部分桑樹品種的SSR遺傳多樣性分析

楚渠+孟剛+彭云武

摘要：利用SSR（Simple sequence repeat）技術(shù)對17個桑樹（Morus alba L.）種質(zhì)資源的遺傳多樣性進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，28對SSR引物擴(kuò)增產(chǎn)物在17份桑樹品種中均存在多態(tài)性；17份桑樹品種間的遺傳一致度變異范圍為0.550 9～0.905 7，平均遺傳一致度為0.728 3，大十與康利1號的遺傳一致度為0.905 7。利用桑樹品種間的遺傳距離進(jìn)行聚類分析，可將17個桑樹品種分成4個大類。這一結(jié)果與《中國桑樹品種志》上的形態(tài)學(xué)分類結(jié)果一致。

關(guān)鍵詞：桑樹（Morus alba L.）；品種；遺傳多樣性

中圖分類號：S888.3 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）17-3292-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.17.026

Analyses on Genetic Diversity of Some Mulberry Varieties

CHU Qu， MENG Gang， PENG Yun-wu

（Key Sericulture Laboratory of Shaanxi Province， Ankang Univetsity， Ankang 725000， Shaanxi， China）

Abstract： Using SSR（Simple sequence repeat） molecular technique，the genetic diversity of seventeen mulberry germplasm resources were analyzed. The results showed that，twenty-eight pairs of SSR primers amplified products were found polymorphic in seventeen mulberry varieties；Seventeen mulberry varieties between the consistent degree of genetic variation was 0.550 9～0.905 7，the average genetic identity was 0.728 3，the genetic identity of Dashi and Kangli No.1 was 0.905 7. Cluster analysis based on genetic distance among mulberry varieties was conducted，seventeen mulberry varieties can be divided into four categories. The result is consistent with the morphological classification of Journal of China Mulberry Varieties.

Key words： mulberry（Morus alba L.）； variety； genetic diversity

桑樹是多年生落葉植物，據(jù)統(tǒng)計，1952-1986年，中國科技工作者共發(fā)現(xiàn)和收集桑樹品種材料 1 100余份[1]。陜西省蠶桑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存了野生桑、育成桑等500余份桑樹品種。在傳統(tǒng)形態(tài)分類學(xué)的基礎(chǔ)上，應(yīng)用分子標(biāo)記技術(shù)對桑樹品種深入開展分子分類學(xué)和遺傳多樣性研究是成熟且為學(xué)界認(rèn)可的分類學(xué)新途徑[2-4]。為此，試驗(yàn)利用安康學(xué)院收集保存的桑樹資源材料，包括野生桑桑樹品種、誘變育成桑樹品種、地方選育桑樹品種，研究桑樹品種間的遺傳多樣性，以期為針對一些核心桑樹品種資源深入開展基礎(chǔ)研究和開發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

選取安康學(xué)院收集保存的17個桑樹品種作為試驗(yàn)材料，包括3份野生桑品種，14份育成桑樹品種，其中果桑品種有大十、桂花蜜、長穗桑、康利1號和葫蘆桑。具體信息見表1。

1.2 主要引物

試驗(yàn)選用的引物信息見表2。

1.3 試驗(yàn)方法

1）基因組 DNA的提取與檢測。取各供試材料的中部葉片（每個桑樹品種材料隨機(jī)取8個單株的成熟葉片各3片混合）置于已經(jīng)編號的保鮮袋中并迅速帶回實(shí)驗(yàn)室，采取改良的CTAB法對其基因組DNA進(jìn)行提取。室溫靜置待抽提DNA干燥之后，加入50 μL TE緩沖液溶解，取2～3 μL經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測合格之后，樣品置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2）PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)為20 μL體系，體系中依次加入ddH2O 14.8 μL，dNTP 0.4 μL，10×PCR Buffer 2 μL， 正向引物 0.3 μL（20 μmol/L），反向引物0.3 μL（20 μmol/L），DNA模板2 μL，Taq DNA聚合酶0.2 μL后混勻。

SSR PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，54 ℃復(fù)性35 s，72 ℃延伸40 s，共 35個循環(huán)；72 ℃延伸3 min后4 ℃終止反應(yīng)。

3）聚丙烯酰胺凝膠電泳。取2 μL SSR PCR產(chǎn)物混合上樣緩沖液，94 ℃變性10 min后用于SDS-PAGE電泳。聚丙烯凝膠濃度為6%，垂直電泳條件為220 V預(yù)電泳10 min后，125 V電泳約3.5 h。銀染后觀察記錄染色條帶。

1.4 數(shù)據(jù)分析

根據(jù)SSR-PCR產(chǎn)物的SDS-PAGE電泳圖，凝膠上某個相同遷移率位置上有DNA條帶記為1，無DNA條帶記為0，形成SSR的表型數(shù)據(jù)矩陣，使用POPGENE32、NTSYS軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。endprint

用POPGENE 32計算多態(tài)位點(diǎn)百分率P （percent of polymorphic loci）和有效等位基因數(shù)Ne （effective number of alleles per loci）。

用Neis（1972）的遺傳一致度I（genetic identity）和遺傳距離D（genetic distance）來衡量各種群之間的遺傳分化大小。基于遺傳距離，采用類平均聚類法（UPGMA）對各種群進(jìn)行聚類分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 17個桑樹品種的遺傳多樣性和遺傳變異

利用已開發(fā)的引物用于17份桑品種遺傳分析，從表3可以看出，28對引物共擴(kuò)增出清晰譜帶265條，不同引物的擴(kuò)增條帶數(shù)從3～19條不等，平均每個引物的擴(kuò)增帶數(shù)為9.5條，本次分析中，引物S-p40擴(kuò)增條帶數(shù)最多，為19條，引物S-p29擴(kuò)增條帶數(shù)最少，為3條。平均多態(tài)性百分率為100%。

2.2 17個桑樹品種的遺傳距離和遺傳相似系數(shù)

利用軟件結(jié)合SSR-PCR和SDS-PAGE電泳，對17份桑樹品種間的遺傳一致度和遺傳距離進(jìn)行了分析，結(jié)果（表4）表明，17份桑樹品種間的遺傳一致度變異范圍為0.550 9～0.905 7，平均遺傳一致度為0.728 3。大十與康利1號的遺傳一致度為0.905 7，桐鄉(xiāng)青與荷葉白的遺傳一致度為0.894 3。

2.3 17個桑樹品種的聚類分析

利用桑樹品種間的遺傳距離進(jìn)行聚類分析（圖1），可將17個桑樹品種分成4個大類。其中3個野生桑樹品種各自獨(dú)聚一類（3-葫蘆桑、10-長穗桑、15-巖桑），14個育成桑樹品種聚為一類。果桑中的大十與康利1號的遺傳距離最近，為0.099 1，在形態(tài)學(xué)上它們的葉片外形和枝條皮色、桑芽形狀都相似，差異在于大十桑椹長度比康利1號長、大十桑椹成熟時間比康利1號早、大十桑椹糖度比康利1號高、康利1號桑椹略帶酸味。

3 小結(jié)

本研究利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)對安康學(xué)院收集保存的桑樹地方品種、野生桑品種和誘變育成品種的遺傳多樣性進(jìn)行了分析，并對它們之間的親緣關(guān)系進(jìn)行了探討。從結(jié)果看，17個桑樹品種間的遺傳一致度變異范圍為0.550 9～0.905 7，平均遺傳一致度為0.728 3，桑樹地方品種間的遺傳基礎(chǔ)比較狹窄，親緣關(guān)系比較接近。彭波等[5]應(yīng)用SSR引物分析了172個桑樹品種（系）的遺傳多樣性，結(jié)果是遺傳相似性系數(shù)在0.72～1.00之間，認(rèn)為遺傳基礎(chǔ)比較狹窄。楚渠等[6]應(yīng)用28對SSR引物分析了55份陜西地方桑樹種質(zhì)資源的遺傳多樣性，結(jié)果是55份桑樹品種間的遺傳相似系數(shù)變異范圍為0.639 8～0.965 5，認(rèn)為桑樹品種的親緣關(guān)系與地理分布不存在關(guān)聯(lián)。本研究結(jié)果表明，在前期開發(fā)的引物能有效地擴(kuò)增出多態(tài)性條帶，并實(shí)現(xiàn)對桑樹品種的遺傳關(guān)系分析，同時在此基礎(chǔ)上分析了桑樹品種親緣關(guān)系，其結(jié)果與此前的研究報道一致，進(jìn)一步說明了研究方法的可行和研究結(jié)果的可靠性。本研究將為深入探討不同桑樹品種之間的遺傳進(jìn)化關(guān)系提供理論基礎(chǔ)，同時也在桑資源開發(fā)利用過程中應(yīng)對不同需求而面臨的桑樹品種選擇等方面具有理論指導(dǎo)意義。

參考文獻(xiàn)：

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[4] 楚 渠，孟 剛.桑樹SSR引物的開發(fā)及其多態(tài)性分析[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，55（11）：2824-2828，2884.

[5] 彭 波，胡興明，鄧 文，等.桑樹種質(zhì)資源SSR標(biāo)記的遺傳多樣性分析[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，49（4）：779-784.

[6] 楚 渠，彭云武.利用SSR標(biāo)記對陜西地方桑樹品種的遺傳多樣性分析[J].陜西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，61（6）：17-20.endprint