新加麻黃附子細辛湯對小鼠Lewis原位肺癌的治療作用

姚靜靜，杜振華，李自波，杜鋼軍

河南大學藥學院 藥物研究所，河南 開封 475004

新加麻黃附子細辛湯對小鼠Lewis原位肺癌的治療作用

姚靜靜，杜振華，李自波，杜鋼軍

河南大學藥學院 藥物研究所，河南 開封 475004

〔目的〕 觀察新加麻黃附子細辛湯對小鼠Lewis原位肺癌是否有治療作用?！卜椒ā?Lewis肺癌細胞滴氣管建立小鼠Lewis原位肺癌模型，次日用新加麻黃附子細辛湯(麻黃∶細辛∶附子∶半夏=1∶2∶2∶5)灌胃開始治療，觀察各組小鼠的生存狀態(tài)、腫瘤數(shù)目及致瘤率；HE染色法觀察肺病理變化?！步Y(jié)果〕 用Lewis肺癌細胞滴氣管建立的Lewis原位肺癌模型8周后致瘤率為91%，腫瘤數(shù)目平均為17±3.05；新加麻黃附子細辛湯在相同時間內(nèi)致瘤率為69%，腫瘤數(shù)目平均為12±1.53。HE染色結(jié)果表明：正常組小鼠肺部切片未見癌細胞；模型組小鼠肺組織間聚集有片狀核大深染的腫瘤細胞，出現(xiàn)明顯癌變，細胞核與細胞質(zhì)比例失常，細胞核密集，空洞逐漸變??；新加麻黃附子細辛湯組細胞核密集區(qū)相對較少。與模型組比較，新加麻黃附子細辛湯組體質(zhì)量明顯上升，攝水食量增加，自主活動增多，精神狀態(tài)良好?！步Y(jié)論〕新加麻黃附子細辛湯能夠延長Lewis原位肺癌模型小鼠的生存時間，對小鼠Lewis原位肺癌具有治療作用。

新加麻黃附子細辛湯；肺癌；Lewis細胞；治療作用

Abstract: 〔Objective〕To observe the effect of the new-added Mahuang Fuzi Xixin Decoction on orthotopic Lewis lung cancer in mice.〔Methods〕Orthotopic Lewis lung cancer model in mice was established by injecting Lewis lung cancer cells into trachea. The next day, the mice received the new added Mahuang Fuzi Xixin Decoction[ephedra∶Asarum∶aconite∶Pinellia =1∶2∶2∶5] via intragastric administration.The survival status of mice, tumors number and tumorigenicity were observed. The lung pathological changes were observed by HE staining.〔Results〕The tumorigenicity rate in the model group was 91% at 8 weeks and the average tumors number was 17±3.05. The tumorigenicity rate in the new added Mahuang Fuzi Xixin Decoction at the same time was 69% and the average tumors number was 12±1.53. HE staining showed that there were no cancer cells in lung sections in normal mice. In the model group, the tumor cells were flaky and deeply stained. The proportion of nucleus and cytoplasm was abnormal, the nucleus was dense, and the cavity became smaller. There was relatively few dense nuclei in the new-added Mahuang Fuzi Xixin Decoction group. Compared with the model group, the body weight in the new-added Mahuang Fuzi Xixin Decoction group significantly increased, water intake increased, and the mental state was good.〔Conclusion〕The new-added Mahuang Fuzi Xixin Decoction could prolong the survival time of mice with Lewis lung cancer and had therapeutic effect on orthotopic Lewis lung cancer in mice.

Keywords: A new added of Mahuang Fuzi Xixin Decoction; lung cancer; Lewis cells; therapeutic effect

目前，在肺癌的動物實驗中，大多使用小鼠皮下種植肺癌細胞系，在皮下形成肺癌腫瘤結(jié)節(jié)的動物模型，如孫秋艷等[3]用體外培養(yǎng)的 Lewis 細胞懸液注射于小鼠左側(cè)腋下，形成皮下腫瘤。這種肺癌模型成瘤率高，基本可以達到100%，并且周期短，適合腫瘤的活性篩選和評價。但是，皮下接種瘤脫離了原位微環(huán)境的影響，往往和臨床實際情況不符[4]。為了保證動物模型和臨床結(jié)果的一致性，本實驗擬采用Lewis 肺癌細胞滴氣管，建立小鼠Lewis原位肺癌模型，觀察新加麻黃附子細辛湯對肺癌的治療作用。

1 材料與儀器

1.1 實驗細胞

小鼠 Lewis 肺癌細胞( LLC)，購于中科院上海細胞庫。

1.2 實驗動物

昆明小鼠，雄性，由河南省醫(yī)學實驗動物中心提供。

1.3 藥品及試劑

新加麻黃附子細辛湯制備方法：分別稱取原藥材麻黃10 g、細辛20 g、附子20 g、半夏50 g(即按照1∶2∶2∶5進行組方)，混合后自來水沖洗干凈，加水量沒過藥面，浸泡30 min，中火煎煮，時間30 min，取水煎液。重復上述過程，共煎煮 3 次。合并3次濾液加熱濃縮至400 mL，使水煎液濃度為10 g/kg。

試劑包括：體積分數(shù)為10%的 胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基、質(zhì)量分數(shù) 0.25% 的胰酶(美國Hyclone公司產(chǎn)品)、生理鹽水、戊巴比妥鈉、PBS緩沖液、蘇木精、鹽酸酒精、伊紅。

1.4 實驗儀器

CO2細胞培養(yǎng)箱(賽默飛世爾科技有限公司)；HDL超凈工作臺(北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司)；高速冷凍離心機(北京京立離心機有限公司)；電子天平(上海精密科學儀器有限公司)；電子體溫計(泰克曼電子儀器有限公司)；YSL-1A多功能小鼠自主活動記錄儀(淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司)；KD202C轉(zhuǎn)輪式切片機(浙江金華科迪儀器設(shè)備有限公司)。

2 實驗方法

2.1 細胞培養(yǎng)

將小鼠 Lewis 肺癌細胞置于含體積分數(shù)10%的胎牛血清及 DMEM完全培養(yǎng)液中,在37 ℃、體積分數(shù)為5 %的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),2～3 d 更換1次培養(yǎng)液，質(zhì)量分數(shù)為0.25%的胰蛋白酶消化傳代。待細胞達到所需量時，顯微鏡下計數(shù)，調(diào)至所需要濃度。

2.2 造模

先以0.2 mL(約 1×106個細胞)接種于昆明小鼠腋下，20 d 后以頸椎脫臼法處死荷瘤小鼠，體積分數(shù)為75%的酒精浸泡消毒，無菌條件下剝離腫瘤組織，剪碎后用預冷的無菌生理鹽水洗凈，用組織研磨器研碎，制成瘤細胞懸液，1 000 r/min,5 min,離心2次，加入生理鹽水調(diào)整細胞濃度為 5×106個/mL。體積分數(shù)0.5%的戊巴比妥鈉溶液，按0.1 mL/10 g體質(zhì)量劑量對昆明小鼠進行腹腔注射麻醉，取上述瘤細胞懸液10 μL 滴入昆明小鼠氣管中。

我坐在她懷里，喂她吃菜，她坐我腿上，勾著我脖子，讓我跟她喝交杯酒。她興致勃勃，又唱又跳。我說，你小聲點兒，別把陸茂本他們招來。她笑著說，我不吱聲，他們就不來嗎？我有點不痛快，問，難道他們來過？

2.3 分組及給藥

造模后將36只昆明種雄鼠隨機分為3組，每組12只，分別為：新加麻黃附子細辛湯組(即復方組)、模型組、正常組。復方組及模型組次日開始給藥，復方組以10 g/kg灌胃給藥，2次/d；模型組以0.2 mL/10 g蒸餾水灌胃，2次/d。正常組按正常方式飼養(yǎng)。

2.4 檢測指標及方法

實驗開始后各組動物每周記錄體質(zhì)量、水食量、自主活動等變化情況，以此對比小鼠的活躍程度。實驗結(jié)束后，小鼠摘眼球取血，頸椎脫臼法處死小鼠，解剖分離得到肺組織，計算小鼠肺組織表面的腫瘤數(shù)目及致瘤率。

2.5 病理檢測

小鼠處死后，取各組小鼠肺組織用體積分數(shù)為4%的多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋、切片、HE染色、乙醇脫水、透明、封片，顯微鏡下觀察肺組織病理學變化。

2.6 統(tǒng)計學分析

3 實驗結(jié)果

3.1 對小鼠體質(zhì)量變化的影響

正常組小鼠體質(zhì)量明顯增加，模型組小鼠體質(zhì)量呈逐漸減輕的趨勢，小鼠狀態(tài)明顯下降，復方組小鼠體質(zhì)量相對平穩(wěn)。見圖1。

圖1 小鼠體質(zhì)量變化趨勢

3.2 對小鼠水食變化的影響

與正常組相比，模型組小鼠食欲欠佳，飲水量和飲食量都相應(yīng)減少，復方組食欲正常，基本和正常組保持相平。見圖2、圖3。

圖2 小鼠飲水量的變化

圖3 小鼠飲食量的變化

3.3 對小鼠自主活動的影響

各組小鼠的自由活動次數(shù)隨著試驗時間的增長而逐漸減少，復方組小鼠的自由活動次數(shù)雖有所下降，但是仍然較模型組高。說明復方組小鼠比模型組精神狀態(tài)好，具有顯著性差異。見圖4。

3.4 新加麻黃附子細辛湯對小鼠Lewis原位肺癌腫瘤數(shù)目和致瘤率的影響

圖5可見，正常組肺組織鮮紅；Lewis 原位肺癌模型組有明顯的肺損傷，腫瘤區(qū)域較多；復方組肺組織表面比模型組腫瘤數(shù)減少。

用Lewis肺癌細胞滴氣管建立的Lewis原位肺癌模型8周后腫瘤數(shù)目平均為17±3.05，致瘤率為91%；而復方組在相同時間內(nèi)腫瘤數(shù)目為12±1.53，致瘤率為69%，具有顯著性差異(P<0.05 )。表明新加麻黃附子細辛湯對小鼠Lewis原位肺癌具有治療作用。

圖4 小鼠自主活動的變化

圖5 昆明小鼠肺組織變化

3.5 病理學檢測結(jié)果

將各組小鼠的肺組織切片進行HE染色，在顯微鏡下觀察到：正常組小鼠肺部切片未見癌細胞，結(jié)構(gòu)排列整齊；模型組小鼠肺組織間聚集有片狀核大深染的腫瘤細胞，出現(xiàn)明顯癌變，出現(xiàn)核裂解現(xiàn)象，細胞核大而清楚，核仁增大，細胞核與細胞質(zhì)比例失常，細胞核密集，空洞逐漸變??；復方組細胞核明顯小于模型組，有少量的腫瘤細胞進入，說明新加麻黃附子細辛湯能明顯改善Lewis肺癌模型肺組織的病理變化。結(jié)果見圖6。

圖6 昆明種小鼠肺癌組織病理結(jié)果

4 討論

中藥復方在抗腫瘤方面發(fā)揮著日益重要的作用，而肺癌作為最主要和最常見的腫瘤，許多復方已在其治療或輔助治療過程中體現(xiàn)出了很大的應(yīng)用價值[5]。寒邪是六淫邪氣之一，與腫瘤的發(fā)病機制關(guān)系密切[6]?！秱摗分杏涊d麻黃附子細辛湯，方中麻黃解表發(fā)汗，除太陽表之寒邪；制附子扶陽溫里暖少陰之里；細辛溫經(jīng)通陽，入里佐附子溫經(jīng)通少陰，助陽散里寒，出外助麻黃發(fā)汗溫經(jīng)解表散寒，具有扶正解表、散寒止痛的功效[7]。雖然麻黃附子細辛湯有較強的散寒作用，但化痰作用偏弱。為了增強化痰作用，在麻黃附子細辛湯基礎(chǔ)上增加半夏，半夏具有燥濕化痰的功效，和肺癌的發(fā)病機制相吻合，諸藥合用對肺癌具有良好的治療作用。

本研究通過麻黃細辛附子湯加半夏組成的新加麻黃附子細辛湯來研究其水煎液對小鼠Lewis原位肺癌的治療作用。研究表明，模型組小鼠的腫瘤數(shù)目和致瘤率明顯比新加麻黃附子細辛湯多，具有顯著性差異。在生存狀態(tài)方面，與正常組相比，模型組小鼠體質(zhì)量下降，食欲欠佳，飲水、飲食量減少，精神狀態(tài)不好，活動減少。復方組比模型組體質(zhì)量明顯上升，攝水食量有所增加，精神狀態(tài)良好。HE染色結(jié)果表明，新加麻黃附子細辛湯組肺組織間腫瘤細胞明顯比模型組少。

綜上所述，用Lewis肺癌細胞滴氣管建立小鼠Lewis原位肺癌模型，具有較好的成瘤率及轉(zhuǎn)移特性。新加麻黃附子細辛湯是治療肺癌的一個好方劑。

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[4] 李寧,張曉曄,蔣中秀,等.小鼠Lewis肺癌原位模型的建立[J].中國實驗動物學報,2014,22(5):79-83.

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[責任編輯時紅]

ThetherapeuticeffectofthenewaddedMahuangFuziXixinDecoctiononOrthotopicLewislungcancerinmice

YAO Jingjing ,DU Zhenhua, LI Zibo, DU Gangjun

Intitute of Pharmacy, Pharmaceutical College of Henan University, Henan Kaifeng 475004, China

R734.2

A

1672-7606(2017)03-0160-04

2016-11-17

國家自然科學基金項目(81173094)

姚靜靜(1993-)，女，山西晉城人，在讀研究生，研究方向：中藥藥理學與腫瘤藥理學。