γ分泌酶抑制劑阻斷Notch信號(hào)通路對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的影響

孟繼明，唐紅娜，劉曉明，王朝陽,2，任學(xué)群,2,3

1. 河南大學(xué)淮河醫(yī)院 普外科，河南 開封 475000； 2. 河南大學(xué) 循證醫(yī)學(xué)中心，河南 開封 475000； 3. 河南大學(xué)淮河醫(yī)院 轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心，河南 開封 475000

γ分泌酶抑制劑阻斷Notch信號(hào)通路對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的影響

孟繼明1，唐紅娜1，劉曉明1，王朝陽1,2，任學(xué)群1,2,3

1. 河南大學(xué)淮河醫(yī)院 普外科，河南 開封 475000； 2. 河南大學(xué) 循證醫(yī)學(xué)中心，河南 開封 475000； 3. 河南大學(xué)淮河醫(yī)院 轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心，河南 開封 475000

〔目的〕 探索γ分泌酶抑制劑 MW167阻斷Notch信號(hào)通路對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的影響。〔方法〕 通過Western blotting 和RT-PCR方法檢測(cè)Notch受體各亞型的表達(dá)。用不同濃度(5、10、20μmol/L)MW167處理肝癌細(xì)胞，48h后用Western blotting法檢測(cè)Notch各蛋白的表達(dá)，采用RT-PCR法檢測(cè)Notch信號(hào)通路下游基因HES1 mRNA表達(dá)，MTT法測(cè)定細(xì)胞增殖。〔結(jié)果〕 HepG2細(xì)胞中可檢測(cè)到Notch1～4 蛋白和mRNA的表達(dá)。不管是與培養(yǎng)基對(duì)照還是DMSO對(duì)照相比，不同濃度MW167對(duì)Notch1～4蛋白的表達(dá)沒有顯著影響。與相應(yīng)濃度的對(duì)照組相比，MW167處理組HES1 mRNA表達(dá)下降(P<0.05)。隨著MW167處理濃度升高，HES1 mRNA表達(dá)抑制率逐漸升高(P<0.05)。MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示，MW167處理的細(xì)胞，其吸光度高于對(duì)照組(P<0.05)，且隨著MW167濃度的升高，細(xì)胞增殖率相應(yīng)升高?！步Y(jié)論〕HepG2細(xì)胞中可檢測(cè)到Notch1～4蛋白和mRNA的表達(dá)，MW167處理可降低HES1 mRNA表達(dá)，MW167處理可促進(jìn)細(xì)胞的增殖。

γ分泌酶抑制劑；MW167；Notch信號(hào)通路；肝細(xì)胞肝癌

Abstract: 〔Objective〕To explore the influence of blocking Notch signaling pathway by γ-secretase inhibitor on proliferation of HepG2 cells. 〔Methods〕The expression of Notch 1～4 was determined with Western blotting and RT-PCR methods. HepG2 cells were treated by 5, 10 and 20μmol/LMW167. 48h after treatment, protein expression of Notch 1～4 was determined. HES1 mRNA expression was measured by RT-PCR technology. Cell proliferation was determined with MTT method.〔Results〕The genetic and protein expressions of Notch 1～4 were observed in HepG2 cells. MW167 showed no influences on the expression of these proteins. Compared with corresponding control, HES1 mRNA expression was decreased (P<0.05).〔Conclusion〕The inhibition rates were increased as the concentration increased. MW167 treatment could improve the cell proliferation of HepG2 cells.

Keywords: γ-secretase inhibitor; MW167; Notch pathway; hepatocellular carcinoma (HCC)

肝細(xì)胞肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是最常見的惡性腫瘤之一，是嚴(yán)重威脅人類生命的重大疾病，是世界癌癥相關(guān)死亡的第二大病因。目前，對(duì)肝癌相關(guān)信號(hào)傳導(dǎo)通路的研究尚不明了，肝癌信號(hào)通路的深入研究對(duì)于肝癌的早期預(yù)防和治療具有關(guān)鍵作用。Notch信號(hào)通路，是進(jìn)化中高度保守的信號(hào)傳導(dǎo)通路，在胚胎發(fā)育、細(xì)胞增殖凋亡和腫瘤形成等過程中發(fā)揮重要作用[1-2]。近年來研究[3-4]顯示，Notch信號(hào)通路與肝癌的發(fā)生有密切關(guān)系。本文應(yīng)用γ分泌酶抑制劑MW167阻斷Notch信號(hào)通路，進(jìn)而研究對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株與藥物

HepG2細(xì)胞株，購自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物所。γ分泌酶抑制劑MW167(Merck公司)；胎牛血清(Hyclone公司)；DMEM高糖培養(yǎng)基(Gibco公司)；RT-PCR試劑盒(TaKaRa公司)；引物(上海生工生物工程有限公司合成)；TRIzol(Invitrogen公司)；Notch1～4單克隆抗體(Cell signaling technology公司)；GAPDH單克隆抗體(上?？党缮锕こ坦?；HRP標(biāo)記的羊抗大鼠二抗、羊抗兔二抗及羊抗小鼠二抗(上海威奧生物科技公司)；細(xì)胞裂解液(碧云天生物公司)；PVDF膜和ECL發(fā)光試劑盒(碧云天生物公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

將細(xì)胞密度為1×105/mL的HepG2細(xì)胞接種到含有體積分?jǐn)?shù)為10%FBS的高糖型DMEM培養(yǎng)基中(5 mL)，在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5% CO2、完全飽和濕度條件下培養(yǎng)。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 Western blotting檢測(cè)Notch各受體蛋白表達(dá)

收集HepG2細(xì)胞，提取總蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜，分別接Notch1～4單克隆一抗進(jìn)行孵育、洗膜，接相應(yīng)二抗進(jìn)行孵育。實(shí)驗(yàn)中，一抗按1∶1 000比例稀釋，二抗按1∶2 000比例稀釋。加ECL發(fā)光，凝膠成像儀(Bio-Rad)拍照。

1.4 RT-PCR檢測(cè)Notch1～4的表達(dá)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HepG2細(xì)胞約1×106個(gè)，提取總RNA，分光光度計(jì)檢測(cè)基因濃度與純度。引物序列見表1。反轉(zhuǎn)錄條件：30 ℃，10 min；42 ℃，30 min；99 ℃，5 min。RT-PCR操作按說明書進(jìn)行。Notch1、Notch3的退火溫度設(shè)定為60 ℃，Notch2退火溫度設(shè)定為56 ℃，Notch4退火溫度設(shè)定為58 ℃。質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的瓊脂糖凝膠電泳對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行檢驗(yàn)。凝膠成像系統(tǒng)對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。

1.5 Western blotting 檢測(cè)MW167對(duì)Notch1～4蛋白表達(dá)的影響

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HepG2細(xì)胞接種6孔板，每個(gè)孔內(nèi)15×104個(gè)。70%的細(xì)胞融合后，用無血清培養(yǎng)基，饑餓培養(yǎng)24 h，加含不同濃度MW167(5、10、20μmol/L)的無血清培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，二甲基亞砜(DMSO)處理設(shè)定為對(duì)照組。48 h后提取蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，操作同1.3。Quantity-One軟件分析條帶吸光度。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.6 RT-PCR檢測(cè)MW167對(duì)Notch下游基因HES1表達(dá)的影響

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HepG2細(xì)胞接種6孔板，每個(gè)孔內(nèi)15×104個(gè)。70%的細(xì)胞融合后，用無血清培養(yǎng)基，饑餓培養(yǎng)24 h，加含不同濃度MW167(5、10、20 μmol/L)的無血清培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。48 h后提取總RNA，然后進(jìn)行RT-PCR操作。HES1引物序列(表1)：5’-CCCTCCTCCTAAACTCCC-3’(上游引物)和5’-AATACAAAGGCGCAATCC-3’(下游引物)。擴(kuò)增條件為94 ℃，30 s；58 ℃，30 s；72 ℃，1 min。28個(gè)循環(huán)。質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的瓊脂糖凝膠電泳對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，凝膠成像系統(tǒng)分析結(jié)果。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值進(jìn)行分析。

1.7 MTT測(cè)定細(xì)胞增殖

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HepG2細(xì)胞，細(xì)胞密度調(diào)整為1×104個(gè)/mL，接種于96孔板。每孔中加入200 μL細(xì)胞懸液。細(xì)胞貼壁后，換無血清培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)24 h，加含不同濃度MW167(5、10、20 μmol/L)的無血清培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。每個(gè)濃度設(shè)對(duì)照組(DMSO處理)，空白調(diào)零組(只加培養(yǎng)基)，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。在MW167處理培養(yǎng)48 h后，每孔分別加20 μL MTT溶液(5g/L)，繼續(xù)孵育4 h，每孔加入150 μL DMSO，震蕩溶解甲瓚后，設(shè)置酶標(biāo)儀波長(zhǎng)為490 nm，測(cè)定吸光度。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。t檢驗(yàn)進(jìn)行各組間均值比較，多組間比較采用單因素方差分析，P<0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 Notch受體蛋白各亞型在HepG2細(xì)胞的表達(dá)

Western blotting 實(shí)驗(yàn)顯示，HepG2細(xì)胞中可檢測(cè)到Notch受體蛋白各亞型的表達(dá),見圖1。RT-PCR實(shí)驗(yàn)證明，HepG2細(xì)胞中可檢測(cè)到Notch1～4 mRNA的表達(dá)，見圖2。

表1 引物序列

圖1 HepG2細(xì)胞中Notch1～4蛋白的表達(dá)

1.Marker;2.GAPDH;3.Notch1;4.Noth2;5.Notch3;6.Notch4圖2 RT-PCR法測(cè)定HepG2細(xì)胞Notch1～4 mRNA的表達(dá)量

2.2 γ分泌酶抑制劑MW167對(duì)Notch1～4 表達(dá)的影響

從圖3可看出，不管是與培養(yǎng)基還是DMSO對(duì)照相比，不同濃度MW167對(duì)Notch1～4蛋白的表達(dá)沒有顯著影響。

2.3 MW167對(duì)Notch下游基因HES1表達(dá)的影響

MW167處理HepG2細(xì)胞后，RT-PCR法測(cè)定HES1 mRNA 的表達(dá)，與相應(yīng)濃度的對(duì)照組相比，MW167處理組HES1 mRNA表達(dá)下降(P<0.05)。隨著MW167處理濃度升高，HES1 mRNA表達(dá)抑制率逐漸升高(P<0.05)。見圖4。

1.培養(yǎng)基對(duì)照；2.DMSO對(duì)照；3、4、5分別為5、10、20 μmol/L MW167加藥組圖3 不同濃度MW167作用下HepG2細(xì)胞中Notch1～4蛋白的表達(dá)

1、3、5分別為5、10、20 μmol/L M167處理；2、4、6分別為相應(yīng)處理濃度的對(duì)照組圖4 不同濃度MW167對(duì)Notch下游基因HES1表達(dá)的影響

2.4 MW167對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的影響

MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示，MW167處理的細(xì)胞，其吸光度高于對(duì)照組(P<0.05)，且隨著MW167濃度的升高，細(xì)胞增殖率相應(yīng)升高,見表2。

3 討論

自1917年Morgan發(fā)現(xiàn)Notch基因以來，對(duì)Notch功能與結(jié)構(gòu)的研究不斷深入。從組織自我更新，胚胎發(fā)育到腫瘤的發(fā)生，Notch都發(fā)揮重要作用。在對(duì)腫瘤的研究[5]中發(fā)現(xiàn)，血液系統(tǒng)腫瘤及大部分器官的實(shí)體腫瘤，Notch基因的作用得到了認(rèn)同。

表2 不同濃度MW167對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的影響

注：*表示與對(duì)照組相比，存在顯著差異(P<0.05)；#表示與5μmol/L相比，存在顯著差異(P<0.05)。

Notch信號(hào)通路，通過相鄰細(xì)胞間的相互作用，對(duì)細(xì)胞分化潛能可進(jìn)行精確調(diào)控。相鄰細(xì)胞通過Notch受體與配體的結(jié)合，傳遞Notch信號(hào)，從而擴(kuò)大細(xì)胞間分子差異，對(duì)細(xì)胞命運(yùn)起決定作用，最終影響器官的形成和形態(tài)發(fā)生。Notch信號(hào)，是相鄰細(xì)胞之間的通訊，對(duì)細(xì)胞發(fā)育進(jìn)行調(diào)控的重要通路。多種惡性腫瘤中，都可發(fā)現(xiàn)Notch信號(hào)通路調(diào)節(jié)異常。通過小RNA或γ分泌酶抑制劑技術(shù)阻斷Notch1的活化，可抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。多項(xiàng)研究[6-8]表明，在非小細(xì)胞肺癌組織中存在Notch1蛋白高表達(dá)，并認(rèn)為Notch1的高表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生及預(yù)后密切相關(guān)。

Notch信號(hào)通路可作用于肝內(nèi)外膽管形態(tài)發(fā)育、肝內(nèi)血管生成和肝細(xì)胞發(fā)育、再生等過程，同時(shí)可促進(jìn)肝癌的發(fā)生和演變[9]。Notch1表達(dá)量在肝癌組織中明顯高于正常和癌旁組織，且其與腫瘤的靜脈侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤分化密切相關(guān)。同時(shí)，研究[10-11]顯示，肝癌組織中Notch 3 和Notch 4表達(dá)量上調(diào)，而肝炎組織和正常肝組織中未檢測(cè)到其表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)通過γ分泌酶抑制劑MW167處理正常培養(yǎng)的HepG2細(xì)胞，結(jié)果顯示，MW167可部分阻斷Notch信號(hào)通路，并可促進(jìn)HepG2細(xì)胞的增殖。由此可知，Notch在肝癌中發(fā)揮抑癌作用。這與先前研究結(jié)果一致。還有專家研究[12]表明, Notch信號(hào)在體外和體內(nèi)均能抑制腫瘤的生長(zhǎng)，并且可能與肝癌細(xì)胞凋亡和周期停滯相關(guān)。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，HepG2細(xì)胞中可檢測(cè)到Notch1～4蛋白和mRNA的表達(dá)，MW167處理可降低HES1 mRNA表達(dá)，MW167處理可促進(jìn)細(xì)胞的增殖。

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[責(zé)任編輯時(shí)紅]

TheinfluenceofblockingNotchsignalingpathwaybyγ-secretaseinhibitoronproliferationofHepG2cells

MENG Jiming1, TANG Hongna1, LIU Xiaoming1, WANG Chaoyang1,2, REN Xuequn

1. Department of Surgery, Huaihe Hospital of Henan University, Henan Kaifeng 475000, China; 2. Center for Evidence-Based Medicine, Henan University, Henan Kaifeng 475000, China; 3. Center for Translational Medicine, Huaihe Hospital of Henan University, Henan Kaifeng 475000, China.

R73-3

A

1672-7606(2017)03-0187-04

2016-11-17

孟繼明(1971- )，男，河南睢縣人，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，研究方向：普外科疾病的診斷與治療。