熱滅活無乳鏈球菌對奶牛乳腺成纖維細(xì)胞TGF-β1及其受體表達(dá)的影響

張芮今，丁玉林，畢艷楠，趙 彌，郭運(yùn)澤，王鳳龍

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010018)

熱滅活無乳鏈球菌對奶牛乳腺成纖維細(xì)胞TGF-β1及其受體表達(dá)的影響

張芮今，丁玉林，畢艷楠，趙 彌，郭運(yùn)澤，王鳳龍*

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010018)

研究無乳鏈球菌(GBS)對奶牛乳腺成纖維細(xì)胞(BMFB)轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)及其受體TβRⅠ表達(dá)的影響。6代和7代BMFB，在6、12、24、48 h時(shí)間點(diǎn)，分別用無血清培養(yǎng)液和105、106、108CFU/mL的不同濃度的熱滅活GBS作用于BMFB細(xì)胞。 RT-qPCR法檢測TGF-β1及TβRⅠ mRNA的表達(dá)，Western blot法檢測TGF-β1和TβRⅠ蛋白的表達(dá)。與對照組相比，TGF-β1mRNA的表達(dá)量明顯升高，于24 h達(dá)到最大值(P<0.05)；TGF-β1蛋白的表達(dá)于12 h達(dá)到最大值，24 h蛋白表達(dá)量開始明顯降低(P<0.05)。TβRⅠ mRNA的表達(dá)量較對照組的升高，在48 h達(dá)到峰值(P<0.05)；TβRⅠ蛋白表達(dá)量在12 h低于6 h，24 h達(dá)到峰值，之后又下降(P<0.05)。說明熱滅活無乳鏈球菌對BMFB TGF-β1及TβRⅠ mRNA和蛋白的表達(dá)有促進(jìn)作用。

熱滅活無乳鏈球菌；奶牛乳腺成纖維細(xì)胞；轉(zhuǎn)化生長因子β1；TβRⅠ

無乳鏈球菌(Streptococcusagalactiae,也稱group BStreptococcus,GBS)最初是從乳腺炎患牛中分離的，故被稱為無乳鏈球菌[1]。無乳鏈球菌是一種致病性極強(qiáng)的病原菌，在醫(yī)學(xué)臨床上不僅可以造成孕婦產(chǎn)婦產(chǎn)科疾病，如子宮內(nèi)膜炎、早產(chǎn)、晚期流產(chǎn)，還能造成新生嬰兒肺炎、敗血癥，甚至?xí)鹉X膜炎[2]。有研究發(fā)現(xiàn)，無乳鏈球菌也會(huì)引起水產(chǎn)魚類的臟器病變[3]，造成巨額損失。無乳鏈球菌也是引起奶牛乳腺炎的一種主要致病菌，它是一種專性乳腺寄生的高度接觸傳染性病原菌，主要引起隱性乳腺炎或部分臨床型乳腺炎[4]。組織纖維化的發(fā)生是機(jī)體對損傷的一種修復(fù)反應(yīng)，在組織損傷嚴(yán)重時(shí)，如果通過實(shí)質(zhì)細(xì)胞的再生不能完全修復(fù)，常出現(xiàn)肉芽組織增生，并產(chǎn)生多量細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)，器官發(fā)生纖維化[5]。轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor β1,TGF-β1)不僅參與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡、信號(hào)識(shí)別等生命活動(dòng)，同時(shí)在胚胎發(fā)育過程中還可以誘導(dǎo)特定的器官發(fā)生。有研究證明，TGF-β1在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程也起著重要作用[6]。研究發(fā)現(xiàn)，在TGF-β1作用下肺成纖維細(xì)胞可分化為肌成纖維細(xì)胞，通過TGF-β1/Smads信號(hào)通路參與肺纖維化的發(fā)生和發(fā)展[7]。同時(shí)，在腎臟纖維化啟動(dòng)和終止過程中TGF-β及其受體是發(fā)揮重要作用的關(guān)鍵細(xì)胞因子之一[8]。

目前對無乳鏈球菌的研究很多，卻鮮有報(bào)道無乳鏈球菌對奶牛乳腺纖維化影響。本研究采用熱滅活無乳鏈球菌作用于奶牛乳腺成纖維細(xì)胞，初步研究在奶牛乳腺纖維化過程中TGF-β1和TβRⅠ的相對表達(dá)量的變化，以探討無乳鏈球菌感染與成纖維細(xì)胞TGF-β1和TβRⅠ表達(dá)的相互關(guān)系，為細(xì)菌性奶牛乳腺纖維化的防控提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

奶牛乳腺成纖維細(xì)胞(BMFB)，來源于前期課題培養(yǎng)、分離、鑒定、凍存的荷斯坦奶牛乳腺細(xì)胞[9]；無乳鏈球菌由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院藥理組實(shí)驗(yàn)室提供[10]。DMEM/F12干粉培養(yǎng)基，Gibco公司產(chǎn)品；Trizol試劑(D910008A)、RT-qPCR擴(kuò)增試劑盒(RR820A)、DNA Marker，TaKaRa公司產(chǎn)品；RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(R122-01)，Vazyme試劑公司產(chǎn)品；小鼠β-actin抗體(ab6276)，Abcam公司產(chǎn)品；兔抗TGF-β1多克隆抗體，Millipore公司產(chǎn)品；兔抗TβRⅠ多克隆抗體(SC-399)，Santa Cruz公司產(chǎn)品；細(xì)胞裂解液、PMSF、BCA蛋白濃度測定試劑盒、山羊抗鼠IgG-HRP及山羊抗兔IgG-HRP，碧云天生物技術(shù)研究所產(chǎn)品；無蛋白封閉液、預(yù)染蛋白Marker(26616)和ECL顯影液(34095)，Thermo公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 熱滅活菌液的配制 取出凍存的無乳鏈球菌菌種，在30℃、120 r/min搖床環(huán)境下復(fù)蘇菌液，培養(yǎng)12 h?；罨?次后，采用瓊脂平板活菌計(jì)數(shù)法檢測菌液濃度。用無血清的DMEM/F12培養(yǎng)液，將菌液稀釋至105、106、108CFU/mL[11]。70℃滅活30 min，血瓊脂培養(yǎng)基鑒定沒有菌落生長，即可作為處理菌液。

1.2.2 細(xì)胞準(zhǔn)備和菌液作用 將復(fù)蘇的BMFB傳至6代～7代后，用0.5 g/L胰酶消化懸浮細(xì)胞，倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)，按1×105/mL的密度接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，待細(xì)胞培養(yǎng)板底部鋪滿單層細(xì)胞后，用無血清DMEM/F12培養(yǎng)液處理細(xì)胞24 h。對照組加入無血清的培養(yǎng)液，試驗(yàn)組加入不同濃度的熱滅活無乳鏈球菌菌液(105、106、108CFU/mL)，分別培養(yǎng)6、12、24、48 h后收集細(xì)胞。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測BMFB中TGF-β1和TβRⅠ mRNA的表達(dá)水平 按照TaKaRa RNAiso Plus操作說明書提取細(xì)胞總RNA。用酶標(biāo)儀檢測RNA的純度和濃度，將RNA濃度統(tǒng)一調(diào)整為500 ng/μL，參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，將獲得的cDNA置 -20℃保存?zhèn)溆?。根?jù)GenBank公布的β-actin、TβRⅠ和TGF-β1的序列，用 Primer 5.0 軟件設(shè)計(jì)引物，由上海生物工程有限公司合成引物(表1)。β-actin和TGF-β1的擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋篶DNA 95℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 34 s，循環(huán)40次，熔解反應(yīng)為60℃，1 min；TβRⅠ的擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋篶DNA 95℃ 30 s，95℃ 5 s，55℃ 34 s，循環(huán)40次，熔解反應(yīng)為65℃ 15 s。反應(yīng)結(jié)束后，繪制終產(chǎn)物的熔解曲線，以β-actin為管家基因。

表1 引物序列及擴(kuò)增參數(shù)

1.2.4 Western blot檢測BMFB TβRⅠ和TGF-β1蛋白的表達(dá) 按“1.2.2”步驟處理細(xì)胞，根據(jù)細(xì)胞瓶中細(xì)胞生長的密度，每瓶加入250 μL裂解液，在冰上裂解10 min后，用刮刀刮取細(xì)胞，將裂解液全部吸到1.5 mL離心管中，4℃、12 000 r/min離心10 min。取上清液，用BCA法測定蛋白總濃度。根據(jù)抗體說明書上預(yù)測蛋白的大小，100 g/L SDS-聚丙烯酰胺凝膠 (SDS-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE) 電 泳。每上樣孔的總蛋白量為25 μg，半干轉(zhuǎn)法將條帶電轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯 (polyvinylidene fluoride,PVDF)膜上，50 g/L BSA 室溫封閉2 h，一抗孵育16 h～18 h，4℃環(huán)境下過夜。一抗稀釋比例見表2。HRP標(biāo)記的二抗(1∶1 500)室溫孵育1.5 h，按ECL超敏顯色試劑盒說明書配置顯色液，室溫避光顯色5 s～1 min，在凝膠成像儀中觀察蛋白條帶結(jié)果，以β-actin為內(nèi)參。

表2 抗體稀釋比例

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果數(shù)據(jù)處理采用2-ΔCt法，Western blot條帶用Image J軟件進(jìn)行灰度值分析，以目的蛋白灰度值/內(nèi)參蛋白灰度值表示蛋白相對定量結(jié)果。然后用SPSS22軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，各組內(nèi)差異采用單因素方差分析，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 β-actin、TGF-β1和TβRⅠ引物特異性鑒定

以稀釋后的cDNA作為模板，β-actin作為內(nèi)參基因，對目的基因TGF-β1和TβRⅠ進(jìn)行熒光定量PCR檢測，根據(jù)擴(kuò)增得到的Ct值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示引物反應(yīng)性良好，相關(guān)系數(shù)R2均大于0.99，具有良好的相關(guān)性(圖1 A～圖1C)。RT-PCR產(chǎn)物條帶單一清晰，未見其他非特異性條帶，產(chǎn)物片段與預(yù)計(jì)產(chǎn)物大小相一致(圖2)。

2.2 對BMFB TGF-β1mRNA及其蛋白表達(dá)的影響

從圖3結(jié)果可以看出，在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)(6、12、24、48 h)，處理組(106CFU/mL、108CFU/mL)TGF-β1mRNA的表達(dá)量都高于對照組的(P<0.05)；在相同時(shí)間點(diǎn)，108CFU/mL熱滅活無乳鏈球菌刺激的BMFB TGF-β1mRNA表達(dá)量最高；108CFU/mL刺激24 h時(shí)TGF-β1mRNA表達(dá)達(dá)到最大值。圖4結(jié)果表明，處理組的TGF-β1蛋白表達(dá)水平顯著高于對照組的，相同時(shí)間點(diǎn)，隨著刺激濃度的增大，TGF-β1蛋白表達(dá)量升高；在24 h 106CFU/mL處理組蛋白表達(dá)量最大，108CFU/mL處理組蛋白表達(dá)水平明顯降低；在48 h 105CFU/mL處理組蛋白表達(dá)量最大，106CFU/mL和108CFU/mL處理組蛋白表達(dá)水平明顯降低；在12 h 106CFU/mL TGF-β1蛋白表達(dá)量達(dá)到最高峰(P<0.05)。

2.3 無乳鏈球菌對BMFB TβRⅠ mRNA及其蛋白表達(dá)的影響

圖5結(jié)果表明，在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)(6、12、24、48 h)，處理組(105、106、108CFU/mL)TβRⅠ mRNA的表達(dá)量均高于對照組的(P<0.05)；在相同時(shí)間點(diǎn)，除了12 h 106CFU/mL濃度下TβRⅠ mRNA表達(dá)量最高，其他時(shí)間點(diǎn)108CFU/mL濃度的熱滅活無乳鏈球菌刺激的BMFB TβRⅠ mRNA 表達(dá)量最高；108CFU/mL熱滅活無乳鏈球菌刺激48 h時(shí) TβRⅠ mRNA表達(dá)達(dá)到最大。從圖6結(jié)果可以看出，TβRⅠ處理組蛋白表達(dá)量均高于對照組的(P<0.05)，相同時(shí)間點(diǎn)，隨著刺激濃度的增大，TGF-β1蛋白表達(dá)量升高；在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)(6、12、24、48 h)，105CFU/mL處理組蛋白表達(dá)量最大；105CFU/mL熱滅活無乳鏈球菌刺激24 h時(shí)達(dá)到峰值。

A.β-actin標(biāo)準(zhǔn)曲線及溶解曲線；B.TGF-β1標(biāo)準(zhǔn)曲線及溶解曲線；C.TβRⅠ標(biāo)準(zhǔn)曲線及溶解曲線

A.Standard curve and melting curve of β-actin; B.Standard curve and melting curve of TGF-β1; C.Standard curve and melting curve of TβRⅠ

圖1 β-actin、TGF-β1及TβRⅠ標(biāo)準(zhǔn)曲線、熔解曲線

Fig.1 Standard curves and melting curves of β-actin,TGF-β1and TβRⅠ

M．DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 500 ；1、2．陰性對照；3、4．β-actin；5、6．TGF-β1；7、8．TβRⅠ

M．DNA Marker DL 500 ；1,2．Negative control；3,4．β-actin；5,6．TGF-β1；7,8．TβRⅠ

圖2 β-actin、TGF-β1和TβRⅠ的RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物條帶

Fig.2 RT-PCR products of β-actin,TGF-β1and TβRⅠ

*．P<0.05較對照組；**．P<0.01較對照組

*．P<0.05 compared with control;**.P<0.01 compared with control

圖3在不同作用時(shí)間點(diǎn)用不同濃度的無乳鏈球菌對BMFB TGF-β1mRNA相對表達(dá)量的影響

Fig.3 Effects of different concentrations ofStreptococcusagalactiaeon mRNA expressions of TGF-β1at differents time points in BMFB

*．P<0.05較對照組；**．P<0.01較對照組

*．P<0.05 compared with control;**.P<0.01 compared with control

圖4在不同作用時(shí)間點(diǎn)用不同濃度的無乳鏈球菌對BMFB TGF-β1蛋白表達(dá)的影響

Fig.4 Effects of different concentrations ofStreptococcusagalactiaeon protein expressions of TGF-β1at different time points in BMFB

3 討論

無乳鏈球菌進(jìn)入乳腺造成組織損傷，炎性細(xì)胞浸潤，會(huì)引起炎性細(xì)胞因子(如TNF-α、IL-1β)表達(dá)量升高[12]，這些因子會(huì)激活促纖維化的相關(guān)機(jī)制，導(dǎo)致ECM的積聚，最終引起纖維化。TGF-β1是炎癥發(fā)生中的一種重要因子，與ECM的積聚緊密相關(guān)。毛忠懿等[13]在研究TGF-β1和整合素連接激酶(integrin-linked kinase,ILK)在大鼠肝纖維化中的表達(dá)試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，隨著肝纖維化的發(fā)展，TGF-β1表達(dá)程度隨時(shí)間的延長呈明顯遞增趨勢，表明大鼠肝組織纖維化與TGF-β1的表達(dá)相關(guān)。Tao Z[14]研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1與心肌梗死(myocardial infarction,MI)相關(guān)的心臟纖維化發(fā)展中起重要作用，通過葛根素抑制TGF-β1在心臟組織中的表達(dá)，從而顯著的減弱心肌纖維化。本研究結(jié)果顯示，熱滅活無乳鏈球菌作用于體外培養(yǎng)的BMFB，TGF-β1mRNA和蛋白表達(dá)量都顯著地升高。丁旭娜等[9]利用外源性 TGF-β1作用于BMFB，引起了乳腺成纖維細(xì)胞中α-SMA、CTGF和COLI α1 mRNA和蛋白的表達(dá)量升高，也表明了TGF-β1在奶牛乳腺纖維化中的重要性。

*．P<0.05較對照組；**．P<0.01較對照組

*．P<0.05 compared with control;**．P<0.01 compared with control

圖5不同作用濃度無乳鏈球菌在不同作用時(shí)間對BMFB TβRⅠ mRNA表達(dá)的影響

Fig.5 Effects of different concentrations ofStreptococcusagalactiaeon mRNA expressions of TβRⅠ at different time points in BMF

*．P<0.05較對照組；**．P<0.01較對照組

*．P<0.05 compared with control;**．P<0.01 compared with control

圖6不同作用濃度無乳鏈球菌在不同作用時(shí)間對BMFB TβRⅠ蛋白表達(dá)的影響

Fig.6 Effects of different concentrations ofStreptococcusagalactiaeon protein expressions of TβRⅠ at different time points in BMFB

TGF-β1的受體有Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型3種類型。TβRⅠ又稱活化素受體樣激酶(actin receptor-like kinase，ALK)，它在纖維化中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。有研究顯示，在大鼠心肌梗死模型中，利用阻斷劑阻斷TβRⅠ后，會(huì)明顯減輕心肌梗死后的左心室重塑和心肌收縮功能障礙[15]，TβRⅠ可能是心肌梗死后心肌重塑過程中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)分子之一[16]。Wang B等[17]等研究證明，靶向抑制腎臟細(xì)胞TβRⅠ的表達(dá)可以有效抑制腎臟的纖維化。冀紅等[18]的博來霉素致大鼠肺間質(zhì)纖維化試驗(yàn)中，對TβRⅠ的3種亞型(ALK4、ALK5、ALK7)進(jìn)行了研究，結(jié)果表明ALK4、ALK5和ALK7均在肺間質(zhì)纖維化的發(fā)生發(fā)展過程中存在高表達(dá)。也有研究發(fā)現(xiàn)，TβRⅠ在mRNA和/或蛋白水平上的表達(dá)降低或缺失可能引起腫瘤的發(fā)生[19]。本研究結(jié)果顯示，熱滅活的無乳鏈球菌作用于體外培養(yǎng)的BMFB時(shí)，TβRⅠ mRNA和蛋白表達(dá)量都顯著升高，說明無乳鏈球菌能促進(jìn)BMFB TβRⅠ mRNA和蛋白的表達(dá)。

在自然情況下，合成和分泌的TGF-β1是沒有生物活性的，只有與TβRⅠ和TβRⅡ結(jié)合后，激活TβRⅠ的絲氨酸/蘇氨酸激酶活性，活化TβRⅠ，才能最終啟動(dòng)TGF-β/Smad通路。TβRⅠ磷酸化激活細(xì)胞內(nèi)的Smad2、Smad3 蛋白，Smad2、Smad3 蛋白與Smad4 結(jié)合形成一個(gè)寡聚復(fù)合物進(jìn)入核內(nèi)，將信號(hào)從胞質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)到細(xì)胞核，調(diào)控下游基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)[20]。Meng X M等[21]研究發(fā)現(xiàn)，在腎纖維發(fā)生過程中， Smad3和Smad7之間的平衡移動(dòng)會(huì)導(dǎo)致肌成纖維細(xì)胞的積累和活化，ECM的過量產(chǎn)生和患病腎中ECM降解的減少。TGF-β/Smad信號(hào)通路可在膜受體、細(xì)胞內(nèi)信號(hào)分子和核內(nèi)基因水平等多個(gè)層次發(fā)生復(fù)雜的交互調(diào)節(jié)，調(diào)控纖維化的發(fā)生發(fā)展[22]。

在本課題組前期的研究結(jié)果中，吳建美[11]關(guān)于金黃色葡萄糖球菌對奶牛乳腺成纖維細(xì)胞TGF-β1表達(dá)和王一[23]關(guān)于大腸埃希菌對奶牛乳腺成纖維細(xì)胞TGF-β1表達(dá)都有明顯的升高。Gao Y等[24]采用外源性TGF-β1作用乳腺成纖維細(xì)胞和小鼠乳腺基部注射外源性TGF-β1的方法，證實(shí)TGF-β1通過ERK1/2信號(hào)通路顯著促進(jìn)奶牛乳腺成纖維細(xì)胞外基質(zhì)α-SMA和Collagen-I表達(dá)，在小鼠乳腺組織上進(jìn)一步驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)TGF-β1能顯著促進(jìn)乳腺組織纖維化的發(fā)生。楊彬等[25]等研究表明，BMFBs在熱滅活金黃色葡萄球菌刺激下能夠顯著促進(jìn)TGF-β1mRNA和α-SMA、Collagen-I、p-Smad2/3的蛋白質(zhì)表達(dá)，提示金黃色葡萄球菌可能通過TGF-β1/Smad信號(hào)通路誘導(dǎo)奶牛乳腺成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細(xì)胞。以上研究結(jié)果都表明了TGF-β1對乳腺纖維化的重要作用。本研究證明熱滅活的無乳鏈球菌可以促進(jìn)體外培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞中TGFβ1和TβRⅠ的mRNA及蛋白的表達(dá)，對于無乳鏈球菌通過何種途徑引起TGF-β1及其受體的表達(dá)，最終引起纖維化有待進(jìn)一步研究。

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Abstract:In order to investigate the effects of different concentrations of heat-inactivatedStreptococcusagalactiaeon the expressions of transforming growth factor β1(TGF-β1) and its receptor TβRⅠ in bovine mammary fibroblasts (BMFB),6 or 7 generations of culturedinvitroBMFBs were exposed to the serum-free medium and the heat-inactivated GBS at different concentrations (105,106,108CFU/mL),respectively,and the total RNA and proteins were extracted from the cells after 6，12，24 and 48 hour,respectively.The mRNA expressions of TGF-β1and TβRⅠ were detected by real-time fluorescence quantitative PCR,The protein expressions of TGF-β1and TβRⅠ were detected by Western-blot.Compared with the control group,the mRNA expression of TGF-β1was significantly elevated when BMFB were exposed to GBS,and reached the maximal levels at 24 h(P<0.05).The protein expression of TGF-β1reached the maximal levels at 12 h,and then the expression went down at 24 h(P<0.05).The expression of TβRⅠ mRNA was higher than that of the control group,and reached the maximal levels at 48 h (P<0.05).The expression of TβRⅠ protein at 12 h was lower than that at 6 h,and reached the maximal levels at 48 h,and then the expression went down (P<0.05).The preliminary study confirmed that heat-inactivatedStreptococcusagalactiaecould promote the expressions of TGF-β1and TβRⅠ mRNA and protein in BMFBs.

Keywords: heat inactivated;Streptococcusagalactiae; bovine mammary fibroblasts; transforming growth factor β1; TβRⅠ

EffectofHeatInactivatedStreptococcusagalactiaeonexpressionsofTGF-β1andTβRⅠinBMFB

ZHANG Rui-jin,DING Yu-lin,BI Yan-nan,ZHAO Mi,GUO Yun-ze,WANG Feng-long

(CollegeofVeterinaryMedicine,InnerMongoliaAgriculturalUniversity,InnerHohhot,Mongolia,010018,China)

S852.611

A

1007-5038(2017)08-0007-07

2017-01-12

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31460642)

張芮今(1989-) ，男，內(nèi)蒙古赤峰人，碩士研究生，主要從事動(dòng)物傳染病與免疫病理學(xué)研究。*