光枝勾兒茶主要成分提取工藝的優(yōu)化

唐遠(yuǎn)江，尚以順，周思旋，楊粵黔，張 濤，余 波

（1.貴州宏宇畜牧技術(shù)發(fā)展有限公司，貴州 貴陽 550005；2. 貴州省畜牧獸醫(yī)研究所，貴州 貴陽 550005）

光枝勾兒茶主要成分提取工藝的優(yōu)化

唐遠(yuǎn)江1，2，尚以順1，周思旋2，楊粵黔1，2，張 濤1，2，余 波1，2

（1.貴州宏宇畜牧技術(shù)發(fā)展有限公司，貴州 貴陽 550005；2. 貴州省畜牧獸醫(yī)研究所，貴州 貴陽 550005）

光枝勾兒茶是民族中藥材，為研究同時提取光枝勾兒茶中蘆丁和槲皮素的最佳條件，采用回流提取法、響應(yīng)面分析法，考察乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度、料液比3個因素及其交互作用和提取時間對提取工藝的影響。結(jié)果表明，光枝勾兒茶蘆丁和槲皮素的最佳提取條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)73.72%、溫度60.52℃、液料比32.21 mL/g，提取時間3 h，蘆丁、槲皮素的提取率分別為18.55、0.36 mg/g，通過試驗驗證得到蘆丁、槲皮素的提取量平均值分別為18.48、0.35 mg/g，與理論值相比誤差小。試驗結(jié)果為光枝勾兒茶蘆丁和槲皮素的開發(fā)和利用提供理論依據(jù)。

光枝勾兒茶；蘆丁；槲皮素；回流提取；響應(yīng)面

Abstract：Berchemia polyphylla var. leioclada. is a national medicine plant. In order to find the optimum condition of rutin and quercetin from B. polyphylla var. leioclada. reflux extraction method and surface response analysis were used，ethanol concentration，extraction temperature，solid-liquid ratio factors and their ineraction and extracting time were designed to optimize the extracting process. The results showed that the best extraction condition of rutin and quercetin were selected with 73.72% alcohol，60.52℃ and 32.21 mL/g of solid-liquid ratio，extracting time was 3 h. The extraction rates of rutin and quercetin were 18.55 and 0.36 mg/g，respectively.Through experiment study，the average of rutin and quercetin were 18.48 and 0.35 mg/g，respectively，which had a lillte error to the theory value. The results provide a theoretical basis for further development and use of rutin and quercetin from B. polyphylla var. leioclada.

Key words：Berchemia polyphylla var. leioclada.；rutin；quercetin；reflux extraction；response surface

光枝勾兒茶（Berchemia polyphylla var.leioclada.）屬于鼠李科勾兒茶屬植物，是鐵包金的一種，又名老鼠耳、烏龍根，貴州苗家常用藥材，多以根、莖、葉入藥，有清熱利濕，化痰止咳等功效［1］。勾兒茶屬植物味苦、平，具有止血止痛、祛風(fēng)濕等功效，對風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、肺結(jié)核、蕁麻疹、急慢性氣管炎、黃疸、睪丸腫痛、婦女痛經(jīng)、痢疾、跌打損傷、癰腫瘡毒等癥有良好治療作用［2］。研究表明，該屬植物的化學(xué)成分包括苷類、醌類、木脂素類、萜類以及黃酮類［3］等，具有抗氧化［4］、抗腫瘤［5-6］、抗腹瀉［7］、消炎鎮(zhèn)痛［8］、抑菌［9］等作用。勾兒茶屬植物作為一種重要的中藥材，在臨床、中獸藥研發(fā)上具有重要作用，以勾兒茶屬植物為主要入藥的止痢散能有效抗腹瀉［10］，且對動物無毒副作用［11］。

由于中獸藥制劑多為復(fù)方制劑，很難對其中單一成分的藥效進(jìn)行評估，因此必須根據(jù)有效成分含量對復(fù)方制劑進(jìn)行質(zhì)量控制。廣西中藥材標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定以蘆丁、槲皮素、β-谷甾醇為鐵包金藥材的指標(biāo)成分，根據(jù)有效成分含量多少進(jìn)行質(zhì)量優(yōu)劣評估［12］。蘆丁、槲皮素屬于黃酮類化合物，黃酮類化合物的提取方法有煎煮法、回流提取法、索氏提取法、超聲提取法等［13］。工業(yè)化生產(chǎn)中多采用煎煮法和回流提取法，但水煎煮法很難有效提取黃酮類化合物［14］。光枝勾兒茶作為一種重要的獸用中藥材，目前關(guān)于其蘆丁和槲皮素的提取研究較少。本研究為了確定同時提取光枝勾兒茶中蘆丁和槲皮素的最佳工藝，通過回流法提取目標(biāo)物質(zhì)，采用響應(yīng)面法優(yōu)化提取條件，以期能有效開發(fā)和利用光枝勾兒茶中的蘆丁和槲皮素，同時為以該植物入藥的中獸藥提供質(zhì)量控制依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

光枝勾兒茶樣品，由貴州省畜牧獸醫(yī)研究所獸用中草藥研究室提供，經(jīng)貴州省畜牧獸醫(yī)研究所尚以順研究員鑒定為Berchemia polyphylla var. leioclada.。蘆丁、槲皮素對照品購自上海源葉生物科技有限公司，色譜甲醇購自賽默飛世爾科技有限公司，試劑均為分析純。試驗主要設(shè)備包括BSA224S電子分析天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）、LC-20高效液相色譜儀（日本島津公司）等。

1.2 試驗方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 分別精密量取0.4 mg蘆丁、槲皮素對照品，置入10 mL容量瓶，加入少量甲醇，超聲溶解，冷卻后定容，配制成0.4 mg/mL的蘆丁、槲皮素標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別以兩種對照品溶液為標(biāo)樣，精密量取配制成含有蘆丁、槲皮素 0.016、0.032、0.048、0.064、0.080 mg/mL的混合液。HPLC檢測蘆丁、槲皮素含量，分別以峰面積的積分值Y為縱坐標(biāo)，蘆丁、槲皮素濃度X為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)線性范圍，連續(xù)進(jìn)樣6次，計算回樣品收率和峰面積相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）檢測條件［15］：色譜柱為Diamonsil C18柱（4.6×250 mm，5 μm），流動相為甲醇∶水=55∶45，柱溫28℃，檢測波長為257 nm，進(jìn)樣量為10 μL，流速為1.0 mL/min。

1.2.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對提取率的影響 取光枝勾兒茶粉末1 g，按照液料比30 mL/g分別加入體積分?jǐn)?shù)為0、20%、40%、60%、80%、100%的乙醇溶液，70℃下回流提取2 h，以4 000 r/min離心10 min，沉淀部分重復(fù)提取1次，合并濃縮上清液，置于50 mL容量瓶中，定容、搖勻后過0.45 μm濾膜得到供試品溶液。HPLC檢測蘆丁、槲皮素含量。每個試驗組3次平行（下同）。

1.2.3 料液比對提取率的影響 稱取光枝勾兒茶粉末 1 g，按照液料比為 10、20、 30、40、50 mL/g分別加入70%乙醇溶液，70℃下回流提取2 h后檢測蘆丁、槲皮素的含量。

1.2.4 提取時間對提取率的影響 稱取光枝勾兒茶粉末1 g，按照液料比為30 mL/g加入70%乙醇溶液，70℃下分別提取 1、2、3、4、5 h，檢測蘆丁和槲皮素的含量。

1.2.5 提取溫度對提取率的影響 稱取光枝勾兒茶粉末1 g，按照料液料比為30 mL/g加入70%乙醇溶液，分別在 50、60、70、80、90℃溫度條件下回流提取2 h，檢測蘆丁和槲皮素的含量。

1.2.6 Box-Behnken試驗 根據(jù)Box-Behnken的中心組合試驗設(shè)計原理，以蘆丁、槲皮素含量為目標(biāo)函數(shù)響應(yīng)值，選取乙醇體積分?jǐn)?shù)（X1）、料液比（X2）、溫度（X3）設(shè)計3因素3水平的響應(yīng)面分析試驗，其因素水平見表1。

表1 響應(yīng)面試驗設(shè)計

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

試驗得到蘆丁、槲皮素的標(biāo)準(zhǔn)曲線為別為Y= （2E+07） X-11925，R2= 0.9965，Y = （2E+07）X-36384，R2= 0.9962，蘆丁平均回收率為97.91%，RSD為2.85%，槲皮素平均回收率為98.64%，RSD為3.14%，表明蘆丁和槲皮素濃度均在0.016～0.080 mg/mL內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

2.2 最佳乙醇體積分?jǐn)?shù)

乙醇體積分?jǐn)?shù)為0、20%、40%、60%、80%、100%時，光枝勾兒茶蘆丁含量分別為1.89、3.02、6.11、13.68、18.32、18.55 mg/g，槲皮素含量分別為 0.08、0.12、0.25、0.32、0.34、0.35 mg/g。乙醇濃度越高，主要成分的提取量越高，但工業(yè)生產(chǎn)成本也高，因此初步確定最佳乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%。

2.3 最佳料液比

料液比為 10、20、30、40、50 mL/g時，光枝勾兒茶蘆丁含量分別為10.25、15.64，17.38、17.68、16.32、15.69 mg/g，槲皮素含量分別為0.12、0.26、0.35、0.32、0.27、0.24 mg/g，液料比為35 mL/g 時蘆丁、槲皮素的提取量均達(dá)到最大。提取溶劑極性與目標(biāo)成分極性越相近越有利于目標(biāo)成分提?。?6］，但增大溶劑量也增加濃縮時間，造成濃縮時能量損耗，因此選擇液料比30 mL/g 較合適。

2.4 最佳提取時間

提取時間為1、2、3、4、5 h時，光枝勾兒茶蘆丁含量分別為16.85、17.74、18.68、18.03、17.92 mg/g，槲皮素含量分別為0.24、0.32、0.38、0.42、0.39 mg/g。兩者提取量在提取時間為3 h時達(dá)到最高，長時間加熱可使蘆丁、槲皮素發(fā)生降解而轉(zhuǎn)變成其他物質(zhì)，由此確定最佳提取時間為3 h。

2.5 最佳提取溫度

提取溫度為 50、60、70、80、90℃時，光枝勾兒茶蘆丁含量分別為14.84、17.83、18.78、17.24、15.71、15.16 mg/g；槲皮素含量分別為0.35、0.42、0.38、0.33、0.29、0.26 mg/g。蘆丁的提取量在60℃時達(dá)到最大，槲皮素的提取量70℃時達(dá)到最大，但與60℃時相差不大。高溫條件有利于蘆丁、槲皮素浸出，但高溫條件下兩者易發(fā)生降解、縮合、氧化等化學(xué)反應(yīng)而影響其穩(wěn)定性［17］。因此初步選擇60℃作為最佳提取溫度。

表2 響應(yīng)面試驗結(jié)果

2.6 響應(yīng)面分析提取工藝

2.6.1 響應(yīng)面模型回歸分析 響應(yīng)面試驗結(jié)果見表2，采用Design-Expert 8.0.6 Trial軟件對表2進(jìn)行多元回歸擬合，建立蘆丁、槲皮素提取量對X1、X2、X3的二次多項回歸方程，蘆丁提取量Y = 18.43+1.12X1-0.24X2+0.46X3-

槲皮素提取量Y = 0.38+（2.500E-003）X1-（1.250E-003）X2+0.019X3+（7.500E-003）

2.6.2 蘆丁提取條件的響應(yīng)面分析 由表3可知，模型F值為35.73，P＜0.001，說明響應(yīng)回歸模型極顯著。失擬項P=0.0712＞0.05，失擬不顯著，模型校正系數(shù)R2=0.9232，說明該模型擬合度較好，可用該模型對蘆丁提取進(jìn)行分析和預(yù)測。由P值可知各因素中二次項、、影響均顯著，對蘆丁提取量的影響大?。篨1＞X3＞X2。各個因素交互實驗的響應(yīng)面如圖1所示。響應(yīng)面圖呈馬鞍形表示兩個因素交互作用顯著，圓形則表示不顯著［18］。由圖1可知X1和X3，X2和X3的響應(yīng)面陡峭，表明他們之間交互作用較顯著，X1和X2相互作用不顯著。

表3 蘆丁提取條件的方差分析

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)、溫度和液料比交互作用對蘆丁提取影響的響應(yīng)

2.6.3 槲皮素提取條件的響應(yīng)面分析 由表4可知，模型F值為9.18，P＜0.001，說明響應(yīng)回歸模型極顯著。失擬項P=0.4063＞0.05，失擬不顯著，模型校正系數(shù)R2=0.9259，說明該模型擬合度良好。由P值可知各個因素中二次項?。篨3＞X1＞X2。各個因素交互實驗的響應(yīng)面見圖2。圖2所示X1和X3，X2和X3的響應(yīng)面圖陡峭，表明其交互作用顯著，X1和X2相互作用不顯著。

2.6.4 最優(yōu)提取條件 根據(jù)回歸模型分析得到光枝勾兒茶中蘆丁、槲皮素的最優(yōu)提取條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)73.72%、提取溫度60.52℃、液料比32.21 mL/g，提取時間3 h，蘆丁、槲皮素含量的理論值分別為18.55、0.36 mg/g。在此最佳工藝條件下，通過3次平行試驗驗證后得到蘆丁、槲皮素的提取量平均值分別18.48、0.35 mg/g，在誤差范圍內(nèi)達(dá)到試驗預(yù)期目的，說明此工藝提取光枝勾兒茶主要成分工藝可靠。

表4 槲皮素提取條件的方差分析

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)、溫度和液料比交互作用對槲皮素提取影響的響應(yīng)

3 結(jié)論與討論

本試驗得到光枝勾兒茶蘆丁、槲皮素的最優(yōu)提取條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)73.72%、提取溫度60.52℃、液料比32.21 mL/g、提取時間3 h。根據(jù)文獻(xiàn)報道，蘆丁和槲皮素的最佳提取條件有所不同。劉曉靜等［19］采用浸漬法取紅棗中蘆丁的最佳條件是乙醇體積分?jǐn)?shù)74%、溫度72℃、液料比43 mL/g，與之相比，本試驗的液料比較低，乙醇體積分?jǐn)?shù)相差不大、提取溫度較高?？掳l(fā)敏［20］的研究得出回流法提取趕黃草中槲皮素的最佳條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)80%、溫度75℃、液料比15 mL/g，與之相比，本試驗的液料比較高，提取溫度、乙醇體積分?jǐn)?shù)較低。

本試驗在考察提取時間對蘆丁和槲皮素提取率的影響時發(fā)現(xiàn)，提取時間越長，溫度始終保持恒定，但主要成分的提取率有所下降，因此在響應(yīng)面設(shè)計中不考慮提取時間的影響。同時在提取過程發(fā)現(xiàn)提取3次可使有效成分完全浸出，故每個平行試驗均提取3次。響應(yīng)面法是國內(nèi)外常用的試驗分析方法，采用非線性模型擬合，準(zhǔn)確性高，實驗精度優(yōu)于正交設(shè)計，試驗預(yù)測值能更好地考察參數(shù)合理性和試驗設(shè)計的準(zhǔn)確性［21］。本試驗首次采用響應(yīng)面法優(yōu)化光枝勾兒茶蘆丁和槲皮素的提取條件，響應(yīng)面分析表明，高濃度的乙醇有利于蘆丁的提取，但在工業(yè)化生產(chǎn)中使用高濃度乙醇成本較高，因此在后續(xù)試驗中應(yīng)降低乙醇體積分?jǐn)?shù)來考察蘆丁和槲皮素的最優(yōu)提取條件。

光枝勾兒茶的復(fù)方制劑在臨床上已有許多運用，本試驗的提取工藝為光枝勾兒茶蘆丁和槲皮素的開發(fā)利用提供了理論支持，但粗提物成分復(fù)雜，難以確定各成分的生物活性，在后續(xù)的研究中，項目組應(yīng)對該藥材的化學(xué)成分和藥理作用進(jìn)行研究，明確各化學(xué)成分的活性，使該藥材在開發(fā)利用和臨床研究上具有重要意義。

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（責(zé)任編輯 崔建勛）

Extraction optimization of main ingredients from Berchemia polyphylla var. leioclada.

TANG Yuan-jiang1，2，SHANG Yi-shun1，ZHOU Si-xuan1，YANG Yue-qian1，2，ZHANG Tao1，YU Bo1，2
（1.Guizhou Hongyu Animal Husbandry Technology Development Ltd，Guiyang 550005，China；2. Guizhou Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine，Guiyang 550005，China）

R284.2

A

1004-874X（2017）06-0114-06

唐遠(yuǎn)江，尚以順，周思旋，等.光枝勾兒茶主要成分提取工藝的優(yōu)化［J］.廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，44（6）：114-119.

2017-04-21

貴州省科學(xué)技術(shù)重大專項（黔科合[2013]6014）；貴州省農(nóng)業(yè)科技計劃建設(shè)項目（黔科合農(nóng)G字[2015]4001）

唐遠(yuǎn)江（1987- ），男，碩士，研究實習(xí)員，E-mail：tangyjjay0909@126.com

余波(1981- )，男，碩士，副研究員，E-mail：yubonky@163.com