大米蛋白的復(fù)合酶解及酶解物的體外抗氧化活性

彭斕蘭，陳季旺,2，蔡 俊,丁文平,2，吳永寧,2

(1. 武漢輕工大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖北 武漢 430023；2.農(nóng)產(chǎn)品加工湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北 武漢 430023)

大米蛋白的復(fù)合酶解及酶解物的體外抗氧化活性

彭斕蘭1，陳季旺1,2，蔡 俊1,丁文平1,2，吳永寧1,2

(1. 武漢輕工大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖北 武漢 430023；2.農(nóng)產(chǎn)品加工湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北 武漢 430023)

為測(cè)定大米蛋白復(fù)合酶水解物的體外抗氧化活性，優(yōu)化酶解工藝，分別采用胰蛋白酶(Trypsin)、復(fù)合蛋白酶(Protamex)及中性蛋白酶(Neutrase)復(fù)合酶解大米蛋白的堿性蛋白酶(Alcalase)水解液，測(cè)定水解度(DH)、肽濃度、ABTS+·清除活性及Fe2+螯合活性，明確較佳的復(fù)合酶種類(lèi)及酶解條件。結(jié)果顯示：隨著時(shí)間的增加，堿性蛋白酶水解的DH和肽濃度增大，酶解物的ABTS+·清除活性及Fe2+螯合活性增強(qiáng)。較佳復(fù)合酶種類(lèi)及酶解條件為大米蛋白濃度7.5%(w/v)、pH9、50℃、堿性蛋白酶添加量48 AU/Kg、90 min；胰蛋白酶添加量31.25 usp/mg、pH8.5、37℃、30 min。該條件下大米蛋白的DH為15.9%，酶解物Fe2+螯合活性及ABTS+·清除活性分別為78.6%、75.0%，表明大米蛋白的胰蛋白酶和堿性蛋白酶復(fù)合酶解物具有較高的抗氧化活性，可用于功能性食品。

大米蛋白；堿性蛋白酶；復(fù)合酶水解；體外抗氧化活性

Abstract：In order to investigate antioxidant activity of the hydrolysatesinvitroand optimize the process, rice protein was firstly hydrolyzed using Alcalase, then combined proteases hydrolysis was performed using Neutrase, Protamex, and Trypsin, respectively. Optimization of combined proteases types and conditions were obtained through analysis of hydrolysis degree (DH), peptide concentration, Fe2+chelating activity, and ABTS+·scavenging activity. The results showed that DH and peptide concentration, ABTS+·scavenging activity, and Fe2+chelating activity of the hydrolysates using Alcalase increased with an increase of hydrolysis times.The hydrolysate of rice protein with 15.9% of DH, 78.6% of Fe2+chelating activity, and 75.0% of ABTS+· scavenging activity was prepared with the optimized hydrolysis conditions (7.5% of rice protein, pH9, 50℃, 48AU/kg of the ratio to Alacalase and rice protein, and 90 min; 31.25 usp/mg of the ratio to Trypsin and rice protein, pH8.5, 37℃, 30 min). The findings indicated that the hydrolysate of rice protein through combined hydrolysis of Alcalase and Trypsin has higher antioxidant activityinvitroand allow for the application of functional foods.

Key words：rice protein; Alacalase; combined proteases hydrolysis; antioxidant activityinvitro

1 引言

近年來(lái)，有關(guān)大米安全問(wèn)題的報(bào)道越來(lái)越多，例如湖南鎘超標(biāo)的“鎘大米”和黑龍江普通稻米中添加香精加工成香米的“五常香米”等。這些大米由于不符合我國(guó)食品安全法對(duì)食品加工原料的要求而被廢棄，造成稻米資源的極大浪費(fèi)。大米蛋白不僅營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，而且具有良好的消化性和低的過(guò)敏性[1]。如果酶解這些“問(wèn)題大米”制備大米肽，不僅保留了大米蛋白的優(yōu)良特性，而且大米肽具有良好的溶解性、酸熱穩(wěn)定性，用于藥品、化妝品等非食品工業(yè)[2-3]，可為妥善處置這些“問(wèn)題大米”提供新途徑，避免資源浪費(fèi)。

測(cè)定抗氧化肽體外活性的方法較多，ABTS+·清除活性是使用最廣泛的間接測(cè)定方法，具有快速、簡(jiǎn)便、與抗氧化肽的生物活性相關(guān)性強(qiáng)等特點(diǎn)[4-6]。該方法的原理是抗氧化肽與強(qiáng)氧化劑氧化2,2’-聯(lián)氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺鹽(2,2’-azino-bis (3-ethyl benzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt，ABTS)生成的陽(yáng)離子自由基(相對(duì)穩(wěn)定的藍(lán)綠色溶液)反應(yīng)后，溶液顏色變淺，甚至無(wú)色[7]。Fe2+螯合活性的原理是在某些特定吸收波長(zhǎng)下，F(xiàn)e2+與螯合劑發(fā)生顯色反應(yīng)的產(chǎn)物具有吸收峰；加入的抗氧化肽螯合Fe2+，降低了顯色產(chǎn)物的濃度，吸光值減小[5-8]。因此，本文以ABTS+·清除活性及Fe2+螯合活性方法測(cè)定大米蛋白酶解物的體外抗氧化活性。

目前采用優(yōu)化單一蛋白酶的水解條件制備大米抗氧化肽，或從幾種蛋白酶中優(yōu)選一種酶制備具有抗氧化活性大米肽的報(bào)道較多[9-15]，但是采用復(fù)合酶分步水解大米蛋白制備抗氧化肽的研究較少。Chanput等采用胃蛋白酶(Pepsin)和胰蛋白酶(Trypsin)復(fù)合水解米糠蛋白，發(fā)現(xiàn)酶解物的體外抗氧化活性顯著高于米糠蛋白[16]。本文采用堿性蛋白酶(Alcalase)水解大米蛋白后，分別添加胰蛋白酶、復(fù)合蛋白酶(Protamex)及中性蛋白酶(Neutrase)復(fù)合水解，分析水解度(Degree of Hydrolysis, DH)及酶解物的肽濃度、Fe2+螯合活性及ABTS+·清除活性，確定較佳的復(fù)合酶種類(lèi)及酶解條件，以為大米蛋白酶法制備抗氧化肽的規(guī)?；a(chǎn)提供技術(shù)支撐，及重金屬污染稻米的合理利用提供新的思路。

2 材料與方法

2.1 材料與設(shè)備

大米蛋白(蛋白含量88.5%，水分含量4.07%，灰分含量2.6%；干基)金農(nóng)生物科技有限公司提供；堿性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶和復(fù)合蛋白酶 諾維信(中國(guó))生物技術(shù)有限公司提供；ABTS(產(chǎn)自加拿大)、菲啰嗪(Ferrozine，產(chǎn)自印度)購(gòu)于Sigma-Aldrich(上海)貿(mào)易有限公司；BSA(牛血清蛋白)、氯仿(CHCl3)、過(guò)硫酸鉀(K2S208)、氯化亞鐵(FeCl2)、鹽酸(HCl，優(yōu)級(jí)純)等購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

WFJ720型可見(jiàn)分光光度計(jì) 尤尼柯(上海)儀器有限公司；JK-MSH-Pro-40WL電動(dòng)攪拌機(jī) 上海精學(xué)科學(xué)儀器有限公司；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋 江蘇榮華儀器制造有限公司；WHY-2(SHA-B)往返水浴恒溫振蕩器 金壇梅香儀器有限公司；TGL-16C高速離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠(chǎng)；DELTA 320 pH計(jì) 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司。

2.2 方法

2.2.1 酶解條件

(1)堿性蛋白酶水解

參照蔡廣霞等[17]的方法。濃度為7.5%(w/v)的大米蛋白，在pH值為9，酶解溫度為50℃，堿性蛋白酶與大米蛋白比(E/S)為48AU/Kg的條件下，測(cè)定酶解15～180 min(15、30、60、90、120、180 min)的DH、肽濃度、螯合Fe2+活性及清除ABTS+·活性。

(2)復(fù)合酶水解

在堿性蛋白酶較佳酶解條件下，按照表1中三種蛋白酶的較佳條件調(diào)節(jié)溫度、pH值，分別添加復(fù)合酶(0.5、2.5、4.5，w/w)，測(cè)定酶解15～180 min(15、30、60、90、120、180 min)的DH、肽濃度、螯合Fe2+能力及清除ABTS+·活性。

表1 三種蛋白酶的酶解條件及底物特異性

酶種類(lèi)酶活力pH值溫度/℃底物特異性堿性蛋白酶2．4AU/g9．050疏水性氨基酸的羧基中性蛋白酶0．8AU/g7．050Tyr、Phe?、Trp的羧基復(fù)合蛋白酶1．5AU/g7．050位于肽鏈末端的疏水性氨基酸胰蛋白酶1250usp/mg8．537Lys、Arg的羧基

(3)取樣處理

酶解過(guò)程中，吸取酶解液5 mL至10 mL離心管中，分別滴加3滴HCl滅酶(1 mol/L)，以8000 r/min的速度離心10 min，將上清液置于冰箱冷臧室中貯藏(12 h)，備用。

2.2.2 DH的測(cè)定

參照J(rèn)ens 的方法[18-19]稍做修改，采用式(1)計(jì)算DH。

DH(%)=B·Nb·1/α·1/Mp·1/Htot×100

(1)

式中：

B—NaOH溶液體積，mL；

Nb—NaOH溶液的當(dāng)量濃度，mol/L；

Mp—大米蛋白的含量，g；

Htot—大米蛋白中的肽鍵總數(shù)，mmol/L；

α—α-氨基的解離度。

α-氨基的解離度參照式(2)計(jì)算。

α =(10pH-pK)/(1+10pH-pK)

(2)

式中：

pH—水解溶液的pH值；

pK-氨基的解離度常數(shù)，pK7.0。

2.2.3 肽濃度的測(cè)定

采用雙縮脲法測(cè)定肽濃度[20]。以牛血清白蛋白(BSA)濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo)、吸光度(波長(zhǎng)540 nm)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，曲線(xiàn)方程為y=0.0221x+0.0074(R2=0.9974)。

2.2.4 螯合Fe2+能力

參照Taheri等[8]的方法。在0.5 mL樣品中先后加入3.2 mL蒸餾水和0.1 mL的FeCl2溶液(2 mmol/L)，混勻并靜置3 min。再加入0.2 mL的菲啰嗪溶液(5 mmol/L)，混勻并反應(yīng)10 min后，于562 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度(以去離子水為空白組)。重復(fù)測(cè)定3次，取其平均值。采用式(3)計(jì)算Fe2+螯合率。

Fe2+螯合率/%=(1-A樣品/A空白)×100

(3)

2.2.5 清除ABTS+·自由基活性

參照蔡俊等[7]的方法。ABTS+·儲(chǔ)備液：取10 mL ABTS+·溶液(7 mmol/L)和5 mL K2S2O8溶液(7.35 mmol/L)混合，室溫下避光放置12～16 h，備用。ABTS+·工作液：無(wú)水乙醇稀釋ABTS+·儲(chǔ)備液至734 nm波長(zhǎng)處的吸光度為0.70。測(cè)定時(shí)吸取50 μL樣品，加入3 mL ABTS+·工作液混合均勻，室溫下反應(yīng)10 min后測(cè)定其吸光度(A樣品)，空白組以水代替樣品(A空白)。采用式(4)計(jì)算ABTS+·清除率。

ABTS+·清除率/%=(1-A樣品/A空白)×100

(4)

3 結(jié)果與分析

3.1 堿性蛋白酶水解

堿性蛋白酶水解大米蛋白的結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1-a可知，隨著酶解的進(jìn)行，DH一直增大(6.3%、12.6%、15.5%)。酶解過(guò)程中，酶解液肽濃度增加了55.9%，從23.6 mg/mL(15 min)增加到36.8 mg/mL(180 min)?？赡苁菈A性蛋白酶破壞了大米蛋白的肽鍵，將不溶性的大米蛋白水解成可溶性的多肽和游離氨基酸[19, 21]。

由圖1-b可以看出，隨著酶解的進(jìn)行，酶解液的Fe2+螯合活性及ABTS+·清除活性逐漸增強(qiáng)。15 min時(shí)，酶解液Fe2+螯合活性為3.2%， 90 min(29.8%)時(shí)增加了8.31倍，180 min(55.7%)時(shí)增加了16.4倍；酶解液ABTS+·清除活性為44.0%(15 min)，90 min(68.9%)時(shí)增加了56.6%，180 min(76.9%)時(shí)增加了74.8%。

堿性蛋白酶酶解液肽濃度的增加幅度均低于ABTS+·清除活性及Fe2+螯合活性，說(shuō)明肽濃度的增加是大米蛋白酶解物抗氧化活性增強(qiáng)的主要原因，而ABTS+·清除活性和Fe2+螯合活性增強(qiáng)可能是生成的多肽種類(lèi)及數(shù)量造成的[22-25]。酶解初期，大米蛋白酶解液的ABTS+·清除活性及Fe2+螯合活性隨著酶解時(shí)間的增加而增強(qiáng)，可能是大米蛋白被水解，多肽暴露或產(chǎn)生具有抗氧化活性的氨基酸側(cè)鏈和序列，因此表現(xiàn)出顯著的ABTS+·清除活性；酶解后期， ABTS+·清除活性增幅較緩的原因可能是大米蛋白的肽鍵數(shù)量減少，多肽含量增幅變緩。此外，堿性蛋白酶的進(jìn)一步水解影響了多肽中具有抗氧化活性的氨基酸基團(tuán)。由于具有Fe2+螯合活性的多肽、氨基酸濃度較低或結(jié)構(gòu)未暴露出來(lái)，因此酶解液Fe2+螯合活性在酶解初期較低；隨著酶解時(shí)間增加，F(xiàn)e2+螯合活性明顯增強(qiáng)，可能是大米蛋白的空間結(jié)構(gòu)、肽鍵被破壞，具有Fe2+螯合活性的多肽、游離氨基酸(例如組氨酸)濃度增大，或含有COO-的側(cè)鏈氨基酸從大米蛋白結(jié)構(gòu)中暴露出來(lái)。

水解過(guò)程中，雖然酶解液的抗氧化活性一直增強(qiáng)，但90 min后增加趨勢(shì)變平緩?？紤]后續(xù)復(fù)合酶解，選擇90 min為堿性蛋白酶的較佳酶解時(shí)間。

圖1 堿性蛋白酶水解大米蛋白的DH、肽濃度及酶解物的體外抗氧化活性

3.2 中性蛋白酶水解

3.2.1 DH

從圖2-a可知，酶解初期，DH隨時(shí)間的延長(zhǎng)快速增加，30～120 min時(shí)，DH平穩(wěn)增大，120～180 min時(shí)，DH增幅很小，幾乎不變?？赡苁侵行缘鞍酌杆饬舜竺椎鞍椎碾逆I，酶解液中多肽和游離氨基酸含量增加，DH增大。酶解初期，大米蛋白中的酶切位點(diǎn)較多，水解速度快，多肽和游離氨基酸含量迅速增加，DH增幅明顯；隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，大米蛋白中酶切位點(diǎn)減少以及酶開(kāi)始失活，120 min后DH的增幅變緩[19,24]。

添加中性蛋白酶后，雖然整個(gè)酶解過(guò)程中DH一直增加，且三組酶添加量的增幅差異不顯著(分別為10.96%、10.63%、10.90%)，但是酶添加量為4 AU/mg時(shí)，相同時(shí)間的DH均最小。此外，酶解中期酶添加量為20 AU/mg時(shí)的DH略大于36 AU/mg，而酶解后期差異不顯著?？赡苁敲柑砑恿枯^低時(shí)，酶與充足的大米蛋白肽鍵接觸，使DH增大，但是當(dāng)酶添加量過(guò)高時(shí)，部分酶不能與大米蛋白肽鍵充分接觸，因此DH增幅不顯著。酶解過(guò)程結(jié)束時(shí)DH為13.87%～14.26%，與未添加中性蛋白酶相比，增幅為10.08%～13.17%。

3.2.2 肽濃度

由圖2-b可知，在堿性蛋白酶的水解液中添加中性蛋白酶后，不同酶添加量(4 AU/mg、20 AU/mg、36 AU/mg)條件下，肽濃度均有不同程度的增加。酶解初期，肽濃度緩慢上升，直到120 min后，肽濃度增大明顯并趨于穩(wěn)定。中性蛋白添加量為4 AU/mg時(shí)，整個(gè)酶解過(guò)程中肽濃度變化不明顯。酶添加量增至20 AU/mg時(shí)，初期肽濃度與酶添加量4 AU/mg時(shí)相差不大，中后期肽濃度明顯增加。酶添加量增大至36 AU/mg時(shí)，后期雖然肽濃度明顯增加，但始終低于酶添加量為4或20 AU/mg組。酶解結(jié)束時(shí)肽濃度為28.8～30.2 mg/mL，與未添加中性蛋白酶相比略有降低。

3.2.3 ABTS+·清除活性

圖2-c可知，添加中性蛋白酶后，酶添加量為4 AU/mg 和36 AU/mg的大米蛋白酶解液ABTS+·清除活性差異不顯著，且明顯小于20 AU/mg組。而酶添加量為20 AU/mg時(shí)，酶解液的ABTS+·清除活性從69.3%(15 min)增強(qiáng)到77.9%(18 min)，增幅為12.41%。酶解過(guò)程結(jié)束時(shí)ABTS+·清除活性為65.4%～77.9%。與未添加中性蛋白酶相比，增幅為-5.08%～13.06%。

3.2.4 Fe2+螯合活性

從圖2-d可知，添加中性蛋白酶后，大米蛋白酶解液的Fe2+螯合活性雖整體增強(qiáng)，但不同酶添加量的增強(qiáng)幅度差異明顯。當(dāng)酶添加量為20 AU/mg時(shí)，F(xiàn)e2+螯合活性從20.6%(15 min)增強(qiáng)到29.5%(90 min)，增幅為43.20%，反應(yīng)結(jié)束時(shí)Fe2+螯合活性為30.0%。整個(gè)酶解過(guò)程中，與酶添加量為4或36 AU/mg 組的Fe2+螯合活性相比，20 AU/mg組的明顯增大，且逐步增強(qiáng)。酶解過(guò)程結(jié)束時(shí)Fe2+螯合活性為22.2～30.0%，略低于未添加中性蛋白酶時(shí)。

圖2 中性蛋白酶復(fù)合水解大米蛋白的DH、肽濃度及酶解物的體外抗氧化活性

3.3 復(fù)合蛋白酶水解

3.3.1 DH

由圖3-a可知，添加復(fù)合蛋白酶后，DH隨反應(yīng)時(shí)間的增加而上升。當(dāng)酶添加量為7.5 AU/mg時(shí)DH始終最小，但與酶添加量為37.5 AU/mg時(shí)的DH增大幅度基本一致。當(dāng)酶添加量增至67.5 AU/mg時(shí)，水解速率和DH增大幅度均與7.5 AU/mg時(shí)相差不大，酶解結(jié)束時(shí)的DH分別為14.48%(67.5 AU/mg)和14.34%(37.5 AU/mg)。酶解過(guò)程結(jié)束時(shí)DH為13.17%～14.48%，與未添加復(fù)合蛋白酶相比增幅為4.5%～14.9%。

3.3.2 肽濃度

由圖3-b可知，添加復(fù)合蛋白酶后，三組酶添加量的肽濃度在酶解過(guò)程都略有增加，但增幅差異明顯。復(fù)合蛋白酶添加量為7.5 AU/mg時(shí)，隨著反應(yīng)時(shí)間的增加肽濃度基本保持不變，反應(yīng)結(jié)束時(shí)增幅僅為0.7%；酶添加量為37.5 AU/mg時(shí)，酶解初期肽濃度明顯增大，30 min后保持平穩(wěn)，酶解結(jié)束時(shí)增幅為3.3%；繼續(xù)增大酶添加量至67.5 AU/mg，酶解初期的肽濃度輕微增大，90～120 min時(shí)肽濃度快速增加，120 min后緩慢增加，最終增幅為6%。180 min時(shí)肽濃度達(dá)到最高值28.4%(67.5AU/mg)，但與未添加復(fù)合蛋白酶相比，略有降低。

3.3.3 ABTS+·清除活性

從圖3-c可知，添加復(fù)合蛋白酶后， ABTS+·清除活性逐漸增強(qiáng)。15～30 min時(shí)ABTS+·清除活性明顯增大，30～120 min時(shí)ABTS+·清除活性均不同程度地增強(qiáng)且有波動(dòng)，120 min到酶解結(jié)束時(shí)， ABTS+·清除活性逐漸增強(qiáng)。

三組酶添加量的大米蛋白酶解液的ABTS+·清除活性增幅分別為11.4%(7.5 AU/mg)、11.0%(37.5 AU/mg)和8.8%(67.5 AU/mg)。雖然7.5 AU/mg和37.5 AU/mg時(shí)增幅相差不大，但是整個(gè)酶解過(guò)程中37.5 AU/mg組的ABTS+·清除活性始終強(qiáng)于另兩組。酶解過(guò)程結(jié)束時(shí)ABTS+·清除活性最高，為75.5%(37.5 AU/mg)。與未添加復(fù)合蛋白酶相比，最終增幅為9.58%。

3.3.4 Fe2+螯合活性

從圖3-d可知，在堿性蛋白酶酶解液中添加復(fù)合蛋白酶，整個(gè)酶解過(guò)程中大米蛋白酶解液的Fe2+螯合活性隨反應(yīng)時(shí)間的增加有不同程度的增強(qiáng)，但是三組酶添加量時(shí)，F(xiàn)e2+螯合活性及其增強(qiáng)幅度差異比較明顯。

三組酶添加量的Fe2+螯合活性增幅分別為21.7%(7.5 AU/mg)、32.1%(37.5 AU/mg)和18.5%(67.5 AU/mg)，其中酶添加量為7.5 AU/mg時(shí)，酶解初期Fe2+螯合活性幾乎不變，90 min后雖然增強(qiáng)，但始終低于另外兩組酶添加量的Fe2+螯合活性。酶添加量增至37.5 AU/mg時(shí)，F(xiàn)e2+螯合活性明顯增強(qiáng)，120 min后基本保持不變。酶添加量增加至67.5 AU/mg時(shí)，F(xiàn)e2+螯合活性與37.5 AU/mg時(shí)變化不大且比較穩(wěn)定。酶解過(guò)程結(jié)束時(shí)酶解液Fe2+螯合活性最強(qiáng)，為42.3%，增幅為41.95%。

圖3 復(fù)合蛋白酶復(fù)合水解大米蛋白的DH、肽濃度及酶解物的體外抗氧化活性

添加復(fù)合蛋白酶后，酶解15 min時(shí)肽濃度增大緩慢，說(shuō)明生成了更多的寡肽、氨基酸等物質(zhì)，而酶解初期ABTS+·清除活性保持穩(wěn)定，之后略微增強(qiáng)，說(shuō)明被酶解的多肽產(chǎn)生的寡肽、氨基酸等增強(qiáng)了該活性。酶添加量為37.5 AU/mg、67.5 AU/mg的復(fù)合蛋白酶解液Fe2+螯合活性增大，可能是新生成的寡肽、氨基酸等物質(zhì)的含量增加，使該活性增強(qiáng)。隨著酶解進(jìn)行，酶解液Fe2+螯合活性增幅變緩，可能原因是不斷有多肽被進(jìn)一步水解成寡肽、游離氨基酸。

3.4 胰蛋白酶水解

3.4.1 DH

由圖4-a可知，添加胰蛋白酶后，三組酶添加量的DH均隨時(shí)間的增加而上升，且增幅基本保持一致。當(dāng)水解時(shí)間為15～30 min時(shí)，DH增加較快，隨后增速變緩。相同水解時(shí)間，DH隨著酶添加量的增加顯著上升，酶解結(jié)束時(shí)DH最低為16.69%(6.25 usp/mg)，最高為18.65%(56.25 usp/mg)，均高于相同酶添加量的中性蛋白酶和復(fù)合蛋白酶。

3.4.2 肽濃度

由圖4-b可知，添加胰蛋白酶后，肽濃度均有一定程度的增大，30～180 min時(shí)，肽濃度緩慢增加。胰蛋白酶添加量為6.25 usp/mg時(shí)，肽濃度在15～30 min明顯增大，之后幾乎保持不變；酶添加量增至31.25 usp/mg時(shí)，15～30 min肽濃度迅速增加，且30 min后肽濃度均比6.25 usp/mg組的高；酶添加量增至56.25 usp/mg時(shí)，增幅雖然低于6.25 usp/mg組和31.25 usp/mg組的肽濃度，但是肽濃度在三組酶添加量中始終最高。酶解過(guò)程結(jié)束時(shí)肽濃度為30.9～33.6 mg/mL，高于相同酶添加量的中性蛋白酶和復(fù)合蛋白酶。

3.4.3 ABTS+·清除活性

從圖4-c可知，不同胰蛋白酶酶添加量條件下ABTS+·清除活性均有所增強(qiáng)，且不同酶添加量的清除活性差別不顯著，可見(jiàn)酶添加量對(duì)ABTS+·清除活性的影響不大。15～90 min時(shí)， ABTS+·清除活性略有增強(qiáng)，90～180 min增長(zhǎng)放緩且出現(xiàn)波動(dòng)。酶添加量為56.25 usp/mg時(shí)，ABTS+·清除活性始終低于另兩組，酶解初期酶添加量為31.25 usp/mg組的ABTS+·清除活性略低于56.25 usp/mg組，后期則相反。酶解結(jié)束時(shí)ABTS+·清除活性最高為81.6%，與未添加胰蛋白酶的ABTS+·清除活性相比，增幅為18.43%，且高于相同酶添加量的中性蛋白酶和復(fù)合蛋白酶。

3.4.4 Fe2+螯合活性

從圖4-d可知，添加胰蛋白酶后，F(xiàn)e2+螯合活性隨反應(yīng)時(shí)間的增長(zhǎng)逐漸增強(qiáng)。并且60～180 min時(shí)，F(xiàn)e2+螯合活性增幅減緩，且具有波動(dòng)性。酶添加量為6.25 usp/mg時(shí)，F(xiàn)e2+螯合活性增強(qiáng)明顯，尤其是15～60 min時(shí)Fe2+螯合活性迅速增強(qiáng)，之后增幅減小。雖然反應(yīng)結(jié)束時(shí)6.25 usp/mg增幅為36.7%，明顯大于另外兩組(31.25 usp/mg時(shí)26.6%，56.25 usp/mg時(shí)24%)，但是Fe2+螯合活性始終低于另外兩組。酶添加量增至31.25 usp/mg時(shí)，F(xiàn)e2+螯合活性不斷增強(qiáng)，且與另外兩組酶添加量相比，酶解液Fe2+螯合活性雖然增幅不是最大，但各反應(yīng)階段Fe2+螯合活性都最強(qiáng)。繼續(xù)增大酶添加量，F(xiàn)e2+螯合活性雖緩慢增強(qiáng)，但仍略低于31.25 usp/mg組，直至反應(yīng)結(jié)束。酶解結(jié)束時(shí)Fe2+螯合活性為82.0%～93.3%，增加了1.75～2.13倍，高于相同酶添加量的中性蛋白酶和復(fù)合蛋白酶。

圖4 胰蛋白酶復(fù)合水解大米蛋白的DH、肽濃度及酶解物的體外抗氧化活性

胰蛋白酶復(fù)合水解大米蛋白的DH、肽濃度均比只用堿性蛋白酶高，可能是由于堿性蛋白酶水解大米蛋白時(shí)的作用位點(diǎn)主要是羧基端為疏水性氨基酸形成的肽鍵，而疏水性氨基酸主要在蛋白質(zhì)內(nèi)部，利用其疏水相互作用，保持蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定[26]。堿性蛋白酶水解液再用胰蛋白酶復(fù)合水解，使得賴(lài)氨酸、精氨酸組成的肽鍵進(jìn)一步水解。由于中性蛋白酶作用的結(jié)合位點(diǎn)主要有色氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸等疏水性氨基酸的羧基；復(fù)合蛋白酶的作用位點(diǎn)主要是位于肽鏈末端的疏水性氨基酸，二種蛋白酶與堿性蛋白酶的作用位點(diǎn)類(lèi)似，隨著堿性蛋白酶水解的時(shí)間延長(zhǎng)，大米蛋白的肽鍵逐漸被消耗，酶解位點(diǎn)減少，因此，用中性蛋白酶和復(fù)合蛋白酶水解時(shí)，DH、肽濃度的增加不明顯，導(dǎo)致胰蛋白酶復(fù)合水解的酶解物的DH、肽濃度高于中性蛋白酶、復(fù)合蛋白酶。

胰蛋白酶復(fù)合水解的酶解物的Fe2+螯合活性均高于中性蛋白酶、復(fù)合蛋白酶，可能是酶解物中較高濃度的寡肽和游離氨基酸含有更多的配位原子，能螯合更多的Fe2+。此外，胰蛋白酶復(fù)合水解的酶解物中含有較多的天冬氨酸、谷氨酸、組氨酸、半胱氨酸等，高Fe2+螯合活性可能與這些特定的氨基酸有關(guān)[27, 28]。胰蛋白酶復(fù)合水解的酶解物的ABTS+清除活性明顯高于中性蛋白酶、復(fù)合蛋白酶，可能是由于該酶解物較高的寡肽和游離氨基酸濃度，能釋放出更多的抗氧化性基團(tuán)，這些基團(tuán)與ABTS+·發(fā)生反應(yīng)使反應(yīng)體系褪色，即ABTS+·清除活性較強(qiáng)[24]。

綜合上述試驗(yàn)結(jié)果，確定大米蛋白復(fù)合酶解制備高活性抗氧化肽的較佳條件為：7.5%(w/v)的大米蛋白，堿性蛋白酶水解的pH值為9、50℃、酶添加量為48 AU/Kg，90 min；胰蛋白酶水解的pH值為8.5、37℃、酶添加量為31.25 usp/mg、30 min。

4 結(jié)論

胰蛋白酶、復(fù)合蛋白酶、中性蛋白酶三種蛋白酶中，胰蛋白酶與堿性蛋白酶復(fù)合水解大米蛋白的酶解液抗氧化活性最強(qiáng)，并且Fe2+螯合活性及ABTS+·清除活性明顯高于堿性蛋白酶單獨(dú)水解的酶解液。

復(fù)合酶解反應(yīng)的較佳條件為：7.5%(w/v)的大米蛋白、堿性蛋白酶水解的pH值為9、50℃、酶添加量為48AU/Kg、90 min；胰蛋白酶水解的pH值為8.5、37℃、酶添加量為31.25 usp/mg、30 min。在該條件下制備的大米蛋白酶解物具有較高的ABTS+·清除活性及Fe2+螯合活性，可以用于指導(dǎo)大米蛋白酶法制備抗氧化肽的規(guī)?；a(chǎn)。

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Combined proteases hydrolysis of rice protein and antioxidant activity of the hydrolysatesinvitro

PENGLan-lan1，CHENJi-wang1,2，CAIJun1,DINGWen-ping1,2,WUYong-ning1,2

(1.College of Food Science and Engineering, Wuhan Polytechnic University , Wuhan 430023, China; 2.Hubei Collaborative Innovation Center for Processing of Agricultural Products, Wuhan 430023, China)

2017-07-08.

彭斕蘭(1991-)，女，碩士，E-mail：Peng-lanlan @outlook.com.

陳季旺(1970-)，男，教授，博士，E-mail：jiwangchen1970@126.com.

糧食公益性行業(yè)科研專(zhuān)項(xiàng)(201513006-3)；湖北省自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(2014CFB888)；武漢市國(guó)際合作項(xiàng)目(201231234466)；武漢輕工大學(xué)研究生創(chuàng)新基金項(xiàng)目(2014cx013).

2095-7386(2017)03-0014-09

10.3969/j.issn.2095-7386.2017.03.003

TS 103.84+3

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