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    Plackett-Burman和響應(yīng)面法優(yōu)化CHO細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基中關(guān)鍵營(yíng)養(yǎng)成分

    2017-10-13 08:57:20蔣飛黔四川大學(xué)生物治療國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室四川成都610041
    化工管理 2017年27期
    關(guān)鍵詞:磷酸二氫鈉腐胺煙酰胺

    蔣飛黔(四川大學(xué),生物治療國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,四川 成都 610041)

    Plackett-Burman和響應(yīng)面法優(yōu)化CHO細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基中關(guān)鍵營(yíng)養(yǎng)成分

    蔣飛黔(四川大學(xué),生物治療國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,四川 成都 610041)

    為了提高CHO細(xì)胞在無(wú)血清培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)和蛋白表達(dá)能力。通過(guò)文獻(xiàn)選擇16種物質(zhì),利用Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)法篩選有出顯著影響的4種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),再使用中心復(fù)合設(shè)計(jì)響應(yīng)面法優(yōu)化各成分含量,得到最優(yōu)配比為腐胺0.07mg/L、檸檬酸鐵132.5mg/L、磷酸二氫鈉0.84mg/L和煙酰胺2mg/L,優(yōu)化后獲得無(wú)血清培養(yǎng)基性能優(yōu)于同類(lèi)商品化培養(yǎng)基。

    Plackett-Burman;響應(yīng)面;CHO細(xì)胞;無(wú)血清培養(yǎng)基

    中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(Chinese Hamster Ovary,CHO)是目前生產(chǎn)重組蛋白的主要宿主細(xì)胞,廣泛應(yīng)用于藥物生產(chǎn)領(lǐng)域。CHO細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)能很好的指導(dǎo)蛋白質(zhì)的正確折疊,提供復(fù)雜的糖基化等修飾和加工;其表達(dá)蛋白的理化性質(zhì)、分子結(jié)構(gòu)及生物學(xué)活性等接近天然的生物蛋白分子[1]。CHO細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基是在DMEM∕F12基礎(chǔ)上添加生長(zhǎng)因子、氨基酸、維生素和微量元素等組成[2],能減少生產(chǎn)難度也能穩(wěn)定產(chǎn)品質(zhì)量。

    本研究目的是開(kāi)發(fā)CHO細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基用于表達(dá)VEG?FR-FC融合蛋白,其作用為抑制腫瘤部位的血管新生而達(dá)到治療目的。本實(shí)驗(yàn)以細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)和表達(dá)量為評(píng)價(jià)指標(biāo),通過(guò)Plackett-Burman法篩選關(guān)鍵成分再使用響應(yīng)面法優(yōu)化其中含量[3-4]。

    1 材料和方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)材料

    1.1.1 細(xì)胞

    CHO細(xì)胞,表達(dá)VEGFR-FC。

    1.1.2 試劑

    DMEM∕F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基購(gòu)自Gbico公司;營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)購(gòu)自Sig?ma-Aldrich公司。

    1.1.3 設(shè)備與儀器

    二氧化碳培養(yǎng)箱,Kuhner公司ISF1-X;細(xì)胞計(jì)數(shù)儀,Beck?man公司ViCell Counter;高效液相色譜儀,Agilent公司1200。

    1.2 實(shí)驗(yàn)方法

    1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

    細(xì)胞復(fù)蘇后離心重懸至搖瓶培養(yǎng),每培養(yǎng)72h時(shí)取樣計(jì)數(shù),按稀釋密度3-5×105cells∕mL再次傳代;隨后按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)接種至250mL搖瓶,每瓶培養(yǎng)體積50mL,培養(yǎng)條件:溫度36.5℃、CO2濃度5%。

    1.2.2 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

    通過(guò)查閱文獻(xiàn)匯總了對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)與表達(dá)影響較大的16個(gè)主要營(yíng)養(yǎng)成分,增加2個(gè)虛擬變量考察誤差,各因子信息見(jiàn)表1。采用Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法安排20次實(shí)驗(yàn)。

    表1 Plackett-Burman設(shè)計(jì)因子及濃度

    1.2.3 響應(yīng)面設(shè)計(jì)

    經(jīng)篩選實(shí)驗(yàn)后分析結(jié)果,采取蛋白產(chǎn)量?jī)?yōu)先,活細(xì)胞密度其次的選擇策略共得到4個(gè)關(guān)鍵因子:腐胺、檸檬酸鐵、磷酸二氫鈉和煙酰胺,參考表1中因子含量水平并擴(kuò)大±0.5倍濃度進(jìn)行響應(yīng)面分析。采用中心復(fù)合設(shè)計(jì)方法共設(shè)計(jì)30次實(shí)驗(yàn)。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 主要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)篩選

    Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1并利用Minitab統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析,由于實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中包含混雜和搖瓶實(shí)驗(yàn)存在誤差,故顯著性水平設(shè)定為0.1。分別以蛋白表達(dá)量和最高活細(xì)胞密度為響應(yīng),初篩得到關(guān)鍵影響營(yíng)養(yǎng)因子為:腐胺、檸檬酸鐵、磷酸二氫鈉和煙酰胺。

    圖1 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)結(jié)果

    圖2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果

    2.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

    響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖2,利用Minitab統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行GLM擬合和方差分析。結(jié)果中以活細(xì)胞密度為響應(yīng)的模型失擬項(xiàng)PValue=0.893,以蛋白表達(dá)量為響應(yīng)的模型失擬項(xiàng)P-Value=0.815,說(shuō)明擬合結(jié)果均可用。

    得到活細(xì)胞密度和蛋白表達(dá)量的擬合二次方程如下:

    圖3 各組分對(duì)活細(xì)胞密度的響應(yīng)圖

    圖4 各組分對(duì)蛋白表達(dá)量的響應(yīng)圖

    對(duì)兩組回歸方程做等高線響應(yīng)圖分別見(jiàn)圖3、圖4。圖3顯示B、C項(xiàng)對(duì)活細(xì)胞密度有顯著影響,A與C項(xiàng)存在較強(qiáng)的交互作用;圖4顯示A、B、D和C依次對(duì)蛋白表達(dá)有顯著影響,A與D項(xiàng)存在較強(qiáng)的交互作用。

    組合兩組回歸方程以最大值為目標(biāo)求解可得,當(dāng)A(腐胺)=0.07mg∕L、B(檸檬酸鐵)=132.5mg∕L、C(磷酸二氫鈉)=0.84mg∕L、D(煙酰胺)=2mg∕L時(shí)活細(xì)胞密度和蛋白產(chǎn)量最高,其預(yù)測(cè)值為活細(xì)胞密度38.23×105cells∕mL,蛋白表達(dá)量236.85mg∕L。

    3 結(jié)語(yǔ)

    無(wú)血清培養(yǎng)基中通常以商業(yè)化DMEM∕F12作為基礎(chǔ),組合不同營(yíng)養(yǎng)成分取代血清來(lái)滿足細(xì)胞生長(zhǎng)。但由于成分眾多且復(fù)雜對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和代謝的影響是不同的,通過(guò)文獻(xiàn)選取其中16種物質(zhì),經(jīng)過(guò)篩選和評(píng)估實(shí)驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)其中腐胺、檸檬酸鐵對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有顯著的促進(jìn)作用,而腐胺、檸檬酸鐵、煙酰胺和磷酸二氫鈉對(duì)細(xì)胞蛋白表達(dá)促進(jìn)作用依次增大。優(yōu)化含量后所獲得的自研無(wú)血清培養(yǎng)基能較好的滿足CHO細(xì)胞生長(zhǎng)和表達(dá),其性能可達(dá)到或優(yōu)于商品化培養(yǎng)基。

    結(jié)果證明,Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和響應(yīng)面優(yōu)化法相結(jié)合的統(tǒng)計(jì)方法能快速、有效地篩選出能影響CHO細(xì)胞生長(zhǎng)與表達(dá)的營(yíng)養(yǎng)因子,并能通過(guò)優(yōu)化得到最佳成分配比。最終能增加CHO細(xì)胞蛋白表達(dá)量也有利于減低生產(chǎn)成本。

    [1]劉定燮周曉巍黃培堂.哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)及其研究進(jìn)展[J].生物技術(shù)通訊,2003,04:308-311.

    [2]Huang Y M,Hu W,Rustandi E,et al.Maximizing produc?tivity of CHO cell-based fed-batch culture using chemically de?fined media conditions and typical manufacturing equipment.[J].Biotechnology Progress,2010,26(5):1400.

    [3]Chun C,Heineken K,Szeto D,et al.Application of Factori?al Design to Accelerate Identification of CHO Growth Factor Re?quirements[J].Biotechnology Progress,2003,19(1):52-7.

    [4]Vohra A,Satyanarayana T.Statistical optimization of the medium components by response surface methodology to enhance phytase production by Pichia anomala[J].Process Biochemistry,2002,37(9):999-1004.

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