應(yīng)用微衛(wèi)星標(biāo)記對(duì)兩個(gè)SD大鼠封閉群的遺傳學(xué)研究

侯開(kāi)領(lǐng)+張磊+周靜+夏介英

摘要：利用7個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記結(jié)合高分辨率全自動(dòng)核酸分析系統(tǒng)，對(duì)四川和上海兩個(gè)不同地區(qū)生產(chǎn)的SD大鼠封閉群進(jìn)行遺傳檢測(cè)，計(jì)算并分析其群體遺傳學(xué)參數(shù)。結(jié)果在兩個(gè)SD大鼠群體中共發(fā)現(xiàn)等位基因40個(gè)，每位點(diǎn)等位基因數(shù)4～8個(gè)，平均5.714 3個(gè)；平均期望雜合度為0.706 8；平均多態(tài)信息含量為0.663 4。兩個(gè)群體分別檢測(cè)到38和36個(gè)等位基因；平均期望雜合度分別為0.706 9和0.697 9；平均多態(tài)信息含量分別為0.655 1和0.646 1；兩個(gè)群體分別有4個(gè)位點(diǎn)和5個(gè)位點(diǎn)符合Hardy-Weinberg平衡。兩群體間Nei（1972）遺傳同一性和遺傳距離分別為0.268 2和0.764 8，Nei（1978）無(wú)偏遺傳同一性和遺傳距離分別為0.238 1和0.788 2，不同微衛(wèi)星位點(diǎn)的平均Fst值為0.090 5，表明兩個(gè)種群的遺傳分化程度為中等分化。試驗(yàn)結(jié)果表明，兩個(gè)種群都符合封閉群動(dòng)物的群體遺傳特征，是比較理想的封閉群。

關(guān)鍵詞：SD大鼠；封閉群；微衛(wèi)星；遺傳多樣性

中圖分類號(hào)：Q75 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2017）17-3308-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.17.030

Genetic Analysis on Two Populations of Closed Colony Sprague-Dawley Rats Using Microsatellite DNA Markers

HOU Kai-ling， ZHANG Lei， ZHOU Jing， XIA Jie-ying

（Sichuan Academy of Chinese Medicine Sciences， Chengdu 610041， Sichuan， China）

Abstract： 7 microsatellite markers were screened by a full-automated high-resolution nucleic acid analysis system for the genetic analysis on two closed populations of Sprague-Dawley rats from two districts of Sichuan and Chengdu， and the population genetic parameters were calculated. The results showed that a total of 40 alleles were detected in two populations， with 4-8 alleles and a mean 5.714 3 alleles at each locus. The mean expected heterozygosity was 0.706 8，and the mean polymorphism information content was 0.663 4. In the two populations，38 and 36 alleles were detected，the mean expected heterozygosity was 0.706 9 and 0.697 9，and mean polymorphism information content was 0.655 1 and 0.646 1，respectively. Four loci and five loci， respectively，were in accord with Hardy-Weinberg equilibrium in the two populations. The Nei（1972） genetic identity and genetic distance between the two populations were 0.268 2 and 0.764 8，respectively. The Nei（1978） unbiased genetic identity and genetic distance between the two populations were 0.238 1 and 0.788 2，respectively. The average Fst of all loci was 0.090 5，which implied a moderate genetic differentiation between two populations. It indicated that both the two populations are consistent with a closed group of animal population genetic characteristics.

Key words： Sprague-Dawley rats； closed colony； microsatellite； genetic diversity

封閉群實(shí)驗(yàn)動(dòng)物具有遺傳多樣性和差異性，與人類群體遺傳類似，在人類遺傳研究、藥理毒理學(xué)研究、生物制品和化學(xué)制品的鑒定等方面起著不可替代的作用[1]。

封閉群實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的遺傳質(zhì)量對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響不容忽視，如常用于藥理及毒理學(xué)研究的封閉群大鼠，由于遺傳不穩(wěn)定及不同實(shí)驗(yàn)群體遺傳差異造成的藥物反應(yīng)性的不一致對(duì)試驗(yàn)結(jié)果造成了嚴(yán)重影響[2]。目前國(guó)際和國(guó)內(nèi)對(duì)封閉群動(dòng)物均缺乏統(tǒng)一的遺傳監(jiān)測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，其原因是由于封閉群動(dòng)物的遺傳機(jī)制具有復(fù)雜性，其遺傳檢測(cè)和遺傳質(zhì)量控制相對(duì)困難。因此開(kāi)展封閉群大鼠的遺傳檢測(cè)研究對(duì)于其遺傳質(zhì)量控制和標(biāo)準(zhǔn)化應(yīng)用具有迫切性和重要意義。endprint

微衛(wèi)星DNA是一類以1～6 bp核苷酸為基本序列的多次串聯(lián)重復(fù)序列，由于重復(fù)序列的數(shù)目不同，產(chǎn)生了DNA的多態(tài)性，又稱簡(jiǎn)單重復(fù)序列（Simple sequence repeats，SSR）或短串聯(lián)重復(fù)（Short tandem tepeats）[3，4]。微衛(wèi)星DNA在基因組中普遍分布、數(shù)量豐富且多態(tài)性好，能滿足對(duì)封閉群動(dòng)物遺傳檢測(cè)時(shí)需要大量樣本和大量檢測(cè)位點(diǎn)的要求。微衛(wèi)星標(biāo)記應(yīng)用于封閉群實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的遺傳檢測(cè)具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)和良好前景[5-7]。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

兩批封閉群SD大鼠分別購(gòu)于四川和上海，生產(chǎn)許可證號(hào)分別為SCXK（川）2013-19和SCXK（滬）2012-0002，各30只。兩批SD大鼠均從生產(chǎn)群中隨機(jī)抽取，均為SPF級(jí)。

1.2 主要試劑及儀器

試劑：Prime STAR HS（Premix），購(gòu)自TaKaRa；DNA提取試劑盒，天根生化科技（北京）有限公司產(chǎn)品； Separation Buffer，Size Marker，Alignment Marker均由Bioptic公司提供。

儀器：PCR儀（ABI），Qsep 100全自動(dòng)核酸分析系統(tǒng)（Bioptic），NanoDrop 2000超微量分光光度計(jì)（Thermo），Precellys 24組織勻漿機(jī)（Bertin），離心機(jī)（Thermo）等。

1.3 引物的選擇

根據(jù)文獻(xiàn)[8]，選擇多態(tài)性好的7個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)（R43、R63、R88、R103、R132、R142、R159）進(jìn)行試驗(yàn)。所有引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.4 方法

1.4.1 基因組的提取 取大鼠新鮮肝臟組織50 mg，利用組織勻漿機(jī)進(jìn)行勻漿，之后使用DNA提取試劑盒進(jìn)行基因組的提取，提取完畢后利用超微量分光光度計(jì)檢測(cè)濃度，將符合PCR模板質(zhì)量要求的基因組置于-80 ℃保存。

1.4.2 PCR擴(kuò)增 反應(yīng)體系：2×Prime STAR HS（Premix）12.5 μL；上游引物（1 μmol/L）2.5 μL；下游引物（1 μmol/L）2.5 μL；模板（500 ng/μL）1.0 μL；ddH2O 6.5 μL。擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性1 min，退火1 min，72 ℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸3 min。利用Qsep100全自動(dòng)核酸分析系統(tǒng)對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行分析。

1.4.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 利用Q-Analyzer軟件讀取等位基因片段大小，通過(guò)PopGene1.32[9]軟件計(jì)算觀察等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)[10]、觀察雜合度、期望雜合度[11]、F-統(tǒng)計(jì)量、Shannon信息指數(shù)、Nei遺傳相似度及遺傳距離、Hardy-Weinberg平衡等指標(biāo)[12]。利用PIC_CALC軟件對(duì)每個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行多態(tài)信息含量（PIC）分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 各微衛(wèi)星位點(diǎn)在總?cè)后w上的遺傳分布

統(tǒng)計(jì)7個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)在兩個(gè)SD大鼠群體各個(gè)體的基因型，計(jì)算每個(gè)位點(diǎn)各等位基因在各群體中的基因頻率分布，結(jié)果見(jiàn)表1。參考引物篩選文獻(xiàn)[8]，等位基因大小可能有1～3個(gè)堿基的誤差。

以兩個(gè)大鼠種群為整體計(jì)算各位點(diǎn)的觀察等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)、觀察雜合度、期望雜合度、Shannon信息指數(shù)、多態(tài)信息含量、F-統(tǒng)計(jì)量，結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可見(jiàn)，7個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)在兩個(gè)群體中共發(fā)現(xiàn)40個(gè)等位基因，每個(gè)位點(diǎn)4～8個(gè)，平均5.714 3個(gè)。有效等位基因數(shù)在1.779 1～5.413 5之間，平均為3.790 6；觀察雜合度在0.216 7～0.850 0之間，平均為0.614 3；期望雜合度在0.441 6～0.822 1之間，平均為0.706 8；Shannon信息指數(shù)在0.869 6～1.813 9之間，平均為1.427 8；多態(tài)信息含量（PIC）在0.411 4～0.790 0之間，平均為0.663 4。

2.2 兩個(gè)SD大鼠種群遺傳多樣性比較

由表3可見(jiàn)，四川種群和上海種群分別檢測(cè)到38個(gè)和36個(gè)等位基因；平均觀察雜合度分別為0.619 1和0.609 5；平均期望雜合度分別為0.706 9和0.697 9；平均多態(tài)信息含量分別為0.655 1和0.646 1；平均Shannon信息指數(shù)分別為1.394 5和1.377 0。從數(shù)值上看，兩個(gè)種群在不同遺傳多樣性參數(shù)上存在微小差異，但方差分析表明兩群體各組指數(shù)的差異均未達(dá)到顯著水平?？梢钥闯鰞蓚€(gè)SD大鼠種群的群體多樣性相當(dāng)。

2.3 Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)

由表4可見(jiàn)，四川種群有4個(gè)位點(diǎn)處于Hardy-Weinberg遺傳平衡狀態(tài)，3個(gè)位點(diǎn)極顯著偏離Hardy-Weinberg遺傳平衡（P<0.01）；上海種群有5個(gè)位點(diǎn)處于Hardy-Weinberg遺傳平衡狀態(tài)，2個(gè)位點(diǎn)極顯著偏離Hardy-Weinberg遺傳平衡（P<0.01）。

2.4 兩大鼠群體間的遺傳關(guān)系

遺傳分化系數(shù)（Fst）和遺傳距離結(jié)果分別見(jiàn)表2和表5。兩個(gè)群體7個(gè)位點(diǎn)的Fst范圍為0.018 4～0.204 7，平均為0.090 5，表明其群體間的遺傳變異占總遺傳變異的9.05%。兩群體的Nei（1972）遺傳同一性和遺傳距離分別為0.268 2和0.764 8，Nei（1978）無(wú)偏遺傳同一性和遺傳距離分別為0.238 1和0.788 2。

3 討論

3.1 兩個(gè)SD大鼠種群的遺傳多樣性

雜合度或群體平衡狀態(tài)是群體遺傳結(jié)構(gòu)分析最直接和最有效的方法，雜合度值越高所在群體的遺傳多樣性就越豐富，較理想的封閉群體的雜合度應(yīng)介于0.5～0.7。本研究中，兩群體的觀察雜合度平均值分別為0.619 1和0.609 5，推測(cè)以選定的7個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)為前提，兩個(gè)種群均屬于較為理想的封閉群種群。endprint

Hardy-Winberg遺傳平衡檢測(cè)結(jié)果顯示，四川SD大鼠種群有4個(gè)位點(diǎn)處于平衡狀態(tài)，上海SD大鼠種群有5個(gè)位點(diǎn)處于平衡狀態(tài)。可以看出以選定的7個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)為前提，兩種群中大多數(shù)位點(diǎn)處于Hardy-Winberg遺傳平衡狀態(tài)，推測(cè)兩個(gè)種群是比較理想的封閉群群體。少數(shù)出現(xiàn)偏離的原因除了無(wú)效等位基因外，還有可能是檢測(cè)的樣本數(shù)量不是無(wú)窮大，不能完全反映完整群體的遺傳狀態(tài)；另有可能是因?yàn)樵赟D大鼠種群的日常飼養(yǎng)繁殖工作中，雖嚴(yán)格進(jìn)行隨機(jī)交配，但也不可避免地會(huì)出現(xiàn)極少量的近交現(xiàn)象。

3.2 兩個(gè)SD大鼠種群的遺傳關(guān)系

Fst值反應(yīng)的是兩個(gè)種群間的遺傳差異。本研究中，兩個(gè)種群在7個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的平均Fst值為0.090 5，即群體間的遺傳變異占總遺傳變異的9.05%，90.95%的遺傳變異來(lái)自群體內(nèi)部的遺傳多樣性。當(dāng)00.25時(shí)，表明分化極大[13]。此外，兩個(gè)群體的Nei（1972）遺傳同一性和遺傳距離分別為0.268 2和0.764 8，Nei（1978）無(wú)偏遺傳同一性和遺傳距離分別為0.238 1和0.788 2。表明群體間的遺傳分化已達(dá)中等水平。

3.3 微衛(wèi)星標(biāo)記在SD大鼠封閉群遺傳檢測(cè)中的適用性

封閉群動(dòng)物種群具有基因多樣性，對(duì)其進(jìn)行遺傳檢測(cè)，需要更多的檢測(cè)位點(diǎn)、更豐富的位點(diǎn)多態(tài)性。而目前中國(guó)國(guó)標(biāo)的生化標(biāo)記檢測(cè)法主要分別針對(duì)的是近交系小鼠和大鼠的13個(gè)和9個(gè)生化位點(diǎn)，且每個(gè)位點(diǎn)只有2～3個(gè)等位基因，存在檢測(cè)位點(diǎn)少、多態(tài)性差的問(wèn)題，無(wú)法全面地反映封閉群豐富的基因多樣性和遺傳概貌。而微衛(wèi)星標(biāo)記具有高度多態(tài)性和在哺乳動(dòng)物基因組中分布廣泛的特點(diǎn)，尤其適合于封閉群動(dòng)物的遺傳檢測(cè)。本研究選取的7個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記，所有位點(diǎn)的等位基因數(shù)均在3個(gè)以上，平均為5.714 3個(gè)。

多態(tài)信息含量（PIC）是表示微衛(wèi)星多態(tài)性高低的一個(gè)指標(biāo)，能反映某一個(gè)遺傳標(biāo)記所包含的或所能提供的遺傳信息的含量。當(dāng)PIC>0.50時(shí)，表明該遺傳標(biāo)記具有高度的可提供遺傳信息性，為高度多態(tài)性座位；當(dāng)PIC<0.25時(shí)，表明該遺傳標(biāo)記可提供的遺傳信息較差，為低度多態(tài)性座位；當(dāng)0.25

另外，目前關(guān)于四川地區(qū)SD大鼠封閉群的遺傳質(zhì)量相關(guān)報(bào)道較少，不清楚其遺傳質(zhì)量如何。本研究針對(duì)四川地區(qū)的SD大鼠封閉群進(jìn)行遺傳多樣性分析，并同上海地區(qū)做比較分析，顯示四川地區(qū)SD大鼠封閉群是比較理想的封閉群實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，為豐富四川地區(qū)SD大鼠封閉群的遺傳質(zhì)量信息提供了基礎(chǔ)資料。

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