堿提擬目烏賊肌肉多糖工藝優(yōu)化及抗氧化活性研究

孫玉林，陳錫堃，黃冠鵬，陳晶晶，陳 薇，張傳耀，周 穎，陳道海

（1.嶺南師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，廣東 湛江 524048；2.環(huán)北部灣海洋藥用動物利用與保護(hù)研究所，廣東 湛江 524048）

堿提擬目烏賊肌肉多糖工藝優(yōu)化及抗氧化活性研究

孫玉林1，2，陳錫堃1，黃冠鵬1，陳晶晶1，陳 薇1，張傳耀1，周 穎1，陳道海1，2

（1.嶺南師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，廣東 湛江 524048；2.環(huán)北部灣海洋藥用動物利用與保護(hù)研究所，廣東 湛江 524048）

為研究堿提擬目烏賊肌肉多糖工藝優(yōu)化，在探索提取溫度、NaOH濃度及料液比單因素試驗基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計，得出最佳提取工藝為：提取溫度90℃、NaOH濃度3%、料液比1∶28 g/mL，在此條件下，多糖提取率為0.68%。此外，對多糖抗氧化活性研究結(jié)果顯示，多糖濃度為10 mg/mL時，對DPPH自由基的清除率為68%、其相應(yīng)的IC50值為7.62 mg/mL；對·OH的清除率為45.72%，其相應(yīng)IC50值為12.44 mg/mL，還原力大小為0.263。紅外光譜顯示該提取物具備一般多糖類物質(zhì)的光譜特征。

擬目烏賊肌肉；提??；多糖；抗氧化活性；紅外光譜

Abstract：To study the optimal alkaline extraction technology of Sepia lycidas muscle polysaccharides，the extraction temperature，NaOH concentration and ratio of raw material to water were optimized by response surface methodology design based on single-factor tests. The optimal extraction conditions were extraction temperature of 90℃，NaOH concentration of 3%，and ratio of raw material to water of 1∶28 g/mL，respectively.Under these conditions，the extraction yield of polysaccharides was 0.68%. In addition，the antioxidant activity of polysaccharides was evaluated. When the concentration was 10 mg/mL，the scavenging rate of DPPH was 68% with the IC50value of 7.62 mg/mL，and the scavenging ratio of·OH was 45.72% with the IC50value of 12.44 mg/mL.The value of reducing capacity was 0.263. Moreover，IR spectroscopic analysis showed the extract had the common spectroscopic characteristics of polysaccharides.

Key words：Sepia lycidas muscle；extraction；polysaccharides；antioxidant activity；IR spectrum

多糖（polysaccharide，PS）又稱多聚糖，是一種由醛糖和（或）酮糖通過脫水形成糖苷鍵，并由糖苷鍵線性或者分枝連接組成的鏈狀聚合物，具有多樣的生物活性，如抗氧化、抗腫瘤、抗凝血、抗病毒、抗炎等［1］。隨著人類對海洋藥用生物資源研究開發(fā)的逐漸深入，海洋動植物多糖研究也日益增多，目前已從鮑魚［1］、牡蠣［2］、四角蛤蜊［3］、瘤背石磺［4］、厚殼貽貝［5］、巴夫藻［6］分離出多種具有生物活性的多糖。

擬目烏賊（Sepia lycidas）屬于軟體動物門（Mollusca）、頭足綱（Cephalopoda）、鞘亞綱（Coleoidea）、烏賊目（Sepiida）、烏賊科（Sepiidae）、烏賊屬（Sepia），分布于印度洋、西太平洋海域，常棲息于水深15～100 m處［7］。烏賊的藥用價值很高，烏賊墨有抗癌、抗輻射、止血等作用；烏賊骨（海螵蛸）有各種收斂作用，可治療胃病等；烏賊肉和烏賊血有活血化瘀、滋陰等作用［8］，是一種營養(yǎng)價值和經(jīng)濟(jì)價值均較高的優(yōu)良海產(chǎn)品品種［9］。目前，除對烏賊墨多糖和性腺多糖的抗氧化活性有少量報道外［10-12］，關(guān)于擬目烏賊肌肉堿提多糖工藝優(yōu)化及抗氧化活性研究尚未見報道。本試驗對堿提擬目烏賊肌肉粗多糖工藝進(jìn)行優(yōu)化，并對其體外抗氧化活性進(jìn)行研究，考察其作為天然抗氧化劑的應(yīng)用前景，以期為擬目烏賊肌肉多糖綜合利用與開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

擬目烏賊于湛江市水產(chǎn)批發(fā)市場（霞山）收集得到，隨機(jī)挑選成體擬目烏賊10頭，每頭體重1.5（±0.5）kg，胴體長26（±4）cm，胴寬12（±4）cm。DPPH（AR），美國Sigma公司；三（羥甲基）氨基甲烷（BR），上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；K3［Fe（CN）6］（AR），天津大茂化學(xué)試劑廠；30%過氧化氫（AR）、抗壞血酸（AR），上海穗試劑公司；三氯乙酸（AR）、焦性沒食子酸（AR）、水楊酸（AR）、硫酸亞鐵（AR）、甲醇（AR）、無水乙醇（AR），廣州市金華大化學(xué)試劑有限公司；牛血清蛋白、苯酚、干酪素、酪蛋白、濃硫酸、磷酸氫二鈉、葡萄糖、磷酸二氫鈉、氫氧化鈉、檸檬酸、氯化鈉、考馬斯亮藍(lán)等均為國產(chǎn)分析純，湛江康百醫(yī)療器械有限公司。

DS-1高速組織搗碎機(jī)，上海標(biāo)本模型廠制造；UV-3000型紫外可見分光光度計，上海美譜達(dá)儀器有限公司。LGJ-18冷凍干燥機(jī)，北京四環(huán)科學(xué)儀器廠生產(chǎn)；DFY-200手提式高速中藥粉碎機(jī)，青州市三寶中藥機(jī)械廠；PHS-3C pH計，上海天達(dá)儀器有限公司；AUX320電子天平，日本島津公司；YN-Z0-Z-10全自動電熱蒸餾水器，上海博迅實業(yè)有限公司；HHS電熱恒溫水浴鍋，上海博迅實業(yè)有限公司；N-1100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海愛朗儀器有限公司；H/T18MM臺式離心機(jī)，湖南赫西儀器裝備有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 多糖制備 原料預(yù)處理：擬目烏賊解剖，去表皮、內(nèi)臟，得烏賊肌肉，切碎，加適量蒸餾水用組織搗碎機(jī)打成勻漿狀，采用丙酮脫脂3次，冷凍干燥，用中草藥粉碎機(jī)粉碎得擬目烏賊肌肉凍干粉，密封保存在-20℃冰箱，備用。

1.2.2 堿提取法 設(shè)置提取溫度為75、80、85、90、95℃，NaOH濃度為1%、2%、3%、4%、5%，料液比為 1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50 g/mL，每個處理3次重復(fù)。

根據(jù)Box-Benhnken的中心組和實驗設(shè)計原理，在單因素試驗基礎(chǔ)上，以提取溫度（A）、NaOH濃度（B）和料液比（C）為自變量進(jìn)行優(yōu)化組合，以多糖得率（Y）為指標(biāo)，進(jìn)行響應(yīng)面實驗設(shè)計，并利用軟件Design expert 8.0.6對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。試驗設(shè)計因素及水平見表1。

表1 試驗因素水平及編碼

1.2.3 擬目烏賊多糖含量的測定方法 采用苯酚-硫酸法［13］，將葡萄糖在105℃干燥至恒重，然后配置成100 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液，取7支試管，每支試管分別移取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液，再分別補(bǔ)水至2 mL，加入1 mL5.0%的苯酚溶液并混勻，快速加入5.0 mL濃硫酸搖勻，靜置30 min，在490 nm處測定各管中溶液的吸光度值，空白對照為蒸餾水，3次重復(fù)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算多糖得率：

式中，R為多糖得率，%；C為待測液中多糖質(zhì)量濃度，mg/mL；V為待測液體積，mL；N為稀釋倍數(shù)；m為擬目烏賊肌肉干粉質(zhì)量，g。

1.2.4 擬目烏賊多糖抗氧化活性測定 （1）清除DPPH自由基能力的測定。參照文獻(xiàn)［14］取不同質(zhì)量濃度的多糖溶液2 mL，將0.2 mmol/L DPPH的無水乙醇溶液2 mL加入并混勻，常溫避光反應(yīng)30 min，于517 nm波長處測定吸光度。陽性對照為VC，計算清除率：

式中，A0、A1和A2均為溶液的吸光度，分別對應(yīng)2 mL雙蒸水+2 mL DPPH、2 mL多糖溶液+2 mL DPPH、2 mL多糖溶液+2 mL無水乙醇。

（2）清除·OH自由基能力測定。參照文獻(xiàn)［15］取不同濃度多糖溶液1 mL，將9 mmol/L水楊酸-乙醇溶液1 mL、8.8 mmol/L H2O2溶液1 mL和9 mmol/L FeSO4溶液1 mL加入其中并混勻，37℃水浴30 min，3 000 r/min條件下離心10 min，510 nm波長處測定上清液的吸光度，陽性對照為VC，空白對照為雙蒸水，計算清除率：

式中，A0、AX和A1分別為空白對照溶液、加入多糖溶液和以雙蒸水代替H2O2溶液的吸光度。

（3）多糖還原力的測定。參照文獻(xiàn)［16-17］用試管取1.0 mL樣液，然后加入2.5 mL磷酸鹽緩沖液（0.2 mol/L、pH6.6）和2.5 mL K3［Fe（CN）6］溶液（1%），混勻后在50℃水浴中反應(yīng)20 min，迅速冷卻并加入2.5 mL10%三氯乙酸，混勻后以4 000 r/min離心10 min。取2.5 mL上清液加入0.5 mL 0.1%三氯化鐵溶液混勻，再加1 mL蒸餾水搖勻，以蒸餾水調(diào)零，室溫反應(yīng)10 min后700 nm處測定吸光值。以去離子水代替樣品作為空白對照，3次重復(fù)。

1.2.5 紅外光譜（IR）分析 取干燥后的樣品2 mg，在瑪瑙缽中與KBr粉末研磨均勻，并用壓片機(jī)壓成薄片，利用反射法在4 000～400 cm-1范圍內(nèi)，采用Nicolet 6700傅立葉紅外光譜儀進(jìn)行掃描。

采用Design expert 8.0.6軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

通過苯酚硫酸法，測得葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：Y=0.0969x-0.0007，R2=0.9959。式中，X為葡萄糖含量（mg/mL），Y為吸光值。

2.2 單因素試驗結(jié)果

2.2.1 提取溫度對多糖得率的影響 固定NaOH濃度3%，料液比1∶30 g/mL條件下，設(shè)置提取溫度分別為 75、80、85、90、95℃，考察其對多糖得率的影響，結(jié)果見圖1。如圖1所示，提取溫度由75℃升至90℃時，多糖得率不斷增加；當(dāng)溫度繼續(xù)升高時，多糖得率開始緩慢下降。原因可能是多糖的結(jié)構(gòu)和活性受到高溫影響，導(dǎo)致多糖降解，所以在本實驗設(shè)定條件下，確定最適提取溫度為90℃。

圖1 提取溫度對多糖得率的影響

2.2.2 NaOH濃度對多糖得率的影響 固定提取溫度90℃、料液比1∶30 g/mL條件下，設(shè)置NaOH濃度分別為1%、2%、3%、4%、5%，考察其對多糖得率的影響，結(jié)果見圖2。由圖2可知，NaOH濃度在1%～3%范圍時，多糖得率不斷增加，當(dāng)NaOH濃度超過3%時，多糖得率不斷下降。原因可能是過高的堿液濃度導(dǎo)致多糖結(jié)構(gòu)破壞，因此，從多糖得率的角度，選取NaOH濃度為3%。

圖2 NaOH濃度對多糖得率的影響

2.2.3 料液比對多糖提取率的影響

固定提取溫度90℃，NaOH濃度3%條件下，設(shè)置料液比 1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50 g/mL，考察料液比對多糖得率的影響，結(jié)果見圖3。從圖3可以看出，多糖得率隨著溶劑用量的增加而逐漸增加。料液比在1∶30 g/mL前，多糖得率增加顯著；料液比在1∶30 g/mL后，多糖得率增加緩慢。原因是當(dāng)提取溶劑較少時，多糖黏度較大，不利于其溶解，多糖得率較低；當(dāng)提取溶劑量增加時，多糖得到溶解充分，相同條件下其得率會升高；但當(dāng)提取溶劑增加到一定量時，多糖已被最大化地提取出來了，因此其得率不再增加。過多提取溶劑導(dǎo)致后續(xù)濃縮、醇沉等步驟工作量大，最后將1∶30 g/mL確定為最佳料液比。

圖3 料液比對多糖得率的影響

2.3 堿提工藝的響應(yīng)面試驗設(shè)計優(yōu)化及結(jié)果

2.3.1 建立回歸模型及檢驗顯著性 以單因素實驗為基礎(chǔ)，對提取溫度（A）、NaOH濃度（B）和料液比（C）3個因素，通過Box-Behnken設(shè)計響應(yīng)面來優(yōu)化多糖提取工藝，試驗設(shè)計與結(jié)果見表2。二次回歸模型和二次多元回歸方程通過Design expert 8.0.6軟件建立，結(jié)果如下：

Design Expert軟件分析結(jié)果見表3，此模型P=0.0014＜0.01，說明此模型達(dá)到極顯著水平。失擬項的P=0.1202＞0.05（不顯著）及R2=0.9430，表明該模型對實驗結(jié)果擬合程度較好，對實驗點的適配度達(dá)到94.30%，因此，能夠用該模型預(yù)測上述3個因素對多糖得率的影響，且誤差較小。由于分析模型回歸方程系數(shù)的P、A、B、C、A2、C2項的影響顯著，AB、AC、BC、B2影響不顯著，所以擬合方程消去不顯著項后，簡化為：

2.3.2 響應(yīng)曲面和等高線圖分析 等高線的形狀，可以形象觀察最佳參數(shù)以及各變量之間的相互作用，兩被測變量間交互作用如果顯著，則等高線呈橢圓形；反之，不顯著的話，等高線呈圓形［18］。從圖4 ～ 圖6可以看出，3個圖形的等高線均呈橢圓形，表明兩被測變量間即提取溫度和NaOH濃度、提取溫度和料液比和NaOH濃度和料液比之間的交互作用均是顯著的。

2.3.3 驗證與優(yōu)化 響應(yīng)面分析后的最優(yōu)提取條件為：提取溫度90.91℃、NaOH濃度3.02%、料液比1∶27.87g/mL，此條件下，多糖理論得率為0.693%。根據(jù)上述條件進(jìn)行3組驗證試驗，所得結(jié)果與預(yù)測值的偏差為1.88%（表4），偏差不大，結(jié)果穩(wěn)定，表明該模型能很好地預(yù)測堿提擬目烏賊肌肉多糖的提取工藝。

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果

表3 響應(yīng)面模型的方差分析

圖4 Z=f（A，B）的響應(yīng)面和等值線

圖5 Z=f（A，C）的響應(yīng)面和等值線

圖6 Z=f（B，C）的響應(yīng)面和等值線

表4 優(yōu)化工藝驗證結(jié)果

2.4 擬目烏賊肌肉多糖體外抗氧化活性

2.4.1 多糖對DPPH自由基清除能力 由圖7可知，多糖對DPPH自由基的清除作用明顯，清除率隨著多糖濃度的增加而逐漸增強(qiáng)，兩者具有明顯的量效關(guān)系。當(dāng)多糖濃度為10 mg/mL時，對DPPH自由基的清除率為68%。VC濃度為0.4 mg/mL時對DPPH自由基的清除率可達(dá)73%，與VC相比，多糖的清除率相對較弱。

圖7 多糖對DPPH自由基的清除作用

2.4.2 多糖對·OH自由基清除能力的測定 從圖8可以看出，多糖對·OH自由基有清除作用，且清除率隨著多糖濃度的增加而逐漸增強(qiáng)，呈現(xiàn)一定的正相關(guān)性。當(dāng)多糖濃度為10 mg/mL時，其清除率為45.72%，而當(dāng)VC濃度僅為0.3 mg/mL時，清除率可達(dá)46%。

圖8 多糖對·OH自由基的清除作用

2.4.3 多糖還原力的測定 已有研究表明，還原力越大，抗氧化性越強(qiáng)［19］。從圖9可以看出，在所選濃度范圍內(nèi)，多糖顯示出一定的還原力，且還原力隨濃度的增加而增強(qiáng)，當(dāng)多糖濃度為10 mg/mL時，還原力為0.263，達(dá)到相同效果的VC濃度僅為0.04 mg/mL（還原力大小為0.241）。

圖9 多糖的還原力

2.5 擬目烏賊肌肉多糖對·OH自由基和DPPH自由基半清除率濃度（IC50）比較

從表5可以看出，擬目烏賊肌肉多糖對DPPH自由基和·OH自由基的IC50值分別為7.62和12.44 mg/mL，均高于VC的IC50值（0.20、0.38 mg/mL）。擬目烏賊肌肉多糖對這2種自由基的半清除率濃度有差異，其中對DPPH自由基的半清除率濃度要低于·OH自由基，清除效果相對而言較好。

表5 擬目烏賊肌肉多糖對·OH自由基和DPPH自由基半清除率濃度（IC50）比較

2.6 多糖紅外光譜分析

圖10 多糖的紅外譜圖

由圖10可知，在3 600～3 200 cm-1處，出現(xiàn)一個吸收較強(qiáng)的寬峰：3 420.16 cm-1，為-OH伸縮振動峰。在3 000～2 800 cm-1范圍出現(xiàn)弱的吸收：2 959.35 cm-1，為C-H伸縮振動峰。在1 400～1 200 cm-1處存在C-H變角振動，為1 399.81 cm-1吸收峰。在1 200～1 000 cm-1處的吸收峰是由吡喃糖環(huán)的醚鍵（C-O-C）和-OH伸縮振動引起的，其吸收峰是1 168.68 cm-1，此四組吸收峰均是糖類物質(zhì)的特征吸收峰［20］，說明本實驗堿法獲得的提取物為多糖類物質(zhì)。另外，1 654.66 cm-1處分別有一強(qiáng)的吸收峰，為酰胺I帶的吸收峰；1 558.26 cm-1是N-H的變角振動，為酰胺II帶的吸收峰，證明該提取物中有少量與糖結(jié)合的蛋白（如糖蛋白）存在［21］。592.95 cm-1是 O-H 面外彎曲振動吸收峰［22］。

3 結(jié)論與討論

采用堿法提取擬目烏賊肌肉多糖，在單因素實驗基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝，結(jié)果表明：擬目烏賊肌肉多糖堿提法的最佳工藝條件為：提取溫度90℃、NaOH濃度3%、料液比1∶28g/mL，在此條件下，擬目烏賊肌肉多糖得率為 0.68%，高于南極磷蝦［23］、海螵蛸［24］多糖提取的得率，與擬目烏賊［11］、鮑魚［25］的得率相當(dāng)。

堿提擬目烏賊肌肉多糖在濃度為10 mg/mL條件下，對DPPH自由基的清除率為68%，其IC50值為7.62 mg/mL；對·OH自由基的清除率為45.72%，其IC50值為12.44 mg/mL；還原力大小為0.263。聶少平等［26］采用90℃攪拌提取茶葉多糖對DPPH自由基的清除率為35.7%；戴宏杰等［11］研究擬目烏賊生殖腺多糖在濃度為10 mg/mL條件下，對·OH自由基清除率為39.77%；羅曉航等［1］研究表明，酶法提取鮑魚臟器粗多糖對·OH自由基的IC50值為20 mg/mL，本試驗結(jié)果與上述報道的結(jié)果相比較好。殷紅玲等［27］采用酶液提取的蝦夷扇貝內(nèi)臟多糖，在濃度為6.5 mg/mL條件下，對·OH自由基清除率達(dá)到84.75%，其IC50值為1.3 mg/mL；陳煉紅等［28］采用復(fù)合酶法提取松茸多糖，該糖對DPPH自由基具有較強(qiáng)的清除作用，其IC50值為0.454 mg/mL；朱曉宦等［29］發(fā)現(xiàn)水提馬齒莧粗多糖對羥基自由基的半清除濃度為3.5 mg/mL；王雪等［30］研究發(fā)現(xiàn)，蛹蟲草基質(zhì)多糖在濃度為2 mg/mL時，對DPPH自由基的清除率高達(dá)90%；本研究還發(fā)現(xiàn)超聲波－酶提法所得多糖的總還原力最高，當(dāng)多糖濃度為2.0 mg /mL時，其總還原力高達(dá) 0.306，上述文獻(xiàn)［27～30］報道的抗氧化活性結(jié)果優(yōu)于本實驗結(jié)果。程知慶等［4］研究干燥方法對瘤背石磺多糖還原力的影響，結(jié)果表明當(dāng)濃度為10 mg/mL時，凍干多糖的還原能力約0.25，與本實驗結(jié)果接近。

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（責(zé)任編輯 白雪娜）

Optimization of alkaline extraction technology of polysaccharides from muscle of Sepia lycidas and study on its antioxidant activity

SUN Yu-lin1，2，CHEN Xi-kun1，HUANG Guan-peng1，CHEN Jing-jing1，CHEN Wei1，ZHANG Chuan-yao1，ZHOU Ying1，CHEN Dao-hai1，2
（1.Life Science and Technology School，Lingnan Normal University，Zhanjiang 524048，China；2.Round Beibu Gulf Institute for the Protection and Utilization of Marine Animals in Medicine，Zhanjiang 524048，China）

TS201.2

A

1004-874X（2017）06-0120-09

孫玉林，陳錫堃，黃冠鵬，等.堿提擬目烏賊肌肉多糖工藝優(yōu)化及抗氧化活性研究［J］.廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，44（6）：120-128.

2017-04-20

廣東省自然科學(xué)基金（2015A030310406）；廣東省教育廳特色創(chuàng)新項目（2016KTSCX081）；廣東省省部產(chǎn)學(xué)研合作專項（2013B090500036）；湛江市財政資金科技專項競爭性分配項目（2013A05004, 2015A06008）

孫玉林（1980-），男，博士，講師，E-mail：sunyulin07002@126.com

陳道海（1963-），男，教授，E-mail：dhchen11@21cn.com.