巴馬香豬氨基肽酶N截短基因的克隆與原核表達(dá)

王文秀，張 艷，王寶琴，謝金文，劉 博，沈志強(qiáng)*

( 1.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東濱州 256600；2.海南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，海南?？?571100；3.濱州學(xué)院生物工程學(xué)院，山東濱州 256600)

巴馬香豬氨基肽酶N截短基因的克隆與原核表達(dá)

王文秀1，張 艷2，王寶琴3，謝金文1，劉 博1，沈志強(qiáng)1*

( 1.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東濱州 256600；2.海南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，海南海口 571100；3.濱州學(xué)院生物工程學(xué)院，山東濱州 256600)

為獲得豬流行性腹瀉病毒(PEDV)受體豬氨基肽酶N(pAPN)抗原，提取巴馬香豬小腸絨毛上皮的總RNA，PCR擴(kuò)增獲得pAPN基因的主要抗原區(qū)片段，并將其克隆至原核表達(dá)載體pET-32a中，將重組質(zhì)粒pET-32a-pAPN轉(zhuǎn)化大腸埃希菌BL21，通過不同濃度的IPTG、不同誘導(dǎo)時間進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，以確定目的蛋白表達(dá)的最佳條件。經(jīng)SDS-PAGE和抗組氨酸標(biāo)簽的單抗進(jìn)行Western blot檢測重組蛋白在大腸埃希菌中的表達(dá)，結(jié)果顯示，原核表達(dá)產(chǎn)物在誘導(dǎo)溫度37℃、IPTG濃度為0.8 mmol/L，誘導(dǎo)4 h可獲得最佳表達(dá)，產(chǎn)物分子質(zhì)量約為45 ku，獲得的目的蛋白大小與預(yù)期一致。

巴馬香豬；氨基肽酶N；克??；原核表達(dá)

1971年在英國豬群首次發(fā)生豬流行性腹瀉(Porcine epidemic diarrhea，PED)，6年后才被證實病原為豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)，該病以腹瀉、嘔吐和脫水為主要特征，病死率高，尤其7日齡內(nèi)哺乳仔豬病死率可達(dá)100%。該病近年來在泰國、日本等多個國家流行，對養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重危害[1-2]，2015年美國也遭遇PED的大規(guī)模暴發(fā)[3-5]。PEDV難以在體外培養(yǎng)，自病原發(fā)現(xiàn)以來，研究者嘗試多種方法試圖體外培養(yǎng)該病毒均未獲得成功，成為病毒學(xué)上的難題。1988年Hofmann H等首次將胰酶加入Vero傳代細(xì)胞培養(yǎng)液中，經(jīng)過5次連續(xù)傳代后細(xì)胞發(fā)生病變[6-7]，解決PEDV體外細(xì)胞培養(yǎng)的難題。但近年來，PEDV的體外分離再次遇到困難，很多來自臨床典型病例的樣品，經(jīng)PCR檢測確定為陽性，卻無法從原來的Vero細(xì)胞中分離到病毒。推測流行毒株有可能發(fā)生了一定變異或流行毒株與過去的毒株間生物學(xué)特性產(chǎn)生了一定差異，從而影響了病毒在Vero 細(xì)胞增殖的適應(yīng)過程。

氨基肽酶N(amibopeptidase N，APN)廣泛分布于哺乳動物的多種組織細(xì)胞表面，尤其大量存在于小腸的微絨毛表面[8]。研究證實，APN是Ⅰ型冠狀病毒的主要細(xì)胞受體，病毒S蛋白與APN具有種屬特異性的氨基酸識別，并通過黏附結(jié)合進(jìn)而感染宿主細(xì)胞[9-11]。李寶賢等[12]通過脂質(zhì)體介導(dǎo)將pAPN基因轉(zhuǎn)染PEDV的非容許性細(xì)胞MDCK，進(jìn)一步通過PEDV感染細(xì)胞，結(jié)果證實pAPN是PEDV的受體，為PEDV的體外增殖及提高滴度提供了試驗依據(jù)。已有研究報道[13-16]在PEDV培養(yǎng)體系中添加pAPN后滴度明顯提高，推測PEDV在細(xì)胞中的增殖與氨基肽酶的分布和含量有關(guān)系，但為什么添加外源受體后PEDV的病毒產(chǎn)量會增加？其機(jī)制尚不清楚。目前尚未見關(guān)于研究pAPN在不同細(xì)胞的表達(dá)和分布及其與PEDV增殖之間關(guān)系的報道。

由于pAPN全基因的表達(dá)存在一定困難，本研究采用截短表達(dá)的策略，對pAPN全基因進(jìn)行蛋白表位分析，并選取pAPN抗原決定簇表位相對密集的片段進(jìn)行截短表達(dá)，為獲得pAPN的多克隆抗體并檢測pAPN在細(xì)胞中的分布及其表達(dá)量，進(jìn)一步研究PEDV的受體與病毒之間相互作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 載體和細(xì)胞 原核表達(dá)載體pET-32a和BL21(DE3)均由山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院、預(yù)防獸醫(yī)學(xué)與動物生物技術(shù)重點(diǎn)開放實驗室保存。

1.1.2 主要試劑 RNA提取試劑盒、高純質(zhì)粒小量抽提試劑盒、DNA純化回收試劑盒，北京百泰克生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和HindⅢ、rTaqDNA聚合酶、T4DNA連接酶、DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000 和預(yù)染蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)等，NEB公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 截短pAPN引物設(shè)計與合成 根據(jù)Genbank發(fā)表的pAPN基因序列(XM-005653524)，選擇pAPN的主要功能域片段設(shè)計1對引物，上游引物：F：5′-ATCGGGATCCATGGTCCCTGTCACCCTG-3′，下游引物R：5-′CCGAAGCTTGCTGTGCTCTATGAAC-3′，其中下劃線部分表示引入的BamHⅠ和HindⅢ酶切位點(diǎn)，引物送至上海捷瑞生物工程有限公司進(jìn)行合成。

1.2.2 總RNA的提取和目的片段pAPN的擴(kuò)增 取新鮮的富含腸絨毛的一段豬小腸用液氮快速研磨成粉末狀，并迅速將粉末刮入-80℃預(yù)冷的EP管中，按試劑盒說明書提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以反轉(zhuǎn)錄后得到的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)總體系為25 μL：cDNA 2.0 μL，上、下游引物各1 μL，10×PCR buffer 2.5 μL，2.5 mmol/L dNTP 2 μL，5 U/μL的rTaqDNA 聚合酶0.25 μL，ddH2O調(diào)節(jié)使總體積達(dá)25 μL。PCR反應(yīng)程序為：95℃ 5 min；95℃ 45 s，58 ℃ 1 min，72℃ 50 s，共30個循環(huán)；72℃ 10 min，4℃結(jié)束反應(yīng)，預(yù)計片段大小882 bp。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物于瓊脂糖凝膠電泳觀察。

1.2.3 表達(dá)載體pET-32a-pAPN的構(gòu)建及鑒定 將pAPN PCR回收產(chǎn)物和表達(dá)載體pET-32a(+)分別用BamHⅠ和HindⅢ雙酶切，并回收目的片段，用T4 DNA連接酶連接并轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，從含有氨芐的LB平板中挑取單克隆，經(jīng)PCR和雙酶切鑒定的陽性菌株送上海捷瑞生物工程有限公司測序，測序正確的質(zhì)粒命名為pET-32a-pAPN。

1.2.4 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及優(yōu)化 將重組表達(dá)質(zhì)粒pET-32a-pAPN轉(zhuǎn)入到大腸埃希菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落接種于含氨芐青霉素(Amp)(100 μg/mL)的 LB 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，取PCR鑒定為陽性的菌液50 μL接種于5 mL新鮮LB液體培養(yǎng)基中，并添加同濃度的Amp，37℃條件下以180 r/min振蕩培養(yǎng)，當(dāng)OD 600 nm值達(dá)0.6左右時，分別加入不同終濃度的IPTG(0.2 mmol/L～1.2 mmol/L) 至培養(yǎng)液中，誘導(dǎo)后每間隔1 h收集2 mL菌液樣品，于12 000 r/min離心5 min后棄上清，收集沉淀用PBS洗2次，加入200 μL PBS重懸，置冰上超聲破碎后，離心使上清和沉淀分離。加上樣buffer至上清中，煮沸10 min，取誘導(dǎo)的空載體菌及未誘導(dǎo)的重組菌作為對照，進(jìn)行SDS-PAGE。

1.2.5 重組蛋白表達(dá)形式的鑒定 根據(jù)1.2.4結(jié)果選取最佳時間點(diǎn)進(jìn)行目的蛋白的大量誘導(dǎo)表達(dá)，菌液以12 000 r/min離心5 min，收集菌體沉淀，用PBS重懸并洗滌2次，菌體重懸于適量PBS，冰浴條件下進(jìn)行超聲破碎。分別收集沉淀和上清，進(jìn)行SDS-PAGE電泳。

1.2.6 重組蛋白的免疫印跡檢測 pAPN重組蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳后，相應(yīng)條帶轉(zhuǎn)印至PVDF膜，再將膜置于脫脂奶粉(50 g/L)中，在4℃條件下過夜封閉，然后轉(zhuǎn)入用PBST 1∶2 000稀釋的鼠源抗His標(biāo)簽一抗中，室溫?fù)u床孵育2 h，用PBST 液將膜洗3次。再轉(zhuǎn)入1∶5 000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG中，室溫?fù)u床孵育1 h，PBST洗膜3次，DAB顯色后于凝膠成像系統(tǒng)中觀察結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 pAPN截短基因片段的PCR擴(kuò)增

pAPN PCR擴(kuò)增產(chǎn)物于10 g/L凝膠電泳后，可見在882 bp處有一特異性擴(kuò)增條帶，與預(yù)期擴(kuò)增片段大小相符(圖1)。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000; 1、2.pAPN PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

M.DNA Marker DL 2 000; 1，2.pAPN PCR products

圖1 pAPN PCR擴(kuò)增結(jié)果

Fig.1 PCR Amplification result of pAPN gene

2.2 pET32a-pAPN的鑒定

pET32a-pAPN質(zhì)粒經(jīng)BamHⅠ和HindⅢ雙酶切后獲得2個片段，與預(yù)期大小一致(圖2)，陽性質(zhì)粒pET32a-pAPN送公司測序后的結(jié)果與參考序列相同，閱讀框正確。

2.3 重組蛋白表達(dá)條件的優(yōu)化、可溶性分析及鑒定

將含有重組表達(dá)載體pET-32a-pAPN的表達(dá)菌液按1.2.4所述誘導(dǎo)條件誘導(dǎo)表達(dá)后，離心菌體沉淀，超聲破碎細(xì)胞，通過SDS-PAGE電泳表明重組蛋白以包涵體形式表達(dá)(圖3)；誘導(dǎo)2 h蛋白開始表達(dá)，但表達(dá)量少，3 h～6 h各組蛋白表達(dá)量明顯增加，可將誘導(dǎo)時間定為6 h(圖4)；誘導(dǎo)的IPTG濃度可定位0.8 mmoL/L(圖5)。

2.4 重組蛋白的Western blot分析

鼠抗His單抗作為一抗，表達(dá)載體在45 ku處有目的條帶，大小與預(yù)期結(jié)果一致；空載體在預(yù)期大小處未見條帶。結(jié)果表明表達(dá)載體帶有His標(biāo)簽，重組蛋白與His標(biāo)簽融合表達(dá)(圖6)。

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 15 000; 1～3.重組質(zhì)粒pET-32a-pAPNBamHⅠ/HindⅢ酶切

M.DNA Marker DL 15 000; 1-3.Recombinant plasmid pET-32a-PAPN digested byBamHⅠ/HindⅢ

圖2重組質(zhì)粒pET-32a-pAPN雙酶切鑒定

Fig.2 Identification of recombinant plasmid pET-32a-PAPN by double enzyme digestion

1.誘導(dǎo)的pET-32a空載體對照；2.蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；3.pET-32a-pAPN未誘導(dǎo)對照；4.pET-32a-pAPN誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物超聲破碎后上清；5.重組質(zhì)粒pET-32a-pAPN誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物超聲破碎后沉淀

1.Induced vector pET-32a; 2.Protein molecular weight Marker; 3.Uninduced vector of pET-32a; 4.Supernatant after ultrasonic disruption of induced pET-32a-pAPN expression products; 5.Precipatate after ultrasonic disruption induced pET-32a-pAPN expression products

圖3重組質(zhì)粒pET-32a-pAPN表達(dá)產(chǎn)物可溶性分析

Fig.3 Solubility analysis of expression products of recombinant plasmid pET-32a-pAPN

1.誘導(dǎo)的pET-32a空載體；2.蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；3～9.分別為 37℃條件下以1.0 mmol/L IPTG終濃度誘導(dǎo)2、3、4、5、6、7、8 h的pAPN重組表達(dá)載體

1.Induced vector pET-32a; 2.Proteins moleculer weight Marker; 3-9.Protein inducted by different time(2，3，4，5，6，7，8 h)

圖4不同誘導(dǎo)時間pAPN重組蛋白的SDS-PAGE分析

Fig.4 SDS-PAGE analysis of expression products of recombinant pAPN vectors induced in different time

1.誘導(dǎo)的pET-32a載體；2.蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；3～9.分別為 37 ℃條件下以終濃度0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mmol/L 的IPTG誘導(dǎo)6 h的pET-32a-pAPN

1.Induced pET-32a vector; 2.Protein moleculer weight Marker; 3-9.Recombinant pAPN expression vector induced for 4 h with 0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2 mmol/L IPTG at 37 ℃

圖5不同濃度IPTG誘導(dǎo)的pAPN重組蛋白SDS-PAGE分析

Fig.5 SDS-PAGE analysis of expression products of recombinant pAPN vectors induced in different IPTG concentrations

3 討論

豬流行性腹瀉病毒能引起豬腹瀉等腸道疾病，對7日齡仔豬致死率接毒與特異性受體相互作用是病毒感染并增殖的前提，有報道[13-16]表明PEDV的培養(yǎng)體系中添加pAPN會明顯提高病毒滴度，但pAPN在細(xì)胞中的含量和密度會影響病毒的增殖[16]。為進(jìn)一步研究近100%。自1971年在英國發(fā)現(xiàn)PEDV，其體外培養(yǎng)就一直是病毒學(xué)上的難題，直到1988年Hoffman通過在培養(yǎng)液中添加胰酶的方法才首次成功獲得病毒的體外培養(yǎng)。然而近幾年新流行的PEDV再次遇到體外分離困難的問題。已經(jīng)有證據(jù)表明[12]，氨基肽酶是冠狀病毒大多數(shù)成員的細(xì)胞感染受體，病這一影響機(jī)制，離不開pAPN的特異性抗體。本研究旨在利用原核表達(dá)系統(tǒng)大量表達(dá)pAPN蛋白，為進(jìn)一步制備多克隆抗體，建立pAPN表達(dá)量的快速血清學(xué)檢測方法，為構(gòu)建和篩選pAPN高表達(dá)的細(xì)胞系提供前期基礎(chǔ)。

M.預(yù)染蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.重組蛋白pET-32a-pAPN；2.pET-32a空載體

M.Prestained protein Marker; 1.Recombinant protein pET-32a-pAPN;2.pET-32a vector

圖6重組蛋白Western blot鑒定

Fig.6 Western blot analysis of recombinant pAPN

本試驗對pAPN全基因進(jìn)行了分析，選擇了抗原表位集中的區(qū)域設(shè)計了1對擴(kuò)增pAPN截短基因的特異性引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得pAPN截短基因，利用原核表達(dá)系統(tǒng)對pAPN進(jìn)行表達(dá)，本試驗選取原核表達(dá)載體pET-32a，是因為其具有T7強(qiáng)啟動子和組氨酸標(biāo)簽，便于目的蛋白的純化。通過改變誘導(dǎo)條件等影響因素，確定了獲得最為理想的蛋白表達(dá)量的表達(dá)條件，為將來大量獲取pAPN提供了參考數(shù)據(jù)。為鑒定重組融合蛋白，應(yīng)用抗組氨酸標(biāo)簽的單克隆抗體檢測到重組蛋白在大腸埃希菌中的表達(dá)，為pAPN抗體的制備和pAPN蛋白表達(dá)檢測奠定了基礎(chǔ)。

[1] Van D N,Norimine J,Sueyoshi M,et al.US-like isolates of porcine epidemic diarrhea virus from Japanese outbreaks between 2013 and 2014[J].Springer Plus,2015,4:756.

[2] Cheun-Arom T,Temeeyasen G,Srijangward A,et al.Complete genome sequences of two genetically distinct variants of porcine epidemic diarrhea virus in the Eastern region of Thailand[J].

Genome Announc,2015,3(3):e00634-00615.

[3] Bowman A S,Krogwold R A,Price T,et al.Investigating the introduction of porcine epidemic diarrhea virus into an Ohio swine operation[J].BMC Vet Res,2015,1:38.doi:10.1186/s12917-015-0348-2.

[4] Pasick J,Berhane Y,Ojkic D,et al.Investigation into the role of potentially contaminated feed as a source of the first-detected outbreaks of porcine epidemic diarrhea in Canada [J].Transb Emerg Dis,2014,61(5):397-410.

[5] Anbalagan S,Peterson J,Wassman B,et al.Genome sequence of torovirus identified from a pig with porcine epidemic diarrhea virus from the United States[J].Genome Announc,2014,2(6):pii:e01291-14.doi:10.1128/genome A.01291-14.

[6] Hofmann H,Pyrc K,van der Hoek L,et al.Human coronavirus NL63 employs the severe acute respiratory syndrome coronavirus receptor for cellular entry[J].Proc Natl Acad Sci USA,2005,102(22):7988-7993.

[7] Lu G,Hu Y,Wang Q,et al.Molecular basis of binding between novel human coronavirus MERS-CoV and its receptor CD26[J].Nature, 2013,500(7461):227-231.

[8] Delmas B,Gelfi J,Kut E,et al.Determinants essential for the transmissible gastroenteritis virus-receptor interaction reside within a domain of aminopeptidase-N that is distinct from the enzymatic site[J].J Virol,1994,68(8):5216-5224.

[9] Tusell S M,Schittone S A,Holmes K V.Mutational analysis of aminopeptidase N,a receptor for several group Ⅰcoronaviruses,identifies key determinants of viral host range [J].J Virol,2007,81(3):1261-1273.

[10] Reguera J,Mudgal G,Santiago C,et al.A structural view of coronavirus-receptor interactions[J].Virus Res,2014,194:3-15.

[11] Bonavia A,Zelus B D,Wentworth D E,et al.Identification of a receptor-binding domain of the spike glycoprotein of human coronavirus HCoV-229E [J].J Virol,2003,77(4):2530-2538.

[12] Li B X,Ge J W,Li Y J.Porcine aminopeptidase N is a functional receptor for the PEDV coronavirus[J].Virology,2007,365(1):166-172.

[13] Carvajal A,Lanza I,Diego R,et al.Differentiation between porcine epidemic diarrhea virus and transmissible gastroenteritis virus[J].J Vet Diagon Invest,1995,108(1):41-47.

[14] Nam E,Lee C.Contribution of the porcine aminopeptidase N(CD13) receptor density to porcine epidemic diarrhea virus infection[J].Vet Microbiol,2010,144(1/2):41-50.

[15] Cong Y,Li X,Bai Y,et al.Porcine aminopeptidase N mediated polarized infection by porcine epidemic diarrhea virus in target cells [J].Virology,2015,478:1-8.

[16] 李寶賢,馬廣鵬,葛俊偉,等.豬流行性腹瀉病毒功能受體的鑒定[J].病毒學(xué)報,2009,25(3):220-225.

Abstract:To obtained the expression products of porcine aminopeptidase N (pAPN), which is reported as receptor gene of porcine epidemic diarrhea virus, the total RNA was extracted from mucous membrane of small intestine in Bama miniature pig, and cDNA was synthesized and the truncated pAPN genes were amplified by PCR using it as a template,. Then the truncated pAPN gene was cloned into a prokaryotic expression vector pET-32a (+), and then transformed intoE.coliBL21 (DE3). After induction by different concentrations of IPTG and different time to determine the optimal conditions to express the target protein.The expression products were analyzed by SDS-PAGE using anti-histidine-tagged monoclonal antibody.The optimal conditions of the prokaryotic expression of pAPN were determined as 0.8 mmol / L IPTG treated 4 h at 37 ℃. The molecular weight of the expressing productes was 45 ku. The protein size is consistent with the expected size.

Keywords:Bama miniature pig; porcine aminopeptidase N; clone; prokaryotic expression

CloningandProkaryoticExpressionofAminopeptidaseNTruncationGeneinBamaMiniaturePig

WANG Wen-xiu1,ZHANG Yan2,WANG Bao-qin3,XIE Jin-wen1,LIU Bo1,SHEN Zhi-qiang1

(1.ShandongBinzhouAnimalScience&VeterinaryMedicineAcademy,Binzhou,Shangdong，256600,China; 2.InstituteofAnimalHusbandryandVeterinaryMedicine,HainanAcademyofAgriculturalSciences,Haikou,Hainan,571100China; 3.SchoolofBioengineering,BinzhouUniversity,Binzhou,Shandong,256600,China)

S858.28:Q786

A

1007-5038(2017)08-0029-05

2016-12-19

國家自然科學(xué)基金地區(qū)科學(xué)基金項目(31560696)；海南省熱帶動物繁育與疫病研究重點(diǎn)實驗室開放課題(HKL201601)；濱州學(xué)院實驗技術(shù)研究項目(BZXYSYXM201408)

王文秀(1978-)，女，新疆伊寧人，副研究員，主要從事分子病原學(xué)與免疫學(xué)研究。*