超臨界CO2萃取煙花中西柏三烯二醇工藝研究

何 康，張懷寶，杜詠梅，劉新民，蒯 雁，付秋娟

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超臨界CO2萃取煙花中西柏三烯二醇工藝研究

何 康1,2，張懷寶1*，杜詠梅1，劉新民1，蒯 雁3，付秋娟1

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，青島 266101；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院，北京100081；3.大理州煙草公司南澗縣分公司，云南大理671000）

為了建立超臨界CO2萃取煙花中的西柏三烯二醇的最佳工藝條件，以煙花為原料，通過(guò)單因素試驗(yàn)，考察了萃取時(shí)間、萃取溫度、萃取壓力和夾帶劑流速對(duì)西柏三烯二醇提取量的影響，在此基礎(chǔ)上以上述4個(gè)因素為變量，以西柏三烯二醇提取量為響應(yīng)值進(jìn)行中心復(fù)合設(shè)計(jì)（central composite design），對(duì)其提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，萃取時(shí)間120 min、萃取溫度42 ℃、萃取壓力13.9 MPa、夾帶劑乙醇流速0.67 g/min為最優(yōu)提取工藝條件。在該條件下，由響應(yīng)面模型預(yù)測(cè)的西柏三烯二醇提取量為6.065 mg/g。本試驗(yàn)西柏三烯二醇的實(shí)際提取量為5.978 mg/g，提取率為97.1%。說(shuō)明central composite design結(jié)合響應(yīng)面分析法能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)煙草中西柏三烯二醇的低污染高效提取。

煙草；西柏三烯二醇；超臨界CO2萃??；中心復(fù)合設(shè)計(jì)

類西柏烷化合物是一類含有十四元大環(huán)的雙萜類天然產(chǎn)物，分子結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜，主要存在于煙草表皮的腺毛分泌物中[1-2]，同時(shí)也存在于少數(shù)海洋生物[3]和動(dòng)物[4-5]中。煙草中已分離獲得50多種類西柏烷化合物，其中西柏三烯二醇是煙草中主要的的西柏烷化合物[6-7]。研究表明，煙草中的西柏三烯二醇可通過(guò)降解產(chǎn)生茄酮、茄呢呋喃、降茄二酮等香味成分，茄酮、茄呢呋喃、降茄二酮是煙草香氣成分的重要貢獻(xiàn)者[8-9]。SEVERSON等[10]將含有α和β西柏三烯二醇的混合物注射到標(biāo)準(zhǔn)卷煙中，評(píng)吸結(jié)果表明，經(jīng)處理后卷煙具有可可香味，且余味干凈，吃味豐滿，具有花香韻或粉香韻。日本煙草公司曾將從東方煙花蕾中經(jīng)溶劑萃取得到的西柏三烯二醇配成0.01%乙醇溶液噴灑于煙葉上，可大大改善煙草的香味。以上表明，西柏三烯二醇對(duì)于煙草香味的產(chǎn)生具有非常重要的作用，對(duì)于提高煙葉品質(zhì)和使用價(jià)值、提升卷煙香氣、凸顯卷煙特色方面具有重大價(jià)值。

目前對(duì)煙草中西柏三烯二醇的提取方法采取的仍是傳統(tǒng)的有機(jī)溶劑提取法，即有機(jī)溶劑浸提、濃縮獲得煙草西柏三烯二醇粗浸膏[11]，這種提取技術(shù)以煙草葉片作為原料，存在著浪費(fèi)煙草原料的問(wèn)題，而且提取物中還會(huì)有溶劑殘留，增加外來(lái)化學(xué)物質(zhì)給卷煙安全帶來(lái)的潛在性風(fēng)險(xiǎn)。中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所發(fā)明了一種從煙草花序中提取西柏三烯二醇的方法[12]，解決了煙草原料浪費(fèi)的問(wèn)題，但提取物中仍會(huì)有溶劑殘留?；谖靼厝┒荚诰頍熢鱿惴矫娴膽?yīng)用潛力，為了克服以上提取方法的不足，本研究選取超臨界CO2萃取技術(shù)，并以乙醇作為夾帶劑[13-14]，對(duì)西柏三烯二醇進(jìn)行提取。其原理是當(dāng)CO2處在臨界溫度和臨界壓力以上時(shí)，可以被用作溶劑，提取完成之后又易與目標(biāo)物分離，相較于傳統(tǒng)工藝能對(duì)西柏三烯二醇進(jìn)行無(wú)污染的直接提取[15-18]。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

儀器：SFE-500M-2BASE超臨界CO2萃取裝置（美國(guó)Waters公司）；BSA124S-CW電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司）；ACQUITY UPLC H-Class超高效液相色譜儀（美國(guó)Waters公司）。

試劑：乙酸乙酯、乙醇為均分析純（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；乙腈為色譜純（德國(guó)MERCK公司）；CO2氣體（純度99.99％，青島德海偉業(yè)科技有限公司）。

1.2 材料預(yù)處理

將煙花（品種為NC55，由山東省諸城市辛興試驗(yàn)站提供）于陰涼處晾干，測(cè)定含水率為13%，切絲混勻，作為超臨界CO2萃取的原料。另取部分樣品于60 ℃烘干，制成40目粉末，4 ℃冰箱中貯存，用于原料中西柏三烯二醇含量的測(cè)定。

1.3 色譜分析條件

色譜條件：流動(dòng)相70%的乙腈等梯度洗脫；色譜柱BEH C18（50 mm×2.1 mm，1.7 μm)；流速0.3 mL/min；進(jìn)樣量3 μL；柱溫35 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)200 nm。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 樣品中西柏三烯二醇含量的測(cè)定 稱取0.1 g粉末置于試管中，加入5 mL乙酸乙酯，混勻，40 ℃超聲提取10 min，離心，取上清液放入25 mL容量瓶中；殘?jiān)^續(xù)按照以上步驟提取2次，時(shí)間為10 min，3次提取液合并，以乙酸乙酯定容至25 mL，取2 mL該溶液置于試管中，經(jīng)氮?dú)獯蹈珊?，? mL 95%乙腈溶解，采用高效液相色譜法測(cè)定樣品中的西柏三烯二醇含量，外標(biāo)法定量，以10次重復(fù)測(cè)定結(jié)果的平均值作為樣品中西柏三烯二醇含量。

1.4.2 單因素試驗(yàn) 準(zhǔn)確稱取10 g樣品，加入萃取釜中，固定CO2流速為20 g/min，夾帶劑為乙醇，設(shè)置初始萃取壓力12.5 MPa，萃取溫度40 ℃，萃取時(shí)間60 min，夾帶劑流速0.8 g/min，分別考察萃取溫度（30、35、40、45、50 ℃）、壓力（7.5、10、12.5、15、17.5 MPa）、時(shí)間（30、60、90、120、150 min）、夾帶劑流速（0.2、0.5、0.8、1.1、1.4 g/min）對(duì)西柏三烯二醇提取量的影響。

1.4.3 Central Composite試驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)Central Composite試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取萃取時(shí)間、萃取溫度、萃取壓力和夾帶劑流速對(duì)西柏三烯二醇提取影響顯著的4個(gè)因素，分別以、、和代表，每一個(gè)自變量的不同試驗(yàn)水平分別以-2、-1、0、1、2進(jìn)行編碼，如表1所示。

表1 西柏三烯二醇提取響應(yīng)面分析因素與水平

2 結(jié) 果

2.1 影響西柏三烯二醇提取量的因素

2.1.1 萃取溫度對(duì)西柏三烯二醇提取量的影響 在預(yù)試驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)CO2流速對(duì)西柏三烯二醇提取率的影響較小，考慮到設(shè)備的承受能力與節(jié)約資源，固定CO2流速為20 g/min，選用乙醇作為夾帶劑，設(shè)置其他萃取條件為：萃取壓力12.5 MPa，萃取時(shí)間60 min，夾帶劑流速0.8 g/min。圖1表明，在其他條件不變情況下，溫度在30~50 ℃范圍內(nèi)增加時(shí)，西柏三烯二醇提取量先升高后降低，在40 ℃時(shí)提取量達(dá)到最大值。所以，選取最佳萃取溫度為40 ℃，此時(shí)西柏三烯二醇提取量為5.456 mg/g，提取率為88.6%。

圖1 萃取溫度對(duì)西柏三烯二醇提取量的影響

2.1.2 萃取壓力對(duì)西柏三烯二醇提取量的影響 圖2表明，在固定萃取條件為萃取溫度40 ℃，萃取時(shí)間60 min，夾帶劑流速0.8 g/min情況下，壓力在7.5～17.5 MPa范圍內(nèi)增加時(shí)，西柏三烯二醇提取量呈先升高后降低的趨勢(shì)，在12.5 MPa時(shí)西柏三烯二醇的提取量達(dá)到最高。因此，超臨界CO2萃取西柏三烯二醇較好的萃取壓力為12.5 MPa，此時(shí)西柏三烯二醇提取量為5.48 mg/g，提取率為88.9%。

2.1.3 夾帶劑流速對(duì)西柏三烯二醇提取量的影響 圖3表明，在固定萃取條件為萃取壓力12.5 MPa，萃取溫度40 ℃，萃取時(shí)間60 min情況下，夾帶劑流速在0.2~1.4 g/min范圍內(nèi)增加時(shí)，西柏三烯二醇提取量隨夾帶劑流速的增加呈先升后降的趨勢(shì)，當(dāng)夾帶劑流速上升到0.8 g/min時(shí)提取量達(dá)到最大。因此，超臨界CO2萃取西柏三烯二醇較好的夾帶劑流速為0.8 g/min，此時(shí)西柏三烯二醇提取量為5.51 mg/g，提取率為89.5%。

2.1.4 萃取時(shí)間對(duì)西柏三烯二醇提取量的影響 圖4表明，在固定萃取條件為萃取壓力12.5 MPa，萃取溫度40 ℃，夾帶劑流速0.8 g/min情況下，時(shí)間在30~90 min范圍內(nèi)增加時(shí)，煙草西柏三烯二醇提取量隨時(shí)間的延長(zhǎng)而升高，到90 min時(shí)接近最大值，之后再隨著時(shí)間延長(zhǎng)，西柏三烯二醇提取率雖略有上升，但差異不顯著，從節(jié)約資源，控制成本，提高效率等方面考慮，選擇萃取時(shí)間為90 min，此時(shí)西柏三烯二醇提取量為5.7 mg/g，提取率為92.5%。

圖2 萃取壓力對(duì)西柏三烯二醇提取量的影響

圖3 夾帶劑流速對(duì)西柏三烯二醇提取量的影響

圖4 萃取時(shí)間對(duì)西柏三烯二醇提取量的影響

2.2 響應(yīng)面分析法優(yōu)化煙草西柏三烯二醇萃取工藝條件

2.2.1 模型方程的建立與顯著性檢驗(yàn) 利用Design Expert軟件，通過(guò)表2中西柏三烯二醇試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，獲得西柏三烯二醇對(duì)編碼自變量萃取溫度、萃取壓力、萃取時(shí)間和夾帶劑流速的回歸方程：=5.76+0.17+0.31+ 0.22-0.17+0.10-0.071-0.088-0.023- 0.0088+9.50×103-0.222-0.312-0.0432- 0.242。由表3可知，整體模型的＜0.0001，表明該二次方程模型高度顯著。通過(guò)回歸方差分析，該模型回歸顯著（＜0.0001），失擬項(xiàng)=0.0892＞0.05不顯著，并且該模型的2＝0.9393，說(shuō)明該模型與實(shí)際實(shí)驗(yàn)擬合較好，能解釋93.9%響應(yīng)值的變化，可以用于西柏三烯二醇提取量的理論預(yù)測(cè)。通過(guò)軟件Design-Expert 8.05求解方程，得出了最優(yōu)提取工藝條件為：萃取時(shí)間120 min、萃取溫度42.23 ℃、萃取壓力13.85 MPa，夾帶劑流速0.67 g/min。在該條件下由響應(yīng)面模型預(yù)測(cè)的西柏三烯二醇提取量為6.065 mg/g?？紤]到實(shí)際操作的可行性并取得最佳效果的目的，將西柏三烯二醇的提取工藝條件修正為：萃取時(shí)間120 min、萃取溫度42 ℃、萃取壓力13.9 MPa，夾帶劑流速0.67 g/min。

2.2.2 因素間的交互影響 圖5~9中左側(cè)等高線圖形均為橢圓形，表面萃取溫度和夾帶劑流速、萃取溫度和萃取壓力、萃取溫度和萃取時(shí)間、萃取時(shí)間和夾帶劑流速、萃取壓力和萃取時(shí)間的交互作用對(duì)西柏三烯二醇的提取量影響均顯著。圖10中左側(cè)等高線圖形趨于圓形，表明萃取壓力和夾帶劑流速兩因素交互作用不顯著。從圖5中右側(cè)響應(yīng)面立體圖看出，隨著夾帶劑流速和萃取溫度的升高，西柏三烯二醇提取量呈先升高后降低的趨勢(shì)，但西柏三烯二醇提取量沿萃取溫度方向增加速率較快，沿夾帶劑流速方向增加速率較慢，說(shuō)明西柏三烯二醇提取量受萃取溫度的影響較顯著。圖9中右側(cè)響應(yīng)面立體圖可以看出，隨著萃取時(shí)間的延長(zhǎng)，西柏三烯二醇提取量不斷上升，上升速率減緩。隨著萃取壓力的增大西柏三烯二醇提取量呈先上升后下降的趨勢(shì)，但西柏三烯二醇提取量沿萃取壓力方向增加速率較大，沿提取時(shí)間方向增加速率較小，說(shuō)明西柏三烯二醇提取量受萃取壓力的影響較顯著。

表2 西柏三烯二醇提取響應(yīng)面分析方案及結(jié)果

表3 回歸模型方程的方差分析

注：**極顯著（＜0.01）；*顯著（＜0.05）。

2.2.3 結(jié)果驗(yàn)證 為檢驗(yàn)結(jié)果的可靠性，采用優(yōu)化得出的工藝條件進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果得出西柏三烯二醇的實(shí)際提取量為5.98 mg/g，與理論預(yù)測(cè)值相比相對(duì)偏差為1.43%，說(shuō)明該方程與實(shí)際情況較相符，驗(yàn)證了響應(yīng)面模型的正確性，提取出的西柏三烯二醇純度達(dá)到21.4%，較傳統(tǒng)提取方法有較大提高。與1.4.1中測(cè)得的樣品中西柏三烯二醇含量比較，提取率為97.1%，所以，此條件下基本上能把樣品中的西柏三烯二醇提取完全。

圖5 萃取溫度和夾帶劑流速對(duì)西柏三烯二醇提取量的等高線（左）和響應(yīng)面（右）

圖6 萃取溫度和萃取壓力對(duì)西柏三烯二醇提取量的等高線（左）和響應(yīng)面（右）

圖7 萃取溫度和萃取時(shí)間對(duì)西柏三烯二醇提取量的等高線（左）和響應(yīng)面（右）

圖8 萃取時(shí)間和夾帶劑流速對(duì)西柏三烯二醇提取量的等高線（左）和響應(yīng)面（右）

圖9 萃取壓力和萃取時(shí)間對(duì)西柏三烯二醇提取量的等高線（左）和響應(yīng)面（右）

圖10 萃取壓力和夾帶劑流速對(duì)西柏三烯二醇提取量的等高線（左）和響應(yīng)面（右）

3 討 論

本研究首次采用超臨界CO2萃取技術(shù)對(duì)煙花中的西柏三烯二醇進(jìn)行萃取，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用4因素5水平的響應(yīng)面分析法優(yōu)化西柏三烯二醇的提取工藝，得到最佳的提取工藝條件為：萃取時(shí)間120 min、萃取溫度42 ℃、萃取壓力13.9 MPa、夾帶劑乙醇流速0.67 g/min。試驗(yàn)所用原料為煙花，解決了傳統(tǒng)提取方法[11-12]浪費(fèi)煙葉問(wèn)題，也為煙草廢棄物的再利用探索到一條新途徑。本研究選用夾帶劑為乙醇，與孫文梁等[11]、何峰等[19]采用的傳統(tǒng)的有機(jī)溶劑提取試驗(yàn)方法進(jìn)行比較，實(shí)現(xiàn)了對(duì)煙草中的西柏三烯二醇的產(chǎn)物安全、低污染提取。卷煙企業(yè)每年都會(huì)報(bào)廢大量的不適用煙葉，其燃燒或掩埋處理會(huì)造成資源的浪費(fèi)和環(huán)境污染。下一步將加強(qiáng)對(duì)工業(yè)卷煙可用性差的低次煙葉和廢棄煙葉進(jìn)行西柏三烯二醇提取的研究，以豐富西柏三烯二醇的開(kāi)發(fā)利用資源。

4 結(jié) 論

本研究建立了一種超臨界CO2萃取煙花中西柏三烯二醇的工藝方法。并采用Design-Expert軟件的中心復(fù)合設(shè)計(jì)方法設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)。結(jié)合響應(yīng)面交互作用分析結(jié)果和實(shí)際情況預(yù)測(cè)最佳條件，并驗(yàn)證后得出西柏三烯二醇最佳提取條件：萃取時(shí)間120 min、萃取溫度42 ℃、萃取壓力13.9 MPa，夾帶劑流速0.67 g/min。在優(yōu)化得到的最佳提取條件下進(jìn)行提取，得到的西柏三烯二醇提取量為5.978 mg/g，提取率是97.1%，利用響應(yīng)面分析法得到的西柏三烯二醇提取工藝參數(shù)真實(shí)可靠，提取效率高。

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Studying of Supercritical CO2Extraction of Cembratriene-diols from Tobacco Flowers

HE Kang1,2, ZHANG Huaibao1*, DU Yongmei1, LIU Xinmin1, KUAI Yan3, FU Qiujuan1

(1.Tobacco Research Institute of CAAS, Qingdao 266101, China; 2. Graduate School of CAAS, Beijing 100081, China; 3.Nanjian County Tobacco Company of Yunnan Province, Dali, Yunnan 671000, China)

The objective of this study was to extract cembratriene-diols in tobacco flowers environment-friendly and to establish the optimum process conditions of supercritical CO2extraction. The single factor test and response surface analysis were used to explore the influence of extraction time, extraction temperature, extraction pressure and the entrainer flow on the extraction amount of cembratriene-diols in tobacco flowers. The central composite design was carried on the basis of single factor experiment. The optimal extraction conditions were found to be extraction at 42 ℃ and 13.9 MPa for 120 min using ethanol as the entrainer at a flow velocity of 0.67 g/min. Under this condition, the predicted extraction amount of cembratriene-diols was 6.065 mg/g based on the response surface model. In this study, the actual extraction amount and extraction rate of cembratriene-diols were 5.978 mg/g and 97.1%, respectively. This suggested that efficient extraction of cembratriene-diols in tobacco can be achieved using the central composite design and response surface analysis.

tobacco;cembratriene-diols; supercritical CO2extraction; central composite design

TS41+1

1007-5119（2017）02-0081-07

10.13496/j.issn.1007-5119.2017.02.014

中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程（ASTIP-TRIC05）

何 康（1990-），男，在讀碩士，研究方向?yàn)闊煵莼瘜W(xué)。E-mail：13697667596@163.com。

，E-mail：huaibaozh@126.com

2016-12-06

2017-02-07