茵芋花粉培養(yǎng)效應(yīng)的優(yōu)化

阮淑明, 鄭天漢, 華偉平, 吳遠(yuǎn)彬, 蘭思仁(.福建林業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院林學(xué)系，福建 南平 000；.福建省林業(yè)廳世行辦，福建 福州 000；.武夷學(xué)院林學(xué)系，福建 武夷山 00；.福建林業(yè)勘察設(shè)計院，福建 福州 000；.福建農(nóng)林大學(xué)園林學(xué)院，福州 福建 000)

茵芋花粉培養(yǎng)效應(yīng)的優(yōu)化

阮淑明1, 鄭天漢2, 華偉平3, 吳遠(yuǎn)彬4, 蘭思仁5
(1.福建林業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院林學(xué)系，福建 南平 353000；2.福建省林業(yè)廳世行辦，福建 福州 350003；3.武夷學(xué)院林學(xué)系，福建 武夷山 354300；4.福建林業(yè)勘察設(shè)計院，福建 福州 350001；5.福建農(nóng)林大學(xué)園林學(xué)院，福州 福建 350002)

為研究茵芋花粉的培養(yǎng)效應(yīng)，采用蔗糖、硼酸、氯化鈣三因素三水平培養(yǎng)基離體培養(yǎng)法， I2—KI、TTC、紅墨水等染色法，以及生物熒光顯微鏡對花粉活力進(jìn)行觀察與檢測，篩選有活力的花粉的最適培養(yǎng)基及活力測定方法.結(jié)果表明，新鮮茵芋花粉粒呈黃色，花粉離體后逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)辄S褐色.I2—KI、TTC對花粉染色無效;紅墨水染色法使有活力的花粉在藍(lán)色濾光片下呈綠色或原色，能夠快速有效地檢測花粉活力.花粉于25 ℃的恒溫下離體培養(yǎng)4 h開始萌發(fā)，至24 h萌發(fā)穩(wěn)定.蔗糖、硼酸、氯化鈣三因素三水平培養(yǎng)基離體培養(yǎng)對花粉萌發(fā)的互作效應(yīng)極顯著，最優(yōu)培養(yǎng)基為：15 g·L-1蔗糖+0.05 g·L-1硼酸+0.02 g·L-1氯化鈣，萌發(fā)率為60.0%；次優(yōu)培養(yǎng)基為：15 g·L-1蔗糖+0.03 g·L-1硼酸+0.02 g·L-1氯化鈣，萌發(fā)率為58.0%；第三培養(yǎng)基為：15 g·L-1蔗糖+0.01 g·L-1硼酸+0.01 g·L-1氯化鈣，萌發(fā)率為50.4%.影響茵芋花粉萌發(fā)的主因素為氯化鈣，次因素為蔗糖，輔助因素為硼酸.

茵芋; 花粉活力; 染色法; 離體培養(yǎng)

Abstract: In order to screen out the optimal medium forinvitropollen germination ofSkimmiareevesianaand reliable pollen vitality evaluation method, an orthogonal design with 3 factors in 3 levels, including sucrose, boric acid and calcium chloride, were implemented. Pollen vitality was evaluated by methods of I2—KI, TTC, red staining, and bioluminescent display. The results showed that freshS.reevesianapollen was yellow and turned yellowish browninvitro. I2—KI and TTC methods were inapplicable to vitality test. However, by red ink staining, vitalS.reevesianapollen was green or in the original color under blue optical filter, indicating that it is an effective method for pollen vitality test. Pollen began to germinate 4 h afterinvitroculture at 25 ℃ and reached stable status within 24 h. The interactive effect of 3 chemicals oninvitropollen germination was significant. The optimal medium formula was 15 g·L-1sucrose, 0.05 g·L-1boric acid, and 0.02 g·L-1calcium chloride, reaching a 60.0% germination rate. Among all factors that affecting germination rate, calcium chloride was the predominate factor, which was followed by sucrose and boric acid.

Keywords:Skimmiareevesiana; pollen vitality; staining method; cultureinvitro

茵芋(Skimmiareevesiana)屬蕓香科茵芋屬，又名黃山桂，為常綠灌木，花單性[1].茵芋為觀葉、觀花、觀果俱佳的植物，是我國傳統(tǒng)的藥用植物，主治風(fēng)濕痹痛、四肢攣急、兩足軟弱.多脈茵芋可分離出生物堿、花青素衍生物、香豆素衍生物、萜類化合物、脂肪酸，以及揮發(fā)性化合物甲基多脈茵芋醇、蒲公英萜酮、吳茱萸素、香草木寧、擬蕓香品、新植二烯、月桂酸甲醋等[2].茵芋原生種質(zhì)資源稀少，為雌雄異株植物，蜂媒、風(fēng)媒授粉.原生地處于海拔1 400～2 400 m的地帶，濕度大、多云霧、高紫外線輻射、氣溫變幅大[2-4]，此環(huán)境下的蜜蜂已難以生存，因此，茵芋主要以風(fēng)媒進(jìn)行自然授粉.茵芋人工栽培中常見花期不一致的問題，嚴(yán)重影響茵芋的授粉、結(jié)實，人工輔助授粉是茵芋馴化栽培的重要環(huán)節(jié).因此，在人工授粉之前需要快速、可靠地測定茵芋花粉的生活力，評估花粉是否有授精能力，以保證人工授粉的效果.目前，國內(nèi)外尚未見關(guān)于茵芋花粉活力測定的相關(guān)報道.

1 材料與方法

1.1 材料

供試茵芋花粉取自福建省洋口國有林場培育的3年生盤栽雄株.選取3株生長健壯、無病蟲害的植株進(jìn)行采粉，植株平均株高28 cm，平均冠幅23 cm.

1.2 方法

表1 茵芋花粉離體培養(yǎng)基的配制Table 1 Formula for in vitro culture medium of S.reevesiana pollen

1.2.1 試驗設(shè)計 在2015年預(yù)試驗的基礎(chǔ)上，2016年再次采用I2—KI染色法、氯化三苯基四氮唑(2，3，5-triphenyl-tetrazolium chloride, TTC)染色法、紅墨水染色法，以及蔗糖、硼酸、氯化鈣三因素三水平培養(yǎng)基進(jìn)行花粉萌發(fā)的離體培養(yǎng)試驗，設(shè)計方案見表1.

1.2.2 花粉的提取 花粉于2016年3月22日,即茵芋盛花期采集.選取花藥飽滿剛開裂但未散粉或即將開裂散粉的花藥，用鑷子夾起花藥，解剖針刺破花粉囊抖落散出花粉，將花粉集中收集于載玻片上備用.

1.2.3 花粉染色檢測 采用I2—KI、TTC、紅墨水染色法檢測[5-8].I2—KI染色法使正?；ǚ圩兯{(lán)，而不具有活力的花粉呈黃褐色；TTC染色法使具有活力的花粉呈紅色，而無活力的花粉則不變色或變色不明顯[9-10]；紅墨水染色法使紅墨水中的酸性大紅C不能進(jìn)入有活力的細(xì)胞內(nèi)而不被染色，喪失活力的細(xì)胞使酸性大紅C進(jìn)入細(xì)胞而被染色[11].

按每處理3次重復(fù)將采集的花粉移至1 mL Ep管中，分別加入I2—KI、含量為0.5%的TTC、含量為5%的普通紅墨水幾滴，充分振蕩均勻，染色20 min后，用吸管吸取適量的花粉懸濁液于載玻片上，蓋上蓋玻片并編寫順序號.

1.2.4 花粉的離體培養(yǎng) 根據(jù)表1的方案配制27個組合的培養(yǎng)基，分別放入花粉并用解剖針攪拌均勻，培養(yǎng)基中加入0.7%瓊脂，pH為5.8～6.0，置于載玻片上轉(zhuǎn)入25 ℃恒溫的暗條件下進(jìn)行花粉萌發(fā)培養(yǎng)[7-8]，每4 h檢測一次，連續(xù)檢測24 h.

1.2.5 花粉活力的顯微檢測 光學(xué)顯微鏡下每處理隨機(jī)選取5個視窗觀察并拍照花粉著色情況，每個視窗花粉總數(shù)要大于30粒，計算有活力的花粉百分率.花粉離體培養(yǎng)中，將載有花粉的載玻片置于IBE2000型倒置生物熒光顯微鏡下觀測，花粉管長度超過花粉粒直徑即為花粉萌發(fā)，并在光學(xué)顯微鏡下用測微尺測量花粉管長度，統(tǒng)計分析各處理的花粉萌發(fā)率、花粉管長度.

1.2.6 數(shù)據(jù)分析 試驗數(shù)據(jù)采用EXCEL、SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析.染色率/%=被染色的花粉粒數(shù)/視野中的花粉?？倲?shù)×100；萌發(fā)率/%=萌發(fā)的花粉粒數(shù)/視野中的花粉?？倲?shù)×100.

2 結(jié)果與分析

2.1 茵芋花粉形態(tài)與花粉管發(fā)育過程

IBE2000型倒置生物熒光顯微鏡觀察顯示，茵芋花粉均為單?；ǚ?，輻射對稱，似毛線纏繞球狀(圖1A)，赤道面觀呈圓形或橢圓形，極面觀呈圓形.新鮮茵芋花粉粒肉眼下呈黃色(圖1B)，花粉離體后隨著時間的延長逐漸轉(zhuǎn)為黃褐色，在室內(nèi)氣溫約16 ℃下放置24 h后，花粉粒外壁物質(zhì)自然脫落(圖1C)，從而影響花粉活力.在光學(xué)顯微鏡下測得花粉平均直徑為35.53 μm，生長穩(wěn)定后的花粉管平均長度為253.1 μm.花粉離體培養(yǎng)4 h時，則有個別花粉開始萌發(fā)(圖1D).剛萌發(fā)的花粉管粗且直，而后逐漸伸長生長，24 h后花粉管基本停止生長，花粉管長度可達(dá)花粉粒直徑的數(shù)倍(圖1E)，且花粉管生長具有明顯趨向培養(yǎng)基營養(yǎng)液的效應(yīng).

A：花粉的顯微結(jié)構(gòu)(2 500倍)；B：新鮮花粉的顯微色澤(100倍);C：室溫放置1 d，花粉外壁物質(zhì)脫落;D：花粉離體培養(yǎng)4 h開始萌發(fā);E:離體培養(yǎng)24 h的花粉管形態(tài);F:紅墨水染色后的花粉顏色.圖1 茵芋花粉形態(tài)與萌發(fā)過程Fig.1 Pollen morphology and germination of S.reevesiana

2.2 茵芋花粉活力的染色效應(yīng)

茵芋花粉經(jīng)紅墨水染色20 min后，花粉粒著色成功且已基本穩(wěn)定，紅墨水染色法使有活力的花粉在藍(lán)色濾光片下呈綠色或原色(圖1F)，無活力的花粉呈紅色，由此測得花粉活力的平均值為68.2%；而花粉經(jīng)I2—KI、TTC染色20 min至48 h均未染色.試驗中染色、離體培養(yǎng)法所采用的花粉為“同質(zhì)、同時、同批”，離體培養(yǎng)法卻測得較高的花粉萌發(fā)率，表明花粉在I2—KI、TTC下未被染色，不能以此說明其沒有活力，而是由花粉的自身特性(如花粉壁厚度、外壁組成物質(zhì)、淀粉含量、花粉粒內(nèi)部酶類型及其活性等)造成的.因此，I2—KI和TTC染色法不適合于茵芋花粉活力的測定.

2.3 茵芋花粉離體培養(yǎng)的效應(yīng)

2.3.1 不同培養(yǎng)基對花粉萌發(fā)的影響效應(yīng) 茵芋花粉在蔗糖(A)、硼酸(B)、氯化鈣(C)3種含量中的總平均萌發(fā)率為38.8%.其中，A1、A2、A3的平均萌發(fā)率分別為33.3%、41.1%、41.9%，B1、B2、B3的平均萌發(fā)率分別為34.4%、40.8%、41.2%，C1、C2、C3的平均萌發(fā)率分別為38.4%、45.6%、32.4%.

方差分析結(jié)果(表2)表明，A、B、C對茵芋花粉萌發(fā)的影響均達(dá)極顯著水平，即A、B、C單因素條件下的不同含量對花粉萌發(fā)的影響極顯著.

表2 茵芋花粉萌發(fā)率多因素互作效應(yīng)的方差分析1)Table 2 Variance analysis of multiple factors of interactive effect on pollen germination rate of S.reevesiana

1)*、**分別表示顯著、極顯著差異.

3種蔗糖含量對茵芋花粉萌發(fā)率的效應(yīng)表現(xiàn)為：A3>A2>A1，即花粉萌發(fā)率隨著蔗糖含量的增大而增高.A3、A2的萌發(fā)率較A1的萌發(fā)率分別比增20.5%、19.0%，A3的萌發(fā)率較A2的萌發(fā)率僅比增1.9%，表明5 g·L-1的蔗糖含量偏低，10、15 g·L-1的蔗糖含量較合適.

3種硼酸含量對茵芋花粉萌發(fā)率的效應(yīng)表現(xiàn)為：B3>B2>B1，即花粉萌發(fā)率隨著硼酸含量的增大而增高.B3、B2的萌發(fā)率較B1的萌發(fā)率分別比增16.5%、15.7%，B3的萌發(fā)率較B2的萌發(fā)率僅比增1.0%，表明0.01 g·L-1的硼酸含量偏低，0.03、0.05 g·L-1的硼酸含量較合適.

3種氯化鈣含量對茵芋花粉萌發(fā)率的效應(yīng)表現(xiàn)為：C2>C1>C3，C2、C1的萌發(fā)率較C3的萌發(fā)率分別比增28.9%、15.6%，C2的萌發(fā)率較C1的萌發(fā)率僅比增15.8%，即0.02 g·L-1氯化鈣促進(jìn)花粉萌發(fā)的作用最好，0.01 g·L-1氯化鈣次之，0.03 g·L-1氯化鈣則抑制了花粉萌發(fā).

2.3.2 不同成分與含量對花粉萌發(fā)的互作效應(yīng) 由圖2可見，蔗糖、硼酸、氯化鈣三因素三水平構(gòu)成的27種培養(yǎng)基對茵芋花粉萌發(fā)率的影響從大到小依次為A3B3C2(60.0%)、A3B2C2(58.0%)、A3B1C2(50.4%)、A2B3C2(48.5%)、A1B3C1(48.2%)、A2B2C2(47.7%)、A1B2C1(44.0%)、A2B2C3(44.0%)、A3B3C3(43.0%)、A2B3C1(42.9%)、A2B2C1(41.4%)、A2B1C2(39.2%)、A1B2C2(38.1%)、A3B2C3(38.0%)、A1B1C1(37.2%)、A1B3C2(36.0%)、A2B3C3(36.0%)、A2B1C1(35.7%)、A2B1C3(35.0%)、A3B2C1(34.1%)、A1B1C2(32.4%)、A3B3C1(31.9%)、A3B1C3(31.0%)、A3B1C1(30.1%)、A1B3C3(24.0%)、A1B2C3(22.0%)、A1B1C3(18.0%).A×B×C構(gòu)成的27種培養(yǎng)基中，A3B3C2最優(yōu)，最優(yōu)培養(yǎng)基的花粉萌發(fā)率是最差培養(yǎng)基的3.3倍，表明蔗糖、硼酸、氯化鈣及其含量對茵芋花粉萌發(fā)的互作效應(yīng)明顯.

圖2 A×C×B互作效應(yīng)的花粉萌發(fā)率Fig.2 Pollen germination rate by interactive effect of A×C×B

由表2可見，A×B×C的互作效應(yīng)對茵芋花粉萌發(fā)率的影響達(dá)顯著水平.但除了A×C的互作效應(yīng)極顯著外，A×B、B×C的互作效應(yīng)不明顯.為進(jìn)一步分析各因素及其含量水平的互作效應(yīng)來源，分別對蔗糖、硼酸、氯化鈣三因素三水平的培養(yǎng)基進(jìn)行分組分析.

圖3 A×B互作效應(yīng)的花粉萌發(fā)率Fig.3 Pollen germination rate by interactive effect of A×B

由圖3可見，A×B構(gòu)成的9種培養(yǎng)基中的茵芋花粉萌發(fā)率分別為29.3%(A1B1)、34.5%(A1B2)、36.2%(A1B3)、36.5%(A2B1)、44.5%(A2B2)、42.5%(A2B3)、37.3%(A3B1)、43.4%(A3B2)、45.0%(A3B3).雖然9種培養(yǎng)基的互作效應(yīng)未達(dá)到顯著水平，但除了A2B3以外，其他培養(yǎng)基都表現(xiàn)為萌發(fā)率隨著硼酸含量的增大而增高；除了A1B1以外，其他培養(yǎng)基的萌發(fā)率都大于A1單因素的平均萌發(fā)率33.3%，表明A×B仍然具有一定的促進(jìn)效應(yīng)，且隨著含量的增大呈疊加效應(yīng).

由圖4可見，A×C構(gòu)成9種培養(yǎng)基中的茵芋花粉萌發(fā)率分別為43.2%(A1C1)、41.5%(A1C2)、39.6%(A1C3)、40.0%(A2C1)、41.2%(A2C2)、43.3%(A2C3)、32.0%(A3C1)、38.8%(A3C2)、46.8%(A3C3).A×C的9種培養(yǎng)基中，除了A3C1以外，其他培養(yǎng)基的萌發(fā)率都大于C因素的平均萌發(fā)率38.8%，表明A×C也具有互作效應(yīng)；除了A3C1以外，其他培養(yǎng)基的萌發(fā)率基本一致，表明蔗糖與氯化鈣構(gòu)成的培養(yǎng)基對花粉萌發(fā)具有較一致的促進(jìn)作用；A×C互作效應(yīng)極顯著，差異主要來源于A3C1、A3C3；另外，較高的蔗糖含量需要較高的氯化鈣含量相配合.

由圖5可見，B×C構(gòu)成9種培養(yǎng)基中的茵芋花粉萌發(fā)率分別為34.3%(B1C1)、39.8%(B1C2)、41.0%(B1C3)、39.8%(B2C1)、41.0%(B2C2)、40.7%(B2C3)、41.0%(B3C1)、40.7%(B3C2)、47.9%(B3C3).B×C的9種培養(yǎng)基中，除了B3C3以外，其他培養(yǎng)基的萌發(fā)率基本一致，表明硼酸與氯化鈣構(gòu)成的培養(yǎng)基對花粉萌發(fā)的促進(jìn)作用不理想，B3C3處理可能是由較高的氯化鈣含量引起.

圖4 A×C互作效應(yīng)的花粉萌發(fā)率Fig.4 Pollen germination rate by interactive effect of A×C

3 討論

本試驗結(jié)果表明：I2—KI、TTC對茵芋花粉活力染色檢測沒有效果，有活力、無活力的花粉均未被染色；紅墨水染色法使有活力的花粉在藍(lán)色濾光片下呈綠色或原色，且20 min后基本穩(wěn)定，無活力的花粉呈紅色，表明紅墨水染色法能夠快速有效地檢測花粉活力.茵芋花粉離體培養(yǎng)4 h則有零星花粉開始萌發(fā)，至24 h花粉萌發(fā)基本穩(wěn)定，可以確定為茵芋花粉萌發(fā)的終止期限.雖然，紅墨水染色法可以直接檢測茵芋花粉的活力水平，蔗糖、硼酸、氯化鈣等外部介質(zhì)作用下的離體培養(yǎng)法可以直接檢測花粉的萌發(fā)率，但染色法的檢測結(jié)果與離體培養(yǎng)法的檢測結(jié)果有顯著差異，紅墨水染色法檢測的花粉活力為68.2%，離體培養(yǎng)的平均萌發(fā)率為38.8%，二者差異表明離體培養(yǎng)結(jié)果對茵芋人工授粉更具指導(dǎo)意義.在眾多植物花粉活力的測定中也發(fā)現(xiàn)[6]，染色法測定的數(shù)值明顯高于離體萌發(fā)法，但花粉活力的變化趨勢基本一致.可見，染色法常常將部分無活力的花粉染色誤計入有活力的一類，從而增大了觀察值及試驗誤差，綜合分析認(rèn)為離體培養(yǎng)法的花粉萌發(fā)率更準(zhǔn)確可靠.胡春等[12]、李暢等[13]、趙統(tǒng)利等[14]分別對鈍裂銀蓮花、一品紅、百合的花粉進(jìn)行活力檢測，發(fā)現(xiàn)離體萌發(fā)法測定的花粉活力最接近真實值，離體萌發(fā)法在生產(chǎn)上更具指導(dǎo)意義.另外，本試驗對茵芋花粉采用I2—KI、TTC、紅墨水染色法及離體培養(yǎng)法的檢測結(jié)果表明，紅墨水染色法與離體培養(yǎng)法相比較，其方法更簡便、取材更容易、檢測更快速，在生產(chǎn)實踐中可行且有效，對于花粉萌發(fā)率與活力檢測之間的誤差，可以根據(jù)紅墨水染色法、離體培養(yǎng)法兩種檢測結(jié)果，借助生物學(xué)原理和數(shù)理統(tǒng)計理論計算出修正參數(shù).此外，I2—KI、TTC對許多植物花粉活力染色檢測的效果顯著，但對茵芋花粉活力的檢測卻無效，表明采用多種方法檢測從而篩選出最適用于茵芋花粉活力的檢測方法具有重要意義.

本試驗結(jié)果表明，蔗糖、硼酸、氯化鈣及其不同含量對茵芋花粉萌發(fā)率具有明顯效應(yīng).蔗糖、硼酸、氯化鈣不同含量之間的萌發(fā)率差異明顯，蔗糖、硼酸、氯化鈣的最適含量分別為15、0.05、0.02 g·L-1.蔗糖、硼酸、氯化鈣及其不同含量對茵芋花粉萌發(fā)率的互作效應(yīng)顯著，最優(yōu)培養(yǎng)基A3B3C2的萌發(fā)率為60.0%，次優(yōu)培養(yǎng)基A3B2C2的萌發(fā)率為58.0%，A3B1C2的萌發(fā)率也較優(yōu)，達(dá)50.4%；最優(yōu)培養(yǎng)基A3B3C2的花粉萌發(fā)率是最差培養(yǎng)基A1B3C3的3.3倍，A3B3C2的花粉萌發(fā)率是單因素培養(yǎng)基最優(yōu)萌發(fā)率(C2)的1.32倍，是雙因素培養(yǎng)基最優(yōu)萌發(fā)率(B3C3)的1.25倍，表明蔗糖、硼酸、氯化鈣及其含量構(gòu)成的培養(yǎng)基對茵芋花粉萌發(fā)的互作效應(yīng)最突出.雙因素互作效應(yīng)顯示，蔗糖與氯化鈣構(gòu)成的培養(yǎng)基對茵芋花粉萌發(fā)率的互作效應(yīng)極顯著，蔗糖與硼酸、硼酸與氯化鈣的互作效應(yīng)不顯著.綜合分析外部介質(zhì)對茵芋花粉萌發(fā)率影響的主次作用，具體表現(xiàn)為：氯化鈣發(fā)揮主因素作用，蔗糖發(fā)揮次因素作用，硼酸發(fā)揮輔助作用.

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(責(zé)任編輯:施曉棠)

InvitropollenculturemediumoptimizationandvitalitytestforSkimmiareevesiana

RUAN Shuming1, ZHENG Tianhan2, HUA Weiping3, WU Yuanbin4, LAN Siren5

(1.Department of Forestry， Fujian Forestry Vocational Technical College, Nanping, Fujian 353000, China; 2.World Bank Loan Afforestation Office， Fujian Provincial Department of Forestry, Fuzhou, Fujian 350003, China; 3.Department of Forestry，Wuyi University, Wuyishan, Fujian 354300, China; 4.Fujian Provincial Forestry Survey and Design Institute, Fuzhou, Fujian 350001, China; 5.College of Landscape Architectur， Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou, Fujian 350002, China)

S567.1+9

A

1671-5470(2017)05-0515-06

10.13323/j.cnki.j.fafu(nat.sci.).2017.05.006

2017-02-14

2017-05-02

福建省科技項目(閩林科[2014]2號、閩林計財[2014]97號)；福建林業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院院士專家工作站項目(2015YSZ002).

阮淑明(1972-)，女，副教授.研究方向：植物生理.Email:2380818851@qq.com.通訊作者蘭思仁(1963-)，男，教授，博士生導(dǎo)師.研究方向：森林景觀.Email:lsr9636@163.com.