煙草內(nèi)生真菌多樣性及其功能研究進(jìn)展

張 鵬，李盼盼，高 林，杜詠梅，劉新民，張忠鋒，申國明

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煙草內(nèi)生真菌多樣性及其功能研究進(jìn)展

張 鵬，李盼盼，高 林，杜詠梅，劉新民，張忠鋒，申國明*

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，青島 266101）

煙草內(nèi)生真菌是煙田微生物生態(tài)的重要組成部分。其種類豐富，生物學(xué)功能多樣，對促進(jìn)煙苗生長、提高宿主的生態(tài)適應(yīng)性、降低煙草有害物質(zhì)等方面具有積極作用，在醫(yī)藥、植物生長促進(jìn)劑、生物農(nóng)藥等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。從煙草內(nèi)生真菌的分離鑒定方法、生物多樣性和種群分布特征、功能應(yīng)用以及開發(fā)應(yīng)用前景方面，對煙草內(nèi)生真菌當(dāng)前的研究狀況進(jìn)行了概述，歸納出煙草內(nèi)生真菌在不同時(shí)期的主要分布規(guī)律及當(dāng)前的應(yīng)用現(xiàn)狀。最后，分析了當(dāng)前研究面臨的難題及發(fā)展趨勢，并對其應(yīng)用前景進(jìn)行了展望。

煙草；內(nèi)生真菌；生物多樣性；功能應(yīng)用

植物內(nèi)生真菌（endophyte）是指在其生活史的一定階段或全部階段生活在健康植物各種組織和器官內(nèi)部或者組織間隙中的一類真菌[1]。其與宿主植物建立了和諧的互利共生關(guān)系，是植物體微生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分。內(nèi)生真菌在植物生長發(fā)育及抵抗生物、非生物脅迫中發(fā)揮著重要作用[2]。研究表明內(nèi)生真菌能促進(jìn)植物生長，誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗病性，提高植物對重金屬的耐性，減輕重金屬對植物的不良影響，等[3-7]。植物內(nèi)生真菌分布廣泛、活性多樣，已在禾本科植物[8-9]、藥用植物[10-13]、海洋植物[14-16]等多種植物中得到研究。此外，近年來的研究表明，生活在植物體這一特殊生態(tài)環(huán)境中的內(nèi)生真菌能夠與宿主發(fā)生協(xié)同進(jìn)化，產(chǎn)生與宿主相同或相似的活性次級代謝產(chǎn)物，包括抑菌物質(zhì)[17-19]、抗腫瘤物質(zhì)[20-23]、促生長因子[24-25]、抗氧化活性物質(zhì)[26-27]等，在醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)領(lǐng)域有很大的應(yīng)用潛力[28]。

煙草內(nèi)生真菌廣泛分布于煙草根、莖、葉中，具有豐富的生物多樣性[29]。煙草內(nèi)生真菌是煙田微生物生態(tài)的重要組成，發(fā)掘利用煙草內(nèi)生真菌資源，對促進(jìn)煙草的生長、提高煙草品質(zhì)和抗逆性（抗病蟲害、抗重金屬和抗干旱脅迫）等具有積極的作用。筆者基于近年來相關(guān)文獻(xiàn)，綜述了煙草內(nèi)生真菌資源的生物多樣性，總結(jié)了其在煙草不同部位不同生長時(shí)期的分布規(guī)律及其在煙草栽培和生產(chǎn)中的功能應(yīng)用，同時(shí)討論了煙草內(nèi)生真菌的應(yīng)用前景，為煙草內(nèi)生真菌資源的充分利用、煙草農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的健康可持續(xù)發(fā)展進(jìn)行了探討。

1 煙草內(nèi)生真菌的分離及種屬鑒定

1.1 內(nèi)生真菌的分離

煙草內(nèi)生真菌的分離通常采用組織分離法[30]。煙草樣品的采集：選擇不同生長時(shí)期的煙草植株（苗期、團(tuán)棵期、旺長期和成熟期），對其根、莖、葉等不同部位分別采集。表面消毒：表面消毒是內(nèi)生真菌研究的關(guān)鍵，其效果影響內(nèi)生真菌的分離效果。通常采用“75%乙醇-2.5%次氯酸鈉-75%乙醇”三步消毒法滅活煙草表面微生物，也有文獻(xiàn)報(bào)道采用表面消毒劑，如升汞、H2O2、次氯酸鈉、DMSO等表面消毒劑進(jìn)行消毒然后用無菌水沖洗[31]。培養(yǎng)方法：將表面消毒后的內(nèi)部組織切成小塊，切口放置于培養(yǎng)基上于28 ℃培養(yǎng)，或者在無菌條件下加無菌水充分研磨，梯度稀釋后進(jìn)行平板涂布[32]。培養(yǎng)基的選擇：分離內(nèi)生真菌常用的培養(yǎng)基有PDA培養(yǎng)基，Martin瓊脂培養(yǎng)基，察氏瓊脂培養(yǎng)基，麥芽汁培養(yǎng)基，Pfeffer液體培養(yǎng)基，Sabouraud瓊脂培養(yǎng)基，玉米粉瓊脂培養(yǎng)基等[33]。針對煙草等易生霉材料，常用PDA培養(yǎng)基和察氏培養(yǎng)基[31]。為了抑制平板中細(xì)菌或其他雜菌的生長，通常在培養(yǎng)基中選擇性添加生長抑制劑和抗生素，如兩性霉素（Amphotericin B）、鏈霉素（Streptomycin）、萬古霉素（Vancomycin）、利福平（Rifampicin）等。

1.2 內(nèi)生真菌的鑒定

內(nèi)生真菌的鑒定采用形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)相結(jié)合的方法[34]。形態(tài)學(xué)鑒定主要是根據(jù)菌落形態(tài)特點(diǎn)、產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)、孢子形態(tài)等進(jìn)行分別與鑒定，以真菌生理生化和生態(tài)特征等作為輔助來鑒別其類別。絲狀真菌的菌落形態(tài)特點(diǎn)是鑒別的重要依據(jù)，如菌落大小、顏色、表面紋飾、質(zhì)地和邊緣等，個(gè)體形態(tài)有菌絲特征、子實(shí)體形態(tài)、孢子形態(tài)等。在培養(yǎng)過程中，有些真菌不能產(chǎn)生可鑒別的結(jié)構(gòu)或者不產(chǎn)生孢子，因此需要在培養(yǎng)基中添加誘導(dǎo)因子或選擇合適的生長條件（如12 h白光，12 h紫外照射等）來誘導(dǎo)產(chǎn)孢。分子生物學(xué)鑒定一般通過rDNA序列的比較分析，目前應(yīng)用最廣泛的是rDNA-ITS序列分析技術(shù)。該技術(shù)利用真菌ITS序列的高度重復(fù)性和保守性，基于分子水平對真菌進(jìn)行種屬鑒定[35]，同時(shí)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育樹，來闡明系統(tǒng)發(fā)育情況[34]。內(nèi)生真菌鑒定的一般策略如圖1[36-37]。

2 煙草內(nèi)生真菌多樣性及分布特征

內(nèi)生真菌廣泛分布于煙草的各組織部位及煙草不同生長時(shí)期中，具有豐富的生物多樣性。

圖1 內(nèi)生真菌鑒定的一般策略[36-37]

韓偉[38]從云南省主要煙草種植區(qū)采集的煙草植株中分離獲得186個(gè)內(nèi)生真菌菌株，誘導(dǎo)了70個(gè)菌株產(chǎn)孢，鑒定為7屬10種，包括：鏈格孢屬（）、鐮孢霉屬（、小叢殼屬（）、黑孢屬（）、擬盤多毛孢屬（）、莖點(diǎn)霉屬（）和黑痣菌屬（。其中，柑橘鏈格孢是優(yōu)勢菌株，存在于煙草的整個(gè)生育期，在煙草莖、葉中都有分布，是煙草內(nèi)生真菌的優(yōu)勢種。黑痣菌屬的和只存在于葉中，莖點(diǎn)霉屬的和只存在于莖中，表現(xiàn)出組織?；?。煙草內(nèi)生真菌種群隨生育期延長呈遞增趨勢，至成熟期數(shù)量、種類最多。

裴洲洋[39]以河南省田間種植的9個(gè)煙草品種的根、莖、葉為試驗(yàn)材料，對不同生育期中內(nèi)生真菌的多樣性及其動態(tài)分布規(guī)律進(jìn)行了研究。共分離了977株菌株，誘導(dǎo)了943株菌株產(chǎn)孢，鑒定為15屬，包括：鏈格孢屬、曲霉屬（）、平臍蠕孢屬（）、毛殼菌屬（）、炭疽菌屬（）、彎孢屬（）、凸臍蠕孢屬（）、鐮孢菌屬、黑孢屬、青霉屬（）、擬盤多毛孢屬、莖點(diǎn)霉屬、黑痣菌屬、木霉菌屬（）和單端孢屬（）。其中和是優(yōu)勢屬。從整個(gè)生育期內(nèi)生真菌動態(tài)分布來看，從團(tuán)棵期開始，內(nèi)生真菌數(shù)量和種類都顯著增加，至成熟期菌群豐度達(dá)到最大；煙草不同部位中，葉帶菌量最多，根最少，表明煙草的不同部位內(nèi)生真菌的數(shù)量和種群均存在差異；在菌群年際變動趨勢上（僅針對2007年和2008比較），發(fā)現(xiàn)個(gè)別菌群不同年度出現(xiàn)率不同，表明煙草內(nèi)生真菌菌群具有隨著時(shí)間變動而變化的趨勢，這種趨勢可能與煙草的生長發(fā)育、氣候條件、自然環(huán)境及田間生長狀態(tài)等因素有關(guān)。

李文君[40]對云南大理煙草內(nèi)生菌群多樣性及動態(tài)差異進(jìn)行了研究。從大理5個(gè)種植地區(qū)采集的131份煙葉樣品中，分離得到內(nèi)生真菌共1586株，通過形態(tài)學(xué)和ITS-rDNA基因擴(kuò)增測序，鑒定為31屬129種。其中，在屬的水平上，和為優(yōu)勢菌群。另外，鑒定了常見屬9個(gè)，分別為尾柄孢殼屬（）、毛殼菌屬、枝孢屬（）、炭疽菌屬（）、黑孢屬、莖點(diǎn)霉屬、擬莖點(diǎn)霉屬（）、光黑殼屬（）和炭角菌屬（），以及稀有屬20個(gè)。發(fā)現(xiàn)與煙草生長發(fā)育密切相關(guān)的有6個(gè)屬，分別為、、、、和，在煙草生長的各個(gè)時(shí)期均有分布。對不同煙葉生長時(shí)期和不同生態(tài)因素下的內(nèi)生菌群的分布和變化規(guī)律進(jìn)行了總結(jié)，發(fā)現(xiàn)不同生長時(shí)期、不同地區(qū)、不同部位及不同海拔種植區(qū)對煙葉內(nèi)生真菌的豐富度和多樣性均有影響。

劉宏玉等[37,41]從云南10種煙草的根、莖、葉中分離得到199株內(nèi)生真菌，根據(jù)ITS-rDNA系統(tǒng)發(fā)育分析鑒定為16屬，其中、和為主要優(yōu)勢屬。煙草不同組織內(nèi)生真菌的種群結(jié)構(gòu)存在顯著差異，根中的優(yōu)勢屬為和，莖中的優(yōu)勢屬為和，葉片中的優(yōu)勢屬為。其中3個(gè)優(yōu)勢屬具有組織?；?，從煙草根莖葉中均可分離得到，而只分布在地上部莖葉中，只分布在根莖中。

周開誼等[42]通過形態(tài)觀察和ITS-rDNA分析，從健康煙草的根和莖中分離鑒定出18個(gè)屬內(nèi)生真菌，其中、、和a為優(yōu)勢屬。另外，報(bào)道了、、等13個(gè)首次從煙草中分離得到的內(nèi)生菌屬。

由以上研究可以看出，煙草內(nèi)生真菌的物種多樣性在不斷豐富。目前共從不同地區(qū)不同品種的煙草中分離鑒定內(nèi)生真菌2986株，分屬于57個(gè)屬。其中、、和為優(yōu)勢屬，其優(yōu)勢度分別為32.15%、13.60%、8.61%和4.72%（圖2）。從整個(gè)生育期來看，從煙草苗期到成熟期，內(nèi)生真菌的種類和數(shù)量都呈上升趨勢。成熟期煙草內(nèi)生真菌的檢出率較高，菌群豐度達(dá)到最大，該時(shí)期菌株的檢出率為35.01%（圖3）。煙草內(nèi)生真菌種群分布存在組織專化性，在不同組織內(nèi)部存在優(yōu)勢屬，其中葉部內(nèi)生真菌種群最多，其次是莖，根部最少。裴洲洋[39]從煙草不同組織中分離出977株菌株，其中從根部分離出內(nèi)生真菌174株，占分離出總菌株數(shù)的17.81%；莖部365株，占總菌株數(shù)的37.36%；葉部438株，占總菌株數(shù)的44.83%。通過對不同煙草組織內(nèi)生真菌的分離，發(fā)現(xiàn)根部分離得到的菌株優(yōu)勢屬為，分離率達(dá)31.03%；莖和葉中的優(yōu)勢屬均為，分離率分別為26.76%和27.40%（圖4）。此外，其他生態(tài)因素也會對煙草內(nèi)生真菌的分布產(chǎn)生影響，如海拔、經(jīng)度和緯度等[40]。

圖2 煙草內(nèi)生真菌在屬水平的優(yōu)勢度

圖3 煙草不同生育期內(nèi)生真菌檢出率

3 煙草內(nèi)生真菌的功能

植物內(nèi)生真菌定殖在植物體內(nèi)的特殊生態(tài)環(huán)境中，與植物建立了和諧共生關(guān)系。在與宿主協(xié)同進(jìn)化過程中，二者互惠共生，一方面內(nèi)生真菌從宿主中吸收營養(yǎng)供自己生長需要，另一方面內(nèi)生真菌參與了宿主的生長發(fā)育和系統(tǒng)演化過程。

3.1 促生作用

金慧清等[43]在煙草中篩選了5株可以促進(jìn)煙苗生長的內(nèi)生真菌，分別為鐮刀菌屬（）菌株YCEF005和棘殼孢菌屬（）菌株YCEF053、YCEF191、YCEF193、YCEF199。共培養(yǎng)試驗(yàn)表明，經(jīng)煙草內(nèi)生真菌處理后的煙苗葉片數(shù)、根和地上部鮮物質(zhì)和干物質(zhì)量均顯著增加，YCEF005菌劑對盆栽煙草的生長促進(jìn)作用最為顯著。劉宏玉[37]發(fā)現(xiàn)分離得到的內(nèi)生真菌與煙草共培養(yǎng)后，煙苗葉長、葉寬、根長、根毛數(shù)目等都有不同程度的增長，且煙苗的個(gè)體間差異較小。從中篩選到5株具有穩(wěn)定促生作用的內(nèi)生真菌。通過共培養(yǎng)14 d后其對煙草葉片干物質(zhì)量的促生長效果分別為605.5%、235.7%、358.3%、232.2%和408.5%，對煙草根系干物質(zhì)量的促生長效果分別為955.3%、578.9%、607.9%、447.4%和881.6%。此外，共培養(yǎng)的煙苗移栽后通過盆栽試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)上述5株內(nèi)生真菌同樣表現(xiàn)出顯著的促生作用，在盆栽中共培養(yǎng)20 d后煙草葉片干物質(zhì)量分別增長52.6%、44.3%、58.3%、47.4%和31.1%。然后對篩選到的內(nèi)生真菌固體發(fā)酵制得菌肥制劑處理煙草，菌劑處理60 d后葉片干物質(zhì)量分別增長77.9%、38.3%、4.3%、9.8%和13.1%。以上結(jié)果表明，煙草內(nèi)生真菌與煙苗共培養(yǎng)后，會對煙苗表現(xiàn)出顯著的促生作用，其固體發(fā)酵制得的菌肥具有成為煙苗生長促進(jìn)劑的潛力。

3.2 生物防治作用

裴洲洋[39]通過平板對峙培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)分離獲得的煙草內(nèi)生真菌均有不同程度的抑菌活性。其原理可能是有些內(nèi)生真菌生長速度很快，可將病原菌覆蓋；或者可產(chǎn)生明顯的抑菌帶使病原菌產(chǎn)孢能力降低。同時(shí)篩選獲得了對煙草赤星病菌[(Fries) Keissler]有較強(qiáng)拮抗作用的內(nèi)生真菌2株，抑菌率均可達(dá)到70%以上。在活性篩選中，發(fā)現(xiàn)某些不產(chǎn)孢菌也具有較好的抑菌活性，抑制率可達(dá)到50%以上。煙草內(nèi)生真菌在平板對峙培養(yǎng)中普遍表現(xiàn)出很強(qiáng)的占位能力，拮抗作用表現(xiàn)比較穩(wěn)定。周開誼等[42]從健康煙草的根和莖中篩選獲得了5株內(nèi)生真菌（sp. Nitaf05sp. Nitaf07sp. Nitaf13sp. Nitaf20sp. Nitaf22），其菌絲和發(fā)酵液提取物對6株致病細(xì)菌均表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑菌活性，表明煙草內(nèi)生真菌具有產(chǎn)生抑菌活性成分和作為生防菌劑應(yīng)用的潛力。

3.3 降低重金屬含量

金慧清等[43]通過菌劑盆栽試驗(yàn)和田間試驗(yàn)探究了煙草內(nèi)生真菌對煙葉重金屬含量的降低作用，發(fā)現(xiàn)盆栽試驗(yàn)中，經(jīng)重金屬（Cd2+、As3+、Pb2+）單一處理或混合處理的煙株，內(nèi)生真菌菌劑能不同程度地降低煙片重金屬含量。田間試驗(yàn)中，采用混合菌劑能顯著降低煙葉中Pb2+、Cd2+含量。劉宏玉[37]篩選到4株可降低煙草葉片中Cd2+含量的內(nèi)生真菌，處理后煙草葉片中Cd2+含量分別降低了25.3%、14.3%、27.1%和23.5%。

4 煙草內(nèi)生真菌開發(fā)應(yīng)用前景

目前，煙草內(nèi)生真菌的分離鑒定及種群多樣性研究已取得一定進(jìn)展[37-43]，且煙草內(nèi)生真菌的開發(fā)利用主要集中在農(nóng)業(yè)方面，如促進(jìn)煙草生長、抗重金屬、生物防治等。但是，關(guān)于煙草內(nèi)生真菌次級代謝產(chǎn)物的分離鑒定和生物活性如抗農(nóng)業(yè)病害菌、抗氧化等的研究尚未見報(bào)道。植物內(nèi)生真菌被認(rèn)為是新型生物活性天然產(chǎn)物的潛在資源[44]，已被證實(shí)可以產(chǎn)生豐富多樣的具有生物活性的次級代謝產(chǎn)物，其抗氧化、細(xì)胞毒、抑菌、蛋白激酶抑制等功能特性已在多種植物上得到開發(fā)。煙草內(nèi)生真菌作為重要的煙田菌群組成，在優(yōu)勢菌株的發(fā)現(xiàn)、活性天然產(chǎn)物的篩選方面具有較大的利用空間。

煙草內(nèi)生真菌的研究雖已取得一定進(jìn)展，但也存在相應(yīng)不足，主要表現(xiàn)在以下幾方面：（1）研究地域局限。內(nèi)生真菌與生長環(huán)境密切相關(guān)，而目前僅僅對云南、河南省煙草內(nèi)生真菌的研究較為系統(tǒng)，對其他產(chǎn)區(qū)內(nèi)生真菌的種類和分布尚不明確；（2）菌株豐富度低。分離和鑒定方法體系的不完善導(dǎo)致菌株無法分離、重復(fù)發(fā)現(xiàn)等問題；（3）內(nèi)生真菌侵入宿主的機(jī)理及內(nèi)生真菌與宿主的關(guān)系尚不明確。所以要建立煙草內(nèi)生真菌資源庫，建立系統(tǒng)的煙草內(nèi)生真菌的分離和種屬鑒定的技術(shù)體系尚需長期的系統(tǒng)研究。植物內(nèi)生真菌被認(rèn)為是新型生物活性天然產(chǎn)物的潛在資源[44]，對具有活性的煙草內(nèi)生真菌菌株進(jìn)行次級代謝產(chǎn)物的分離，以期獲得結(jié)構(gòu)新穎的天然產(chǎn)物，開發(fā)其細(xì)胞毒、抗氧化、抑菌等生物活性，必將具有廣闊的應(yīng)用前景。同時(shí)，對煙草內(nèi)生菌資源的開發(fā)利用必將促進(jìn)煙草農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，產(chǎn)生可觀的經(jīng)濟(jì)和生態(tài)效益，有利于煙草行業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。

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Research Advances on Biodiversity and Functions of Tobacco Endophytic Fungi

ZHANG Peng, LI Panpan, GAO Lin, DU Yongmei, LIU Xinmin, ZHANG Zhongfeng, SHEN Guoming*

（Tobacco Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences, Qingdao 266101, China）

The tobacco endophytic fungi are an important part of the microbial ecosystem in tobacco field. They are widely distributed and possess various biological functions. Metabolitesof tobacco endophytic fungi play a positive role in promoting the growth of tobacco, improving the ecological adaptability of the host, and reducing harmful substances in tobacco. Tobacco endophytic fungi thus have a great potential to be used in the fields of medicine, plant growth accelerator, and biopesticide. In this review, the authors summarize the isolation and identification of tobacco endophytic fungi, as well as their biodiversity and community distribution characteristics. Their functions and development prospect are also discussed. By detailed analyses, the distributing disciplinarian in different periods and the current application status of the tobacco endophytic fungi are conclude. Finally, the difficulties in current research and the development tendency are discussed, and research perspectives are also proposed.

tobacco; endophytic fungi; biodiversity; functions

S572.01

1007-5119（2017）02-0093-07

10.13496/j.issn.1007-5119.2017.02.016

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程（ASTIP-TRIC05）；中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所青年科學(xué)基金項(xiàng)目“野生煙草化學(xué)成分多樣性及抗農(nóng)業(yè)病害菌活性研究”（2016A02）

張 鵬（1986-），男，博士，助理研究員，主要研究方向?yàn)橹参飪?nèi)生真菌次級代謝產(chǎn)物及活性。E-mail：zhangpeng@caas.cn

，E-mail：shenguoming@caas.cn

2016-07-08

2016-10-08