雞白痢沙門(mén)菌套式PCR檢測(cè)方法的建立及初步應(yīng)用

劉志科，李村院，張秋雨，劉 洋，馬亞茹，王月麗，陳創(chuàng)夫*

(1.石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，新疆石河子 832003；2.石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆石河子 832003；3.河南科技學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院，河南新鄉(xiāng) 453003)

雞白痢沙門(mén)菌套式PCR檢測(cè)方法的建立及初步應(yīng)用

劉志科1△，李村院2△，張秋雨3，劉 洋1，馬亞茹1，王月麗1，陳創(chuàng)夫1*

(1.石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，新疆石河子 832003；2.石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆石河子 832003；3.河南科技學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院，河南新鄉(xiāng) 453003)

為了建立一種快速、高效和簡(jiǎn)便的雞白痢沙門(mén)菌套式PCR檢測(cè)方法，根據(jù)沙門(mén)菌侵襲蛋白基因invA的高度保守區(qū)域，利用Primmer 5.0軟件設(shè)計(jì)2對(duì)特異性的套式引物，以提取的沙門(mén)菌DNA為模板克隆invA基因，將其連入T載體并計(jì)算拷貝數(shù)作為套式PCR的模板，在對(duì)反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化的基礎(chǔ)上，建立最佳的套式PCR反應(yīng)條件，確定其上、下游引物用量分別為0.3 μL，套式PCR的第1次退火溫度為57.4℃，第2次為53.5℃。應(yīng)用該方法對(duì)已構(gòu)建好的不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性質(zhì)粒作為模板進(jìn)行檢測(cè)，其靈敏度為102拷貝數(shù)/20 μL，遠(yuǎn)高于常規(guī)PCR的106拷貝數(shù)/20 μL。用建立的套式PCR方法對(duì)從新疆石河子某雞場(chǎng)采集的25樣品進(jìn)行檢測(cè)，與傳統(tǒng)的診斷方法比較符合率達(dá)95.00%。建立的雞白痢沙門(mén)菌套式PCR檢測(cè)方法具有快速、可行、特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確率高等特點(diǎn)，為雞沙門(mén)菌病的早期診斷和研究提供了技術(shù)支撐。

雞白痢沙門(mén)菌；套式PCR；常規(guī)PCR；invA基因；靈敏性

沙門(mén)菌是一種寄生在人和多種動(dòng)物腸道內(nèi)的革蘭陰性菌，是一種重要的人畜共患病病原。雞白痢沙門(mén)菌病是一種急性敗血性疾病，多危害20日齡以內(nèi)的雛雞，患病雞表現(xiàn)為白痢、高病死率；成年雞主要是生殖器官感染，多數(shù)呈隱性局部炎癥，并通過(guò)卵黃內(nèi)帶菌傳播給雛雞[1]。沙門(mén)菌不但能引起多種畜禽疾病，還會(huì)污染食物及引起人食物中毒，嚴(yán)重危害人類健康，世界衛(wèi)生組織(WHO)將沙門(mén)菌列入了具有嚴(yán)重危害和中等危害的食物傳播性病原。

當(dāng)前雞白痢沙門(mén)菌病的診斷主要根據(jù)沙門(mén)菌屬的培養(yǎng)特性、生化試驗(yàn)和血清學(xué)試驗(yàn)，這些傳統(tǒng)方法步驟比較繁瑣、費(fèi)時(shí)費(fèi)力，已不能滿足當(dāng)前快速診斷的需求。由于沙門(mén)菌屬的血清型比較多，有2 500種以上，所以建立一種快速、高效、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法，對(duì)于沙門(mén)菌病的診斷具有重要意義。國(guó)內(nèi)外已經(jīng)建立了斑點(diǎn)免疫金滲濾法、免疫熒光標(biāo)記法、恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)及熒光定量PCR方法，但由于試驗(yàn)所需條件比較高，儀器昂貴，并不適合在基層推廣和應(yīng)用[2]。根據(jù)雞白痢沙門(mén)菌的傳播特點(diǎn)，利用已經(jīng)建立的PCR技術(shù)可以檢測(cè)出極微量的病原菌，這種方法在雛雞沙門(mén)菌病檢疫方面的應(yīng)用越來(lái)越廣泛，但其敏感性和特異性沒(méi)有一個(gè)通用和嚴(yán)謹(jǐn)?shù)呐卸?biāo)準(zhǔn)，存在一些不足之處。而套式PCR是在原有的PCR技術(shù)上又增加了一條引物，其靈敏性比常規(guī)PCR要高很多[3]。但目前這個(gè)技術(shù)在檢測(cè)沙門(mén)菌方面并不是太完善，報(bào)道也比較少。本研究對(duì)雞白痢沙門(mén)菌套式PCR檢測(cè)方法的體系和條件進(jìn)行優(yōu)化和改善，進(jìn)一步驗(yàn)證其敏感性、特異性和重復(fù)性，并初步應(yīng)用建立的檢測(cè)方法對(duì)臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)，為沙門(mén)菌快速檢測(cè)提供技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑及儀器 快速瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒，康為世紀(jì)生物公司產(chǎn)品；DH5α感受態(tài)細(xì)胞、2×ESTaqMasterMix、T-vector PMD19、細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、高純度質(zhì)粒小提試劑盒、IGTP/X-gal，Tiangen公司產(chǎn)品；LTD、沙門(mén)菌成套生化鑒定管，青島博海生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；PCR儀，Eppendorf公司產(chǎn)品；紫外凝膠成像分析系統(tǒng)，Molecular Imager公司產(chǎn)品；高速離心機(jī)，德國(guó)Sigma公司產(chǎn)品；核酸蛋白檢測(cè)儀，美國(guó)Thermo Scientific公司產(chǎn)品。

1.1.2 菌株及臨床病料 雞白痢沙門(mén)菌(CVCC530)購(gòu)于中國(guó)獸醫(yī)藥品檢查所；其他對(duì)照菌(多殺性巴氏桿菌、大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽胞桿菌、李斯特菌和放線桿菌)均由石河子大學(xué)微生物教研室保存。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成 invA基因編碼沙門(mén)菌的一種侵襲蛋白，決定細(xì)菌進(jìn)入動(dòng)物上皮細(xì)胞的能力，與致病性密切相關(guān)。根據(jù)GenBank公布的雞白痢沙門(mén)菌invA基因(登錄號(hào)：NC003197.1)保守區(qū)核苷酸序列，利用Preimer5.0，設(shè)計(jì)3對(duì)引物，并用DNA Man進(jìn)行基因同源性分析?？寺∫飅nvAK，套式PCR內(nèi)外引物分別為invAW和invAN，具體引物序列見(jiàn)表1。引物由上海Sangon Biotech公司合成。

表1 引物信息

1.2.2 重組質(zhì)粒制備

1.2.2.1 目的基因擴(kuò)增與重組質(zhì)粒的構(gòu)建 用DNA提取試劑盒提取雞白痢沙門(mén)菌的DNA作為模板，用克隆引物 (invAK) 進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增invAK基因的片段。反應(yīng)結(jié)束后，PCR產(chǎn)物以170 V、120 mA在10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳來(lái)驗(yàn)證分析。用快速瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收目的條帶。與pMD19-T載體過(guò)夜連接，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸埃希菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，通過(guò)IPTG/X-gal篩選陽(yáng)性克隆菌，PCR驗(yàn)證正確后，送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.2.2 質(zhì)粒的提取、鑒定及定量 按照高純度質(zhì)粒小提試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行質(zhì)粒的提取，用核酸蛋白檢測(cè)儀測(cè)定其質(zhì)粒濃度，提取質(zhì)粒OD 260/OD 280的比值在1.8～2.0范圍時(shí)，說(shuō)明提取質(zhì)粒純度高、雜質(zhì)較少[4]，根據(jù)公式計(jì)算出重組質(zhì)粒的拷貝數(shù)。

拷貝數(shù)﹦質(zhì)粒濃度(ng/μL)×10-9/重組質(zhì)粒分子質(zhì)量×6.022×1023

1.2.3 最佳引物用量的確立 分別將invAW和invAN的上、下游引物稀釋至20 μmol/L,分別取 0.2、0.1、0.3、0.4、0.5、0.6 μL，以106拷貝/μL的重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板，采用常規(guī)PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增，篩選出引物的最優(yōu)反應(yīng)濃度。

1.2.4 PCR反應(yīng)體系 以106拷貝/μL雞白痢沙門(mén)菌標(biāo)準(zhǔn)株重組質(zhì)粒的為模板，第1輪PCR反應(yīng)體系20 μL，包括ddH2O 8.2 μL，上、下游引物 invAWF、invAWR 0.3 μL，模板1.5 μL，2×ESTaqMasterMix 10 μL；第2輪PCR反應(yīng)體系20 μL：ddH2O 8.7 μL，上、下游引物 invANF、invANR 0.3 μL，模板1 μL，2×ESTaqMasterMix 10 μL ,第2輪PCR反應(yīng)模板為第1輪PCR反應(yīng)的膠回收產(chǎn)物。

1.2.4.1 退火溫度的優(yōu)化 第1輪PCR反應(yīng)條件：95℃ 5 min；95℃ 40 s，57.4℃～59℃ 30 s，30個(gè)循環(huán)；72℃ 50 s。第2輪PCR反應(yīng)條件：95℃ 5 min；95℃ 40 s，53.5℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)；72℃ 30 s。經(jīng)30 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。將長(zhǎng)度為278 bp的目的DNA片段切下后，用快速瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒進(jìn)行純化回收。最后，取8 μL的PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳和測(cè)序驗(yàn)證。

1.2.4.2 靈敏性和特異性分析 將質(zhì)粒按10倍梯度稀釋成不同的拷貝數(shù)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別以1010、109、108、107、106、105、104、103、102、10拷貝/μL為模板，進(jìn)行套式PCR擴(kuò)增，確定方法的靈敏度。利用本試驗(yàn)優(yōu)化的套式PCR反應(yīng)程序，對(duì)已知陽(yáng)性菌和5株非目標(biāo)菌進(jìn)行檢測(cè)，驗(yàn)證所建立的套式PCR方法檢測(cè)雞白痢沙門(mén)菌的特異性。

1.2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 選擇濃度為10、105、107拷貝/μL的invA基因陽(yáng)性質(zhì)粒進(jìn)行套式PCR擴(kuò)增，分別進(jìn)行批內(nèi)和批間重復(fù)性試驗(yàn)，對(duì)每個(gè)拷貝數(shù)模板進(jìn)行3個(gè)平行重復(fù)；同時(shí)，對(duì)批間中的105的稀釋拷貝數(shù)的陽(yáng)性質(zhì)粒作為批內(nèi)檢測(cè)，共復(fù)檢3次，根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果確定方法的重復(fù)性。

1.2.4.4 臨床樣品檢測(cè) 在新疆石河子某雞場(chǎng)采樣，利用沙門(mén)菌成套生化鑒定管對(duì)采集的25份樣品進(jìn)行鑒定，共檢出20份陽(yáng)性樣品和5陰性樣品，用DNA提取試劑盒提取樣本的DNA。以陽(yáng)性質(zhì)粒為對(duì)照組，用本研究建立的雞沙門(mén)菌套式PCR方法進(jìn)行檢測(cè)，來(lái)比較常規(guī)PCR擴(kuò)增方法與套式PCR方法準(zhǔn)確性。

2 結(jié)果

2.1 目的基因PCR擴(kuò)增及測(cè)序結(jié)果

以雞白痢沙門(mén)菌的DNA為模板，利用克隆引物invAK進(jìn)行PCR擴(kuò)增目的條帶，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳顯示條帶大小為1 143 bp(圖1)。送到公司測(cè)序并對(duì)結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，擴(kuò)增的目的片段序列與原始序列的同源性一致。

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn) DL 5 000；1.PCR產(chǎn)物

M.DNA Marker DL 5 000；1.PCR product

圖1 invA基因PCR結(jié)果電泳圖

Fig.1 Electrophoresis of invA gene PCR result

2.2 重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的鑒定

對(duì)獲得的陽(yáng)性質(zhì)粒進(jìn)行PCR驗(yàn)證，擴(kuò)增出625 bp條帶，與雞白痢沙門(mén)菌為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)所得到的片段大小相同。測(cè)序結(jié)果顯示,連接片段的序列和目的基因序列同源性為100%，表明成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒。提取重組質(zhì)粒，并將質(zhì)粒濃度稀釋至1010拷貝/μL,再依次進(jìn)行10倍梯度稀釋為1010、109、108、107、106、105、104、103、102、10拷貝/μL，作為套式PCR的標(biāo)準(zhǔn)品，置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 套式PCR檢測(cè)方法的建立

2.3.1 最佳引物用量的確立 分別取不同體積濃度20 μmol/L的引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)上下游引物的體積各為0.3 μL時(shí)，對(duì)重組質(zhì)粒的檢測(cè)可以獲得最優(yōu)的條帶(圖2)。

2.3.2 退火溫度的優(yōu)化 對(duì)套式PCR的第1輪退火溫度設(shè)計(jì)梯度，結(jié)果表明最適退火溫度為57.4℃(圖3)。

2.3.3 靈敏性和重復(fù)性試驗(yàn) 分別以100～1010拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)品為模板，用設(shè)計(jì)的外引物(invAWF和invAWR)進(jìn)行套式PCR的第1次擴(kuò)增，在106拷貝/μL時(shí)能檢測(cè)出條帶，常規(guī)PCR方法在20 μL體系中最低檢出的下限為106拷貝/μL(圖4)。用上述的PCR反應(yīng)產(chǎn)物作為第2輪PCR擴(kuò)增的模板，用設(shè)計(jì)的內(nèi)引物(invANF和invANR)進(jìn)行第2輪擴(kuò)增，結(jié)果顯示，套式PCR在模板濃度為102拷貝/μL就可用擴(kuò)增到目的條帶，比常規(guī)PCR靈敏性提高10 000倍(圖5)。106拷貝/μL質(zhì)粒為模板進(jìn)行3次重復(fù)性試驗(yàn)(圖6)。結(jié)果顯示，雞白痢沙門(mén)菌invA基因建立的套式PCR的靈敏度較高、重復(fù)性好。

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn) DL 2 000；1～6.引物體積用量為0.2 μL、0.1 μL、0.3 μL、0.4 μL、0.5 μL、0.6 μL

M.DNA Marker DL 2 000；1-6.primer volumes as 0.2 μL,0.1 μL,0.3 μL,0.4 μL,0.5 μL and 0.6 μL

圖2常規(guī)PCR最佳引物體積分析

Fig.2 Optimal primer volume analysis of conventional PCR

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn) DL 2 000 ;1～7.退火溫度分別是57.4℃、57.7℃、58℃、58.3℃、58.6℃、58.9℃、59.2℃

M.DNA Marker DL 2 000;1-7. The annealing temperatures as 57.4℃，57.7℃，58℃，58.3℃，58.6℃，58.9℃ and 59.2℃,respectively

圖3套式PCR第1輪最佳退火溫度確定

Fig.3 Determination of optimal annealing temperature for first round nested PCR

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn) DL 2 000；.1.陰性對(duì)照;2～11.分別為模板量為10、102、103、104、105、 106、107、108、109、 1010拷貝/μL的PCR產(chǎn)物

M.DNA Marker DL 2 000；1.Negative control；2-11.PCR products of template amounts as10,102,103,104,105,106,107,108,109,1010copies/μL, respectively

圖4第1輪套式PCR擴(kuò)增靈敏性分析

Fig.4 Sensitivity analysis of first round nested PCR amplification

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn) DL 500；1、2.原質(zhì)粒濃度；3～12.1010、109、108、107、106、 105、104、103、102、10拷貝/μL

M.DNA Marker DL 500；1，2.The original plasmid concentration；3-12.PCR products of template amounts respectively 1010,109,108,107,106,105,104,103,102,10 copies/μL

圖5第2輪套式PCR擴(kuò)增靈敏性分析

Fig.5 Sensitivity analysis of second round nested PCR amplification

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn) DL 2 000；1.陰性對(duì)照 ；2～4.模板濃度為106拷貝/μL的質(zhì)粒

M.DNA Marker DL 2 000；1.Negative control;2-4.Template concentration 106copies / μL

圖6雞白痢沙門(mén)菌PCR產(chǎn)物重復(fù)性分析

Fig.6 Repeatability analysis of PCR products ofSalmonellapullorum

2.3.4 套式PCR方法的特異性分析 以雞白痢沙門(mén)菌為對(duì)照，用建立的套式PCR方法對(duì)6個(gè)非沙門(mén)菌病原進(jìn)行擴(kuò)增，以雞白痢沙門(mén)菌為模板分別擴(kuò)增出625 bp(圖7A)和278 bp(圖7B)的特異性條帶，而其他樣品均無(wú)條帶，表明建立的套式PCR方法特異性好。

2.3.5 臨床樣品的檢測(cè)結(jié)果 對(duì)采集已經(jīng)確認(rèn)的雞白痢沙門(mén)菌的陽(yáng)性樣品和陰性樣品,分別按細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明提取DNA為模板，用常規(guī)的PCR方法檢測(cè)到陽(yáng)性樣品10份，陰性樣品3份，檢出率50.00%；用建立的套式PCR方法檢測(cè)到陽(yáng)性樣品19份，陰性樣品5份，檢出率95.00%(圖8)，這可能是樣品中沙門(mén)菌含量比較低的原因所造成的?？傊?，套式PCR的檢測(cè)率比常規(guī)PCR要高很多。

3 討論

沙門(mén)菌是全世界危害最嚴(yán)重的食源性病原菌之一，雞感染后病死率達(dá)83%以上[5]，給畜牧業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。國(guó)內(nèi)外學(xué)者一直致力于沙門(mén)菌快速檢測(cè)方法的研究，主要在PCR技術(shù)、基因芯片技術(shù)、免疫學(xué)檢測(cè)及斑點(diǎn)免疫金滲濾法等方面[6]。沙門(mén)菌的血清學(xué)種類比較復(fù)雜，疫苗種類比較多，養(yǎng)殖戶常常是防了又防，但效果甚微，即使發(fā)現(xiàn)了該病，也沒(méi)有一個(gè)好的預(yù)防藥物和方法。沙門(mén)菌感染人后可以黏附到小腸黏膜的M細(xì)胞，通過(guò)M細(xì)胞侵入到表皮下層組織，而濾泡上皮細(xì)胞中有分布著捕捉抗原的M細(xì)胞，具有吞噬功能；而沙門(mén)菌含有O、Vi和H等抗原，具有血清抗性，可導(dǎo)致沙門(mén)菌釋放較強(qiáng)的內(nèi)毒素，從而使機(jī)體產(chǎn)生一些嚴(yán)重不適反應(yīng)[7-8]。

邵景東等[9]利用免疫膠體金層析法研發(fā)出O9群沙門(mén)菌膠體金快速檢測(cè)試劑盒，該方法具有色譜層析法和免疫反應(yīng)法的共同優(yōu)勢(shì)。由于腸炎沙門(mén)菌含有一種SEF菌毛，在侵襲過(guò)程中具有毒力因子的作用，可以誘導(dǎo)細(xì)菌黏附在動(dòng)物的生殖道和腸道的黏膜細(xì)胞上，造成不同的病理反應(yīng)。蔣穎等[10]利用SEF菌毛建立了腸炎沙門(mén)菌特異性的診斷方法，但由于該方法對(duì)抗原和試驗(yàn)條件要求比較高，并沒(méi)有廣泛應(yīng)用到臨床檢測(cè)當(dāng)中。劉景武等[11]建立的免疫膠體金法檢測(cè)沙門(mén)菌的靈敏度為81.8%，但由于其敏感度問(wèn)題極容易造成假陰性結(jié)果，在實(shí)際臨床中只能作為一種輔助手段。劉斌等[12]在原有PCR方法的基礎(chǔ)上，為了降低檢測(cè)時(shí)出現(xiàn)的假陰性概率，在PCR反應(yīng)體系中人工加入了1條擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)片段，該檢測(cè)方法的靈敏度可到8 CFU/25 mL,增加了診斷的準(zhǔn)確性。Amaro M等[13]基于納米金材料設(shè)計(jì)了一種鼠傷寒沙門(mén)菌免疫分析法，其檢測(cè)的下限為42 CFU/mL。李佳桐等[14]根據(jù)沙門(mén)菌的STN基因的保守序列設(shè)計(jì)了1套LAMP引物，建立了一種環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增鑒定方法，克服了傳統(tǒng)方法的局限性，其最低檢出細(xì)菌濃度為10 CFU/mL,50 min就可以完成檢測(cè)，但該方法對(duì)引物的要求比較高。而本研究根據(jù)沙門(mén)菌的特異性invA基因，用BLAST檢索進(jìn)行核苷酸序列分析表明，在沙門(mén)菌的兩個(gè)種屬中存在較高的同源性，而與其他生物無(wú)同源關(guān)系；并利用Preimer5.0軟件設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，而內(nèi)引物位于第1輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的內(nèi)部。

A.第1輪套式PCR特異性分析；M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;B.第2輪套式PCR特異性分析;M.DNA 標(biāo)準(zhǔn) DL 1 000；1.雞白痢沙門(mén)菌;2～7.多殺性巴氏桿菌、大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽胞桿菌、李斯特菌、放線桿菌

A.First-round nested PCR specificity analysis；M.DNA Marker DL 2 000；B.Second round nested PCR specificity analysis；M.DNA Marker DL 1 000； 1.Salmonellapullorum；2-7.Pasteurellamultocida,Escherichiacoli,Staphylococcusaureus,Bacillussubtilis,ListeriaandActinobacillus

圖7套式PCR特異性分析

Fig.7 Nested PCR specificity analysis

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn) DL 1 000；1～5.陰性樣品；6～24.陽(yáng)性樣品 M.DNA Marker DL 1 000；1-5.Negative samples；6-24.Positive samples

綜上所述，本研究建立了一種沙門(mén)菌的套式PCR檢測(cè)方法，不需要特殊的儀器和設(shè)備，并對(duì)反應(yīng)的引物用量和退火溫度進(jìn)行了優(yōu)化，試驗(yàn)要求和技術(shù)條件一般實(shí)驗(yàn)室都能滿足，其優(yōu)勢(shì)是常規(guī)檢測(cè)方法不能比擬的。但套式PCR也有其不足之處，就是容易造成模板污染和假陽(yáng)性結(jié)果，有待對(duì)其進(jìn)行更深入的研究。對(duì)收集的25份臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)并與常規(guī)PCR方法檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較，其靈敏性較高(95.00%)，尤其是對(duì)于沙門(mén)菌含量極低的樣品的檢測(cè)。同時(shí)，對(duì)于沙門(mén)菌的臨床商品化快速檢測(cè)試劑盒的研究與開(kāi)發(fā)提供了技術(shù)參考。

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Abstract:In order to establish a rapid,efficient and simple nested PCR method for detectingSalmonellapullorum,two pairs of specific nested primers were designed according to the highly conserved region of the invA gene ofSalmonellainvasion protein by Primers 5.0 software.The invA gene was cloned from the extractedSalmonellaDNA,and the copy number was calculated as a nested template by ligating the invA gene into the T vector.The optimum nested PCR conditions were determined.The amount of primer used was 0.3 μL respectively,the first annealing of nested PCR was 57.4 ℃ and the second was 53.5 ℃.The method was used to detect the standard plasmids of different concentrations as templates，the sensitivity was 102copies / 20 μL,it was much higher than that of the conventional PCR which was about 106copies / 20 μL.The nested PCR method was used to detect 25 samples collected from a farm in Shihezi,Xinjiang,and the coincidence rate was 95.00% compared with the traditional diagnostic method.The results of the present study showed that the nested PCR method was successful,rapid,feasible,specific and accurate,and it provided a new method for the early diagnosis and study ofSalmonellaspp.

Keywords:Salmonellapullorum; nested PCR; conventional PCR; invA gene; sensitivity

EstablishmentandPreliminaryApplicationofNestedPCRforDetectingSalmonellapullorum

LIU Zhi-ke1,LI Cun-yuan2,ZHANG Qiu-yu3,LIU Yang1,MA Ya-ru1, WANG Yue-li1,CHEN Chuang-fu1

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology，ShiheziUniversity,Shihezi,Xinjiang,832003,China; 2.CollegeofLifeSciences,ShiheziUniversity,Shihezi，Xinjiang，832003,China; 3.CollegeofAnimalScienceandTechnology,HenanInstituteofScienceandTechnology，Xinxiang,Henan,453003,China)

S852.612

A

1007-5038(2017)08-0023-06

2016-11-23

省級(jí)協(xié)同創(chuàng)新中心項(xiàng)目(2013-179)

劉志科(1989-)，男，河南新鄉(xiāng)人，碩士研究生，主要從事人畜共患病研究?！魍蓉暙I(xiàn)作者*