地黃基因RghBNG功能和地黃遺傳改良奠定了基礎(chǔ)。

    關(guān)鍵詞:地黃[Rehmannia glutinosa (Gaertn.) Libosch.];RghBNG;過表達(dá)載體;qRT-PCR;農(nóng)桿菌介導(dǎo)

    中圖分類號:R282;Q786 文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A 文章編號:0439-8114(2017)17-3342-03

    DOI:10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.17.039

    The Transformation of Rehmannia glutinosa RghBNG Gene into Rehmannia

    glutinosa (Gaertn.) Libosch. for Overexpression

    ZHOU Yan-qing, YANG Ke, ZHANG Yu, ZHANG Dan-dan, LI Meng-chen, YU Meng

    (College of Life Science, Henan Normal University, Xinxiang 453007, Henan, China)

    Abstract: The RghBNG gene was cloned from Rehmannia glutinosa(Gaertn.) Libosch. leaves by RT-PCR. Pst I and Hind III as upstream and downstream enzyme,respectively,were used to digest RghBNG and the plant expression vector pCAMBIA-l302 in order to construct plant overexpression vector pCAMBIAl302-RghBNG-GFP. The overexpression vector was introduced into Agrobacterium tumefaciens strain GV3101 so that its engineered bacteria were obtained. RghBNG was transformed into Rehmannia glutinosa(Gaertn.) Libosch. leaf cells using Agrobacterium-mediated transformation,and hygromycin-resistant transgenic Rehmannia glutinosa(Gaertn.) Libosch. plantlets were obtained via tissue culture,which were confirmed by PCR and qRT-PCR analyses. These results will build up the foundation for further verification of RghBNG functions and its application in Rehmannia glutinosa (Gaertn.) Libosch. genetic improvement.

    Key words: Rehmannia glutinosa(Gaertn.) Libosch.;RghBNG;overexpression vector;RT-qPCR;Agrobacterium-mediated transformation

    地黃[Rehmannia glutinosa (Gaertn.) Libosch.] 為玄參科(ScrophuLariaceae)地黃屬植物,主要栽培品種有懷地黃1號(金壯元)、懷地黃2號(北京1號)、懷地黃3號(溫85-5)和金九等,主要分布在中國的河南、山東、陜西和山西等地,但河南焦作的“懷慶府”的懷地黃最為著名[1]。地黃多以塊根入藥,以炮制方法不同,可分為鮮地黃、生地黃和熟地黃3種形式。地黃主要化學(xué)成分為糖類、環(huán)烯醚萜類、倍半萜類和苯乙醇類,具有降血糖、神經(jīng)保護(hù)等多種生物活性,且毒性較低;地黃能夠清熱生津、滋陰補(bǔ)血,并具有調(diào)節(jié)免疫力、抵抗腫瘤、延緩衰老等作用。

    地黃是非模式植物,遺傳基礎(chǔ)缺乏。但是,地黃基因克隆、功能分析與表達(dá)已有報道[2-5]。地黃RghBNG基因是前期從地黃中克隆出來的全長548 bp的cDNA,包含一個282 bp的開放閱讀框,編碼1條含93個氨基酸殘基的多肽鏈;與已公布基因沒有堿基序列同源性;其編碼蛋白質(zhì)與兩組蛋白質(zhì)具有高同源性:與一組未知功能蛋白質(zhì)具有79%~86%的同源性[1],而與另一組稱作B12D的蛋白質(zhì)具有54%~88%的同源性[3];時空表達(dá)試驗證明其與地黃器官形成與發(fā)育有關(guān)[1],脅迫試驗證明其與非生物脅迫應(yīng)答和生長調(diào)節(jié)劑脅迫反應(yīng)應(yīng)答有關(guān)[4]。綜上所述,RghBNG基因可能是一個多功能蛋白基因。但是,這些結(jié)果是采用生物信息學(xué)方法預(yù)測和分析以及實時定量PCR技術(shù)檢測其轉(zhuǎn)錄本所獲得的,其真正的功能及作用機(jī)理有待深入研究。本研究通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)綠色熒光蛋白基因(GFP)和RghBNG基因共轉(zhuǎn)移的方法浸染懷地黃細(xì)胞,探索RghBNG基因在地黃細(xì)胞中過表達(dá),為進(jìn)一步闡明地黃基因RghBNG功能和地黃遺傳改良奠定基礎(chǔ)。endprint

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 植物材料 懷地黃品種溫85-5小植株,種植于河南師范大學(xué)試驗田,懷地黃品種溫85-5培養(yǎng)30 d組培苗,經(jīng)冷凍于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.1.2 菌株和載體 大腸桿菌DH5α和根瘤農(nóng)桿菌GV3101本實驗室保存,植物表達(dá)載體為pCAMBIA302-GFP(梁衛(wèi)紅惠贈)。

    1.1.3 常用試劑、培養(yǎng)基及藥物 DNA Marker、LA Taq DNA 聚合酶、上樣緩沖液為6×Loading Buffer、氯化鈣、DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶Pst I和Hind III、MS培養(yǎng)基、卡那霉素(Kan)、氨芐青霉素(Amp)、利福平(Rif)、乙酰丁香酮(AS)、頭孢霉素和潮霉素(hyg)。

    1.1.4 儀器 1000、200、20、2.5 μL可調(diào)式移液槍、SW-CJ-2D型超凈工作臺、RT-qPCR、培養(yǎng)箱、-80 ℃冰箱、YP202N型電子天平、紫外分光光度計、臺式超速離心機(jī)、超微量分光光度計、PCR儀、紫外分光光度計。

    1.1.5 引物 RT-qPCR研究所需內(nèi)參基因TIP41引物[1]:TIP41F(5′-TGGCTCAGAGTTGATGGAGTGCT-3′)、TIP41R(5′-CTCTCCAGCAGCTTTCTCGGAGA-3′)。

    RghBNG基因引物[2]:RghBNGF(5′-CGCGGAT CCATAATGGCTTCATCCACC-3′)、RghBNGR(5′-AGCATACTTCTCCCCTTCTGCAAAG-3′)。

    潮霉素標(biāo)記基因引物[5]:hyg(R)F(5′-ATCGAA

    ATTGCCGTCAACC-3′)、hyg(R)R(5′-ACAGCGTCT

    CCGACCTGAT-3′)。

    RghBNG和gfp基因的融合基因引物:RghBNGF 5′-CGCGGATCCATAATGGCTTCATCCACC-3′、gfpR 5′-TGCGCTCCTGGAGTAGC-3′(根據(jù)gfp基因3′末端堿基序列合成引物)[2]。

    1.2 方法

    1.2.1 目的基因即地黃基因RghBNG的提取 根據(jù)張喻[2]RT-PCR技術(shù)克隆RghBNG的ORF區(qū),提取地黃基因RghBNG目的基因。

    1.2.2 構(gòu)建表達(dá)載體 用堿裂解法取pCAMBIAI302-GFP質(zhì)粒,酶切,電泳并回收目的基因和質(zhì)粒,用T4連接酶將目的基因RghBNG與載體連接,轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α,經(jīng)PCR與酶切鑒定篩選出重組子,構(gòu)建正義表達(dá)載體。目的基因片段RghBNG的測序需要PCR產(chǎn)物與載體連接,再轉(zhuǎn)化到E.coli中進(jìn)行克隆。作為克隆的E.coli受體細(xì)胞,必須是允許外源DNA進(jìn)入的感受態(tài)細(xì)胞。采用CaCl2法制備感受態(tài)細(xì)胞,通過此方法轉(zhuǎn)化根瘤農(nóng)桿菌GV3101,經(jīng)Rif、Kan和PCR檢測后用于地黃的遺傳轉(zhuǎn)化。

    1.2.3 根瘤菌GV3101工程菌制備 ①無菌條件下在冰上凍融3管200 μL GV3101感受態(tài)細(xì)胞。②分別加入5 μL重組質(zhì)粒DNA和pCAMBIAl302質(zhì)粒,混勻。同時設(shè)置一管空對照。③冰上靜置1 min,放于液氮中速凍8 min;迅速取出,放入37 ℃水浴中溶解 5 min,冰上靜置2 min。④加入800 μL未加抗生素的LB液體培養(yǎng)基,28 ℃、200 r/min搖4 h至菌濃度為OD600 nm=0.5;之后4 000 r/min離心10 min,留200 μL菌液,用槍頭吹打混勻。⑤取100 μL菌液涂布于加有Kan和Rif抗生素的LB固體培養(yǎng)基上,28 ℃倒置培養(yǎng)2 d,挑選抗性菌落進(jìn)行PCR鑒定。

    1.2.4 地黃幼葉細(xì)胞遺傳轉(zhuǎn)化與檢測 ①葉圓片法轉(zhuǎn)化:將懷地黃無菌苗的葉片剪成長寬約0.8 cm的小塊,在含植物表達(dá)載體pCAMBIAl302-RghBNG-GFP的根癌農(nóng)桿菌GV3101菌液中浸泡8 min左右,用無菌濾紙吸干葉圓片,接種到MS培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)2~3 d。②抗性愈傷誘導(dǎo)及其芽分化:將①共培養(yǎng)后的葉圓片轉(zhuǎn)接到含2.1 mg/L 6-BA、0.12 mg/L NAA、100 μmol/L的乙酰丁香酮(AS)、100 μmol/L頭孢霉素和12 mg/L潮霉素(hyg)的篩選培養(yǎng)基上,3~4周后把抗性愈傷轉(zhuǎn)接到新的篩選培養(yǎng)基上,2~3 周長出抗性芽。③再生芽生根:將長2~3 cm的抗性芽剪下轉(zhuǎn)接入含0.02 mg/L NAA和適宜質(zhì)量濃度潮霉素的生根培養(yǎng)基中生根。④再生植株的PCR檢測:提取再生植株葉片基因組DNA,利用PCR擴(kuò)增已知hyg(R)基因(794 bp)、RghBNG和gfp基因的融合基因(1 298 bp),篩選抗性地黃植株。⑤抗性植株的增殖與生根:經(jīng)過④檢測陽性轉(zhuǎn)化再生地黃芽轉(zhuǎn)入含0.2 mg/L 6-BA和0.01 mg/L NAA的叢生芽分化培養(yǎng)基進(jìn)行擴(kuò)繁,切下增殖芽,放在③生根培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生根。培養(yǎng)溫度為25±1 ℃,光照度為 2 000 lx,光照時間為16 h/d,培養(yǎng)至試驗所用地黃苗。

    1.2.5 陽性轉(zhuǎn)化再生地黃苗qRT-PCR檢測 取1.2.4中⑤所獲得的陽性轉(zhuǎn)化再生地黃苗的根和葉,參照Zhou等[4]的方法進(jìn)行qRT-PCR檢測。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 地黃基因RghBNG的ORF的克隆

    利用RT-PCR技術(shù)從張永華[1]構(gòu)建的大腸桿菌工程菌表達(dá)載體中擴(kuò)增出RghBNG的ORF。電泳檢測其大約為500 bp(圖1a)。回收和純化后,測序證明其堿基組成和大小與張永華[1]報道的一致。

    2.2 重組載體的構(gòu)建與檢測

    用限制性內(nèi)切酶Pst I和Hind III分別酶切基因RghBNG的ORF和植物表達(dá)載體pCAMBIAl302,體外重組獲得重組質(zhì)粒pCAMBIAl302-RghBNG-GFP,轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α,篩選抗性陽性菌。然后,提取其載體pCAMBIAl302-RghBNG-GFP經(jīng)Pst I和Hind III雙酶切鑒定(圖1b)和PCR驗證(圖1c)。結(jié)果顯示,雙酶切所得小片段和PCR擴(kuò)增產(chǎn)物均為500 bp條帶。回收和純化后,序列分析證明其為RghBNG的ORF。endprint

    2.3 農(nóng)桿菌介導(dǎo)基因RghBNG轉(zhuǎn)化地黃與鑒定

    具有重組質(zhì)粒pCAMBIAl302-RghBNG-GFP轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV1301轉(zhuǎn)化地黃幼葉圓片,誘導(dǎo)愈傷組織、分化芽、擴(kuò)繁、生根、移栽和檢測的結(jié)果如圖2所示。其中,轉(zhuǎn)化植株2、3、4和5中檢測出hyg(R)基因,約794 bp;轉(zhuǎn)化植株2、4和5中檢測出轉(zhuǎn)基因RghBNG-GFP,約1 300 bp。

    2.4 基因RghBNG的過表達(dá)

    任選一株取培養(yǎng)25 d的陽性地黃轉(zhuǎn)化植株,分別切取其葉和根,提取總RNA進(jìn)行qRT-PCR分析,結(jié)果見表1。RghBNG基因在轉(zhuǎn)化植株幼葉中表達(dá)量最高。

    3 小結(jié)與討論

    地黃基因RghBNG是一種與兩類已知蛋白質(zhì)具有相當(dāng)高同源性的、不具有信號肽的功能蛋白基因。一類是一組未知功能蛋白質(zhì),兩者的同源性高達(dá)79%~86%。另一類是B12D蛋白質(zhì)[1],兩者的同源性達(dá)54%~88%[3]。而且RghBNG蛋白中具有B12D蛋白所具有的B12D superfamily結(jié)構(gòu)域,該結(jié)構(gòu)域在細(xì)胞膜中[3],與重金屬脅迫和赤霉素等植物生長調(diào)節(jié)劑處理有應(yīng)答反應(yīng)[4]。因此,地黃RghBNG很可能對地黃遺傳改良具有重要作用,有必要進(jìn)一步研究其功能。本研究成功構(gòu)建了地黃基因RghBNG的過表達(dá)載體,獲得其轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌工程菌;用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將其轉(zhuǎn)入地黃細(xì)胞,經(jīng)過組織培養(yǎng)獲得再生芽和植株,利用PCR技術(shù)檢測出一些抗潮霉素再生植株具有hyb(R)基因和RghBNG-GFP融合基因;利用qRT-PCR技術(shù)分析其在陽性轉(zhuǎn)化地黃植株的根與葉中過表達(dá)。所以,獲得的過表達(dá)基因RghBNG的地黃材料,為進(jìn)一步闡明地黃基因RghBNG功能和地黃遺傳改良奠定了基礎(chǔ)。

    參考文獻(xiàn):

    [1] 張永華.地黃基因RghKAT、RghKAT、RglKAT與RghBNG的克隆和表達(dá)[D].河南新鄉(xiāng):河南師范大學(xué),2013.

    [2] 張 喻.地黃RghBNG基因的結(jié)構(gòu)分析和功能驗證[D].河南新鄉(xiāng):河南師范大學(xué),2014.

    [3] 周延清,王向楠,張永華,等.植物B12D基因克隆研究進(jìn)展[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué),2016,45(6):1-4,19.

    [4] ZHOU Y Q,ZHANG Y H,WEI J,et al. Cloning and analysis of expression patterns and transcriptional regulation of RghBNG in response to plant growth regulators and abiotic stresses in Rehmannia glutinosa[J].Springer Plus,2015,4:1-8.

    [5] 王豐青,田云鶴,謝彩俠,等.根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的懷地黃遺傳轉(zhuǎn)化研究[J].中草藥,2014,45(17):2541-2546.endprint

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