牛乳中乳房鏈球菌PCR檢測(cè)方法的建立

刁巧虹，卞國(guó)志，王 娟，羅藹劍，張 瑩，高瀟祎，賈 坤，孫凌霜*，袁建豐*

(1.廣東海大畜牧獸醫(yī)研究院有限公司，廣東廣州 511400；2.廣東海大集團(tuán)股份有限公司，廣東廣州 511400；3.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣東廣州 510642；4.廣東省獸醫(yī)臨床重大疾病綜合防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州廣東 510642)

牛乳中乳房鏈球菌PCR檢測(cè)方法的建立

刁巧虹1,3,4，卞國(guó)志2,3，王 娟1,2，羅藹劍3,4，張 瑩3,4，高瀟祎3，賈 坤3,4，孫凌霜3,4*，袁建豐1,2*

(1.廣東海大畜牧獸醫(yī)研究院有限公司，廣東廣州 511400；2.廣東海大集團(tuán)股份有限公司，廣東廣州 511400；3.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣東廣州 510642；4.廣東省獸醫(yī)臨床重大疾病綜合防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州廣東 510642)

奶牛乳房炎是危害奶牛業(yè)最常見(jiàn)的疾病之一，對(duì)奶牛業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。引起奶牛乳房炎的病原菌較多，其中乳房鏈球菌是常見(jiàn)的致病菌之一。為快速準(zhǔn)確地檢測(cè)樣品中的該菌，參照GenBank公布的乳房鏈球菌pauA基因序列設(shè)計(jì)引物，建立了乳房鏈球菌的PCR檢測(cè)方法。對(duì)460份臨床奶樣進(jìn)行檢測(cè)，傳統(tǒng)細(xì)菌分離方法共檢出11份(2.39%)陽(yáng)性奶樣；PCR方法共檢出40份(8.70%)陽(yáng)性奶樣，2種方法的吻合率為93.7%。結(jié)果顯示,建立的乳房鏈球菌PCR檢測(cè)法敏感性高，特異性強(qiáng)，適用于臨床檢測(cè)。

奶牛乳房炎；乳房鏈球菌；聚合酶鏈反應(yīng)

奶牛乳房炎是危害奶牛業(yè)最重要的疾病之一，不僅能引起牛產(chǎn)奶量減少，導(dǎo)致奶品質(zhì)下降，造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失，而且患病奶牛所產(chǎn)牛奶中的某些病原體亦可引起人類(lèi)感染[1]。我國(guó)大部分地區(qū)奶牛乳房炎的檢出率在40%～65%之間，乳房鏈球菌(Streptococcusuberis)是引起奶牛乳房炎最常見(jiàn)的致病菌之一[2-4]，能夠引起牛、山羊和綿羊的急性及慢性乳房炎。但病畜感染該菌后無(wú)明顯的免疫反應(yīng)，給該病的診療帶來(lái)困難[5]。因此，建立快速檢測(cè)乳房鏈球菌的方法對(duì)奶牛乳房炎的防控非常重要。

通常，臨床樣本中乳房鏈球菌的檢測(cè)仍是通過(guò)細(xì)菌分離、生化試驗(yàn)和CAMP試驗(yàn)(Christie、Atkins、Munch-Peterson等人名的縮寫(xiě))等經(jīng)典方法。但是，由于經(jīng)典方法有操作繁瑣、耗時(shí)長(zhǎng)、檢出率低等缺點(diǎn)，影響對(duì)該菌快速準(zhǔn)確檢測(cè)及所致乳房炎的治療；現(xiàn)有檢測(cè)乳房鏈球菌的聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)技術(shù)有普通PCR、多重PCR、實(shí)時(shí)熒光定量PCR，以及環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)等，其中普通PCR方法具有操作簡(jiǎn)單、成本低的特點(diǎn)，應(yīng)用廣泛。目前檢測(cè)乳房鏈球菌的普通PCR主要是基于16 S rRNA基因。在細(xì)菌基因組中，rRNA的操縱子通常是多基因的，對(duì)于16 S rDNA，從GenBank 檢索的序列可以代表其中的一個(gè)操縱子，但基于這個(gè)序列設(shè)計(jì)出來(lái)的引物或探針可能不能檢出種屬里所有的菌株[6]。而纖溶酶原激酶A(plasminogen activactor A,pauA)是乳房鏈球菌重要的毒力因子，能分解血漿酶原，具有高度的保守性，廣泛存在并有很強(qiáng)的免疫原性[7]，更適于該菌的檢測(cè)。

本試驗(yàn)將普通PCR技術(shù)應(yīng)用到奶牛乳房炎病原菌的檢測(cè)，建立一種基于pauA基因檢測(cè)乳房鏈球菌的方法，為快速檢測(cè)奶牛乳房炎中乳房鏈球菌提供新的手段。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與奶樣 乳房鏈球菌、無(wú)乳鏈球菌、停乳鏈球菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌和沙門(mén)菌為廣東海大畜牧獸醫(yī)研究院實(shí)驗(yàn)室臨床分離鑒定保存。8株臨床分離鑒定的乳房鏈球菌和460份臨床奶樣由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)臨床實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 主要試劑及儀器 pMDTM18-T Vector Cloning Kit、EscherichiacoliDH5α Competent Cells、脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid，DNA )Marker、Taq聚合酶(Taqpolymerase)和PCR相關(guān)試劑,寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；膠回收試劑盒，Omega公司產(chǎn)品；快速質(zhì)粒小提試劑盒，天根生化科技(北京)有限公司產(chǎn)品；細(xì)菌基因組DNA小量試劑盒，AxyPrep公司產(chǎn)品；胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司產(chǎn)品；PCR儀，伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品(上海)有限公司產(chǎn)品；電泳儀，北京市六一儀器廠生產(chǎn)；凝膠成像系統(tǒng)，上海天能科技有限公司產(chǎn)品；臺(tái)式冷凍恒溫振蕩器，江蘇太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 引物的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank公布的乳房鏈球菌保守序列pauA基因序列(KT006567.1)，設(shè)計(jì)了1對(duì)特異性引物F1與R1和1對(duì)擴(kuò)增基因全長(zhǎng)引物F2與R2，以及16 S rRNA引物[8]，由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成，引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物名稱(chēng)及其序列

1.2.2 DNA模板制備 用AxyPrep細(xì)菌基因組DNA小量試劑盒提取DNA模板，置-20℃保存。

1.2.3 pMD-18T-pauA重組載體的構(gòu)建 以乳房鏈球菌DNA為模板，用引物F2和R2 擴(kuò)增pauA基因全長(zhǎng)序列，瓊脂糖凝膠電泳后膠回收目的片段，回收產(chǎn)物連接到pMD-18T載體，轉(zhuǎn)化至大腸埃希菌DH5α，挑取單克隆經(jīng)PCR鑒定，陽(yáng)性克隆送至英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司測(cè)序。成功構(gòu)建重組載體后，快速質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒DNA，置-20℃保存。

1.2.4 PCR的建立及條件優(yōu)化 以提取的乳房鏈球菌DNA為模板，對(duì)PCR各反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化。反應(yīng)體系25 μL包括Taq酶1 U，10×PCR緩沖液2.5 μL，MgCl2濃度為2.0 mmol/L，dNTP 濃度為0.2 mmol/L，pauA上、下游引物濃度0.8 μmol/L，模板量25 ng，雙蒸水補(bǔ)足到25 μL。依次對(duì)PCR的退火溫度、Taq酶濃度和引物濃度進(jìn)行優(yōu)化。1.2.5 特異性試驗(yàn) 以乳房鏈球菌、無(wú)乳鏈球菌、停乳鏈球菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌和沙門(mén)菌的基因組DNA為模板，設(shè)置重組載體和無(wú)菌雙蒸水分別為陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照， PCR后電泳分析結(jié)果。1.2.6 敏感性試驗(yàn) 以提取的重組載體，用無(wú)菌雙蒸水做10倍梯度稀釋?zhuān)?08、107、106、105、104、103、102、101CFU/mL的8個(gè)濃度梯度分別為模板，設(shè)置無(wú)菌雙蒸水為陰性對(duì)照。PCR后電泳分析結(jié)果。

1.2.7 臨床菌株檢測(cè) 對(duì)從廣東多個(gè)規(guī)模化養(yǎng)殖場(chǎng)的牛群中分離鑒定的8株乳房鏈球菌進(jìn)行檢測(cè)，PCR后電泳分析結(jié)果。

1.2.8 臨床樣本檢測(cè) 在廣東地區(qū)奶牛場(chǎng)無(wú)菌采集臨床乳汁樣品460份，同時(shí)用傳統(tǒng)細(xì)菌分離結(jié)合16 S rRNA測(cè)序鑒定法和建立的PCR檢測(cè)方法對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)，記錄并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

傳統(tǒng)細(xì)菌分離結(jié)合16 S rRNA測(cè)序鑒定法是對(duì)從奶樣分離到的菌株進(jìn)行16 S rRNA PCR擴(kuò)增、測(cè)序及序列比對(duì)，確定菌株種系，可作為細(xì)菌分離鑒定的金標(biāo)準(zhǔn)[9]。乳房鏈球菌在TSA平板上形成灰白、光滑、圓形，突起，閃光細(xì)小菌落[5]。將奶樣細(xì)菌分離后，挑取革蘭染色陽(yáng)性球菌、觸酶陰性且在TSA平板上菌落形態(tài)與乳房鏈球菌相同的菌，進(jìn)行16 S rRNA序列PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為：94℃ 5 min；94℃ 1 min，55℃ 1 min，72℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。將PCR產(chǎn)物直接由華大基因公司測(cè)序。序列經(jīng)比對(duì)，確定該菌株種系。

2 結(jié)果

2.1 pMD-18T-pauA重組載體的構(gòu)建

構(gòu)建重組載體后，經(jīng)PCR鑒定的陽(yáng)性大腸埃希菌DH5α菌液送測(cè)序，測(cè)序結(jié)果經(jīng)BLAST比對(duì)，與pauA基因序列(KT006567.1)的同源性為100%，說(shuō)明成功獲得了pauA基因。

2.2 PCR反應(yīng)條件優(yōu)化結(jié)果

以乳房鏈球菌的DNA為模板，對(duì)乳房鏈球菌PCR的退火溫度及引物濃度進(jìn)行優(yōu)化分析。結(jié)果顯示，當(dāng)退火溫度為54.1℃時(shí)，目的條帶最為清晰，52.4℃～55℃之間時(shí)，目的條帶都比較清晰，低于52.4℃則逐漸減弱， 表明PCR最佳的退火溫度為54℃(圖1)；當(dāng)Taq酶為0.75U時(shí)，即可以擴(kuò)增出清晰穩(wěn)定的目的條帶，表明0.75 U的Taq酶即可滿(mǎn)足擴(kuò)增效率(圖2)；當(dāng)引物濃度為0.02 μmol/L 時(shí)，能擴(kuò)增出目的條帶，但條帶較弱，引物濃度為0.2 μmol/L時(shí)，就能擴(kuò)增出清晰的目的條帶，表明引物濃度為0.2 μmol/L即可滿(mǎn)足擴(kuò)增效率(圖3)。

綜上所述，PCR反應(yīng)體系25 μL為：Taq酶0.75 U，10×PCR緩沖液2.5 μL，MgCl2濃度為2.0 mmol/L，dNTP 濃度為200 μmol/L，上、下游引物濃度0.2 μmol/L，模板量25 ng，雙蒸水補(bǔ)足到25 μL；反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃ 5 min;95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000; 1. 55℃; 2. 54.1℃; 3. 52.4℃; 4. 49.5℃; 5. 45.8℃; 6. 42.9℃; 7. 40℃;8.陰性對(duì)照

M.DNA Marker DL 2 000; 1. 55℃; 2. 54.1℃; 3. 52.4℃; 4. 49.5℃; 5. 45.8℃; 6. 42.9℃; 7. 40℃;8.Negative control

圖1退火溫度梯度試驗(yàn)

Fig.1 Annealing temperature gradient test

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 1 000; 1. 0.25 U; 2. 0.5 U; 3. 0.75 U; 4. 1 U; 5. 1.25 U; 6. 1.5 U; 7.陰性對(duì)照

M.DNA Marker DL 1 000; 1. 0.25 U; 2. 0.5 U; 3. 0.75 U; 4. 1 U; 5. 1.25 U; 6. 1.5 U; 7.Negative control

圖2Taq酶濃度梯度試驗(yàn)

Fig.2Taqenzyme concentration gradient test

2.3 特異性試驗(yàn)結(jié)果

特異性試驗(yàn)除了乳房鏈球菌樣品及陽(yáng)性對(duì)照出現(xiàn)大小為273 bp的單一特異性條帶外，其余樣品的擴(kuò)增結(jié)果均未見(jiàn)任何條帶，表明該方法特異性良好(圖4)。

2.4 敏感性試驗(yàn)結(jié)果

敏感性試驗(yàn)結(jié)果，其敏感性為103CFU/mL，表明具有較好的敏感性(圖5)。

2.5 臨床菌株檢測(cè)結(jié)果

對(duì)臨床中已分離鑒定的8株乳房鏈球菌的進(jìn)行PCR檢測(cè)試驗(yàn)，結(jié)果除了陰性對(duì)照外，從臨床中分離到的乳房鏈球菌及陽(yáng)性對(duì)照均有且僅有大小為273 bp的單一特異性條帶，表明所建立的PCR檢測(cè)方法能夠準(zhǔn)確、特異的檢測(cè)出不同來(lái)源的乳房鏈球菌(圖6)。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 1 000; 1. 0.4 μmol/L; 2. 0.2 μmol/L; 3. 0.04 μmol/L; 4. 0.02 μmol/L; 5. 0.012 μmol/L; 6. 0.004 μmol/L; 7.陰性對(duì)照

M.DNA Marker DL 1 000; 1. 0.4 μmol/L; 2. 0.2 μmol/L; 3. 0.04 μmol/L; 4. 0.02 μmol/L; 5. 0.012 μmol/L; 6. 0.004 μmol/L; 7.Negative control

圖3引物濃度優(yōu)化試驗(yàn)

Fig.3 Primer concentration optimization test

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 1 000; 1.乳房鏈球菌; 2.無(wú)乳鏈球菌; 3.停乳鏈球菌; 4.金黃色葡萄球菌; 5.沙門(mén)菌; 6.大腸埃希菌; 7.陰性對(duì)照；8.陽(yáng)性對(duì)照

M.DNA Marker DL 1 000; 1.Streptococcusuberis; 2.Streptococcusagalactiae; 3.Streptococcusdysgalactiae; 4.Staphylococcusaureus; 5.Salmonella; 6.Escherichiacoli; 7.Negative control; 8.Positive control

圖4特異性試驗(yàn)

Fig.4 Specificity test

2.6 臨床樣本檢測(cè)結(jié)果

分別用傳統(tǒng)細(xì)菌分離和本PCR方法對(duì)廣東地區(qū)10個(gè)奶牛場(chǎng)臨床采集的460份臨床型和亞臨床型乳房炎奶樣進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，傳統(tǒng)細(xì)菌分離結(jié)合16 S rRNA測(cè)序鑒定法共檢測(cè)出11份奶樣含有乳房鏈球菌，檢出率為2.39%； PCR法共檢出了40份奶樣中含有乳房鏈球菌，檢出率為8.70%(表2)。本試驗(yàn)檢測(cè)方法與傳統(tǒng)鑒定法相比，特異度為93.5%，靈敏度為100%， PCR法的檢出率高于傳統(tǒng)細(xì)菌分離方法，表明建立的PCR方法在保證準(zhǔn)確性的同時(shí)，擁有更好的靈敏度，更適用于臨床樣本的檢查。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 1 000; 1～8. 108CFU/mL～101CFU/mL；9.陰性對(duì)照

M.DNA Marker DL 1 000; 1-8. 108CFU/mL-101CFU/mL；9.Negative control

圖5敏感性試驗(yàn)

Fig.5 Sensitivity test

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 1 000; 1. 211zq-11; 2. 203zh-8; 3. 203zh-1; 4. 13-4; 5. 5185-7; 6. 110086-7; 7. 17-1；8. 6122-7；9.陰性對(duì)照; 10.陽(yáng)性對(duì)照

M.DNA Marker DL 1 000; 1. 211zq-11; 2. 203zh-8; 3. 203zh-1; 4. 13-4; 5. 5185-7; 6. 110086-7; 7. 17-1；8.6122-7；9.Negative control; 10.Positive control

圖6 臨床菌株檢測(cè)結(jié)果

3 討論

奶牛乳房炎是危害奶牛業(yè)最常見(jiàn)的疾病之一，嚴(yán)重影響奶牛業(yè)健康穩(wěn)定發(fā)展。乳房鏈球菌是該病的常見(jiàn)致病菌之一。建立簡(jiǎn)單、快速的乳房鏈球菌檢測(cè)方法，能夠加強(qiáng)對(duì)疾病的防治和減少抗生素的使用[10]。分子生物學(xué)檢測(cè)方法與傳統(tǒng)方法相比檢測(cè)準(zhǔn)確快速，適用于檢測(cè)乳房鏈球菌的有實(shí)時(shí)熒光定量PCR[11]、多重PCR[12]、LAMP法[13]等。但是，實(shí)時(shí)熒光定量PCR費(fèi)用昂貴，多重PCR其敏感性和特異性有所下降，LAMP法容易出現(xiàn)引物間相互反應(yīng)，造成假陽(yáng)性的情況[14]，而普通PCR方法具有廉價(jià)、簡(jiǎn)單、快速的特點(diǎn)，與多重PCR和LAMP法相比擁有更高的可靠性。本研究建立的特異性檢測(cè)奶牛乳房鏈球菌的PCR方法具有特異性強(qiáng)、敏感性高的特點(diǎn)，能夠準(zhǔn)確的對(duì)不同來(lái)源的乳房鏈球菌臨床菌株進(jìn)行檢測(cè)，具有較高的可信度。與傳統(tǒng)細(xì)菌分離結(jié)合16 S rRNA測(cè)序鑒定法相比，用傳統(tǒng)細(xì)菌分離結(jié)合16 S rRNA測(cè)序鑒定法能夠分離檢測(cè)到乳房鏈球菌的奶樣，用PCR方法均能檢出，且PCR方法能夠檢測(cè)出傳統(tǒng)鑒定法無(wú)法檢測(cè)到乳房鏈球菌的樣本，表明PCR方法具有更高的靈敏度。

PCR方法的靈敏度遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)細(xì)菌分離結(jié)合16 S rRNA測(cè)序鑒定法，在于PCR方法只要奶樣中有少量的乳房鏈球菌DNA即可檢測(cè)出來(lái)，而采用傳統(tǒng)細(xì)菌分離方法，則有以下多種可能導(dǎo)致分離失敗:①由于乳房鏈球菌營(yíng)養(yǎng)要求高，增長(zhǎng)速度慢，本身不易分離，而乳房炎多呈混合感染，分離時(shí)該菌容易受到其他優(yōu)勢(shì)菌抑制而導(dǎo)致分離失??；②有些臨床奶樣可能含有抗生素，這樣的奶樣細(xì)菌分離時(shí)生長(zhǎng)受到抑制，難以分離；③假如細(xì)菌含量太少，沒(méi)有帶到平板中劃線(xiàn)，或者平板劃線(xiàn)時(shí)沒(méi)有分離出單菌落，或者分離出單菌落后，出現(xiàn)漏挑的情況，都能導(dǎo)致分離失??；④細(xì)菌已經(jīng)死亡，無(wú)法分離到該菌，但PCR方法仍可以檢出。傳統(tǒng)細(xì)菌分離結(jié)合16 S rRNA測(cè)序鑒定法能夠準(zhǔn)確的進(jìn)行診斷，但是也存在著以上多種原因?qū)е缕潇`敏度下降，且細(xì)菌分離鑒定耗時(shí)長(zhǎng)，測(cè)序鑒定費(fèi)用高，比較而言，本研究建立的PCR方法較傳統(tǒng)細(xì)菌分離結(jié)合16 S rRNA測(cè)序鑒定法更適用于臨床樣品的檢測(cè)。

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Abstract:Mastitis is one of the most popular diseases that causes significant economic loss in dairy cattle industry.Streptococcusuberisisis one of the pathogens leading to mastitis in dairy cows. According to the sequence ofStreptococcusuberispauA gene published by GenBank, one pair of primers were designed to establish a method for the detection ofStreptococcusuberis. And 460 milk samples were detected by this method, a total of 11 (2.39%) of positive milk samples were detected by traditional bacterial isolates, while 40(8.7%) of positive milk samples were detected by PCR, the coincidence rate between the 2 methods was 93.7%. The results showed that the new method is sensitive to detectStreptococcusuberisin clinical milk samples and had the advantages of high sensitivity and good specificity

Keywords:cows mastitis;Streptococcusuberis; polymerase chain reaction

DevelopmentofPCRforStreptococcusuberisDetectioninMilkofDairyCows

DIAO Qiao-hong1,3,4，BIAN Guo-zhi2,3，WANG Juan1,2，LUO Ai-jian3,4, ZHANG Ying3,4，GAO Xiao-yi3， JIA Kun3,4，SUN ling-shuang3,4，YUAN Jian-feng1,2

(1.GuangdongHaidInstituteofAnimalHusbandry&VeterinaryMedicine,Guangzhou,Guangdong,511400,China; 2.GuangdongHaidGroupCo.,Limited,Guangzhou,Guangdong,511400,China; 3.CollegeofVeterinaryMedicine，SouthChinaAgriculturalUniversity,Guangzhou,Guangdong,510642,China；4.GuangdongProvincialKeyLaboratoryofPreventionandControlforSevereClinicalAnimalDiseases,Guangzhou,Guangdong,510642,China)

S852.611;S858.23

A

1007-5038(2017)08-0014-05

2017-01-19

廣州市科技計(jì)劃項(xiàng)目(201510010250);廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2014A020208052，2015B020203005，2015A020224039);廣東省獸醫(yī)臨床重大疾病綜合防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(2013A061401013);廣東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新聯(lián)盟建設(shè)項(xiàng)目(2016LM2150);廣州市珠江科技新星(201610010073)

刁巧虹(1991-)，女，廣東揭陽(yáng)人，碩士研究生，主要從事臨床獸醫(yī)學(xué)研究。*