Cyclin D1 siRNA轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞的增殖、凋亡變化及其機(jī)制

張弘英，胡利琳，元文峰，丁浩

(1南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院，南昌330006；2南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院；3江西省樂(lè)安縣人民醫(yī)院344300)

Cyclin D1 siRNA轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞的增殖、凋亡變化及其機(jī)制

張弘英1，胡利琳2，元文峰3，丁浩1

(1南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院，南昌330006；2南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院；3江西省樂(lè)安縣人民醫(yī)院344300)

目的觀察Cyclin D1 siRNA轉(zhuǎn)染的人肝癌細(xì)胞增殖、凋亡變化，并探討其機(jī)制。方法培養(yǎng)人肝癌細(xì)胞株Hep3B，將細(xì)胞分為空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組。陰性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組分別通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染NC siRNA和Cyclin D1 siRNA，轉(zhuǎn)染48 h后收獲細(xì)胞。采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力；流式細(xì)胞儀觀察凋亡細(xì)胞并計(jì)算細(xì)胞凋亡率；免疫組化法檢測(cè)各組細(xì)胞中的Caspase-3蛋白；采用RT-PCR法檢測(cè)各組細(xì)胞中的乙型肝炎病毒x蛋白(HBx)、著色性干皮病基因蛋白D(XPD)、Bcl-2、Bax mRNA；Western blotting法檢測(cè)各組細(xì)胞中的HBx、XPD、Bcl-2、Bax蛋白。結(jié)果與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖能力減弱、凋亡率升高、Caspase-3相對(duì)表達(dá)量增高(P均<0.01)。與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組HBx、Bcl-2 mRNA及蛋白表達(dá)下調(diào)，XPD、Bax mRNA及蛋白表達(dá)上調(diào)(P均<0.01)。結(jié)論Cyclin D1 siRNA轉(zhuǎn)染的人肝癌細(xì)胞增殖受到抑制、凋亡增多，其機(jī)制可能與HBx、Bcl-2表達(dá)下調(diào)及XPD、Bax表達(dá)上調(diào)有關(guān)。

細(xì)胞周期蛋白D1；肝細(xì)胞癌；細(xì)胞增殖；細(xì)胞凋亡；人剪切修復(fù)基因

Abstract:ObjectiveTo observe the changes of proliferation and apoptosis of human hepatocellular cells transfected with Cyclin D1 siRNA, and to explore the mechanism.MethodsThe cultured human hepatoma cell line Hep3B was divided into the blank control group, negative control group, and experimental group. The negative control group and the experimental group were transfected with NC siRNA and Cyclin D1 siRNA by liposomes, and the cells were harvested after 48 h. MTT was used to detect cell proliferation; the flow cytometry was used to observe apoptotic cells and we calculated apoptosis rate; the Caspase-3 protein in cells of each group was detected by immunohistochemistry; the mRNA and protein expression levels of hepatitis B virus x protein (HBx), xeroderma pigmentosum D (XPD), Bcl-2, and Bax in cells of each group were detected by RT-PCR and Western blotting, respectively.ResultsCompared with the blank control group and the negative control group, the cell proliferation ability of the experimental group decreased, the apoptosis rate increased, and the relative expression of Caspase-3 increased (allP<0.01). Compared with the blank control group and the negative control group, the mRNA and protein expression levels of HBx and Bcl-2 in the experimental group were down-regulated, while those of XPD and Bax were up-regulated (allP<0.01).ConclusionThe proliferation of human hepatoma cells transfected with Cyclin D1 siRNA is inhibited and the apoptosis increases, and the mechanism may be related to the down-regulation of HBx and Bcl-2 expression, and up-regulation of XPD and Bax expression.

Keywords: Cyclin D1; hepatocellular carcinoma; cell proliferation; apoptosis; human shear repair genes

肝細(xì)胞癌(HCC)是全世界最普遍的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和病死率均較高[1]。HCC的發(fā)生發(fā)展是十分復(fù)雜的過(guò)程，不僅與抑癌基因失活和癌基因或癌相關(guān)基因激活有關(guān)，還涉及多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路功能失調(diào)[2]。長(zhǎng)期慢性乙型肝炎(乙肝)病毒(HBV)感染是導(dǎo)致HCC發(fā)病的重要原因之一，這一過(guò)程可能與乙肝病毒x蛋白(HBx)對(duì)肝細(xì)胞周期與凋亡的影響有關(guān)[3]。HBx蛋白可通過(guò)反式激活細(xì)胞啟動(dòng)子和增強(qiáng)子來(lái)增強(qiáng)病毒基因的表達(dá)和復(fù)制，這有助于病毒的持續(xù)性感染[4]。目前尚無(wú)效果顯著的方法用于治療HBV相關(guān)HCC。Cyclin D1是調(diào)控細(xì)胞周期G1期(DNA合成前期)的關(guān)鍵蛋白，現(xiàn)已證實(shí)Cyclin D1與包括肝癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[5]。本研究將靶向Cyclin D1基因的小干擾RNA(siRNA)轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞株Hep3B細(xì)胞，觀察Cyclin D1 siRNA轉(zhuǎn)染的人肝癌細(xì)胞增殖、凋亡變化，并探討其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料 人肝癌細(xì)胞Hep3B由本實(shí)驗(yàn)室保存。MEM培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)自Gibco公司。陰性對(duì)照siRNA(NC siRNA)和Cyclin D1 siRNA均由上海吉?jiǎng)P公司合成，在前期實(shí)驗(yàn)中已證實(shí)Cyclin D1 siRNA序列(5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′)具有沉默效果。NC siRNA序列為5′-ACAAACAGATCATCCGCAA-3′，Cyclin D1 siRNA序列為5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′。MTT試劑購(gòu)自Solarbio公司。Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自杭州聯(lián)科生物公司。TRIzol及脂質(zhì)體LipofectamineTM2 000均購(gòu)自Invitrogen公司。Caspase-3 一抗購(gòu)自Abcam公司。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Fermentas公司。2×濃縮PCR擴(kuò)增預(yù)混液購(gòu)自天根生物技術(shù)有限公司。所用引物由Generay Biotech公司合成?？偟鞍滋崛≡噭┖匈?gòu)自北京普利萊基因技術(shù)有限公司。Cyclin D1、HBx、Bcl-2、XPD、Bax、β-actin的一抗購(gòu)自Santa Cruz公司。作為二抗的HRP-Goat anti Mouse IgG購(gòu)自北京中杉金橋公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及Cyclin D1 siRNA轉(zhuǎn)染 用含雙抗(100 μg/mL的鏈霉素和100 U/mL的青霉素)、10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)Hep3B細(xì)胞，然后將裝有Hep3B細(xì)胞的培養(yǎng)瓶置于5% CO2、37 ℃恒溫孵箱內(nèi)培養(yǎng)。往6孔板內(nèi)平鋪細(xì)胞，控制細(xì)胞密度為1×106/孔，24 h后在顯微鏡下觀察到Hep3B細(xì)胞融合率約為90%。將Hep3B細(xì)胞分為空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組。陰性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組分別通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染NC siRNA和Cyclin D1 siRNA。實(shí)驗(yàn)每組重復(fù)6次。siRNA濃度為100 nmol/L，脂質(zhì)體每孔5 μL。轉(zhuǎn)染48 h后收獲細(xì)胞。經(jīng)RT-PCR法測(cè)得空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組Cyclin D1 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為3.53±0.99、3.64±1.37、0.99±0.62，經(jīng)Western blotting法測(cè)得三組Cyclin D1蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為1.56±0.29、1.62±0.49、0.18±0.12，實(shí)驗(yàn)組Cyclin D1 mRNA及蛋白相對(duì)表達(dá)量均低于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組(P均<0.05)，說(shuō)明Cyclin D1 siRNA轉(zhuǎn)染成功，實(shí)驗(yàn)組Cyclin D1表達(dá)下調(diào)。

1.3 細(xì)胞增殖能力檢測(cè) 將人肝癌Hep3B細(xì)胞種植于96孔板內(nèi)，留出空白凋零孔，不添加細(xì)胞。每孔內(nèi)均加入15 mg/mL的MTT溶液20 μL，孵育4 h后棄去上清，再分別往每孔內(nèi)加入二甲基亞楓(DMSO)150 μL，振蕩10 min。放入酶聯(lián)免疫監(jiān)測(cè)儀(Labststems，芬蘭)，波長(zhǎng)設(shè)置為492 nm，測(cè)定96孔板內(nèi)各孔的光密度值(OD值)，以此反映細(xì)胞增殖能力。

1.4 細(xì)胞凋亡率測(cè)算 用胰酶消化并收集空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞。PBS溶液分別洗滌細(xì)胞2次，用Binding Buffer緩沖液(含Ca2+的緩沖液)500 μL進(jìn)行懸浮。分別往各組細(xì)胞中加入PI、Annexin V-FITC染色體熒光各5 μL。流式細(xì)胞儀觀察凋亡細(xì)胞，計(jì)算細(xì)胞凋亡率。

1.5 各組細(xì)胞中Caspase-3蛋白檢測(cè) 采用免疫組化法。先將收獲的細(xì)胞固定，石蠟包埋，切片，脫蠟。用3%的過(guò)氧化氫阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，然后用Caspase-3的一抗(工作濃度為1∶100)孵育，再用相應(yīng)的二抗孵育。切片先后用二氨基聯(lián)苯胺、蘇木精染色，顯微鏡下觀察，Caspase-3陽(yáng)性為細(xì)胞呈棕黃色或棕褐色染色。根據(jù)染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞百分比判定結(jié)果[6]：黑褐色或棕褐色計(jì)3分，棕黃色或深黃色計(jì)2分，淡黃色計(jì)1分，無(wú)明顯著色計(jì)0分；陽(yáng)性細(xì)胞百分比>75%計(jì)4分，>50%～75%計(jì)3分，>25%～50%計(jì)2分，>5%～25%計(jì)1分，0～5%計(jì)0分；上述兩項(xiàng)得分相乘，1～12為Caspase-3蛋白表達(dá)陽(yáng)性。

1.6 各組細(xì)胞中HBx、XPD、Bcl-2、Bax mRNA及蛋白檢測(cè)

1.6.1 HBx、XPD、Bcl-2、Bax mRNA檢測(cè) 采用RT-PCR法。HBx基因上游引物序列為5′-CACTTCGCCTCACCTCTG-3′，下游引物序列為5′-TCGGTCGTTGACATTGCT-3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度112 bp；Bcl-2基因上游引物序列為5′-AAGCCGGCGACGACTTCT-3′，下游引物序列為5′-GGTGCCGGTTCAGGTACTCA-3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度258 bp；XPD基因上游引物序列為5′-TCTGCCTCTGCCCTATGAT-3′，下游引物序列為5′-GGTGCCGGTTCAGGTACTCA-3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度363 bp；Bax基因上游引物序列為5′-GGATGCGTCCACCAAGAA-3′，下游引物序列為5′-GCACTCCCGCCACAAAGA-3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度386 bp；內(nèi)參β-actin基因上游引物序列為5′-CGGGAAATCGTGCGTGAC-3′，下游引物序列為5′-TGGAAGGTGGACAGCGAGG-3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度434 bp。PCR反應(yīng)體系：上下游引物各1 μL，cDNA 500 ng，2×濃縮的PCR擴(kuò)增預(yù)混液12.5 μL，然后在反應(yīng)體系內(nèi)添加去離子水至體系最終體積為25 μL。PCR反應(yīng)擴(kuò)增條件：預(yù)變性94 ℃ 5 min，1個(gè)循環(huán)；DNA變性94 ℃ 40 s、引物退火55 ℃ 40 s、DNA聚合酶延伸72 ℃ 55 s，35個(gè)循環(huán)；最終延伸72 ℃ 7 min，1個(gè)循環(huán)。PCR反應(yīng)結(jié)束后，取PCR產(chǎn)物5 μL進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，后置于凝膠成像儀下觀察并拍照。用Bland Leader3.00凝膠電泳圖像分析軟件分析結(jié)果，以目的基因/β-actin比值代表目的基因相對(duì)表達(dá)量。

1.6.2 HBx、XPD、Bcl-2、Bax蛋白檢測(cè) 用RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度，然后取蛋白20 μg進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。將凝膠上分離到的蛋白條帶通過(guò)轉(zhuǎn)移電泳方式轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，3% BSA封閉膜，放于4 ℃環(huán)境過(guò)夜，然后分別用非標(biāo)記一抗(工作濃度1∶200)及辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗進(jìn)行孵育。使用DAB顯色試劑顯色1～30 min后照相。采用Quantity One4.62分析結(jié)果。以目的基因/β-actin比值表示目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞增殖能力、凋亡率及Caspase-3蛋白表達(dá)比較 與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖能力減弱、凋亡率升高、Caspase-3相對(duì)表達(dá)量增高(P均<0.01)。詳見(jiàn)表1。

表1 各組細(xì)胞增殖能力、細(xì)胞凋亡率及Caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量

注：與實(shí)驗(yàn)組相比，*P<0.01。

2.2 各組細(xì)胞中HBx、XPD、Bcl-2、Bax mRNA及蛋白表達(dá)比較 與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組HBx、Bcl-2 mRNA及蛋白表達(dá)下調(diào)，XPD、Bax mRNA及蛋白表達(dá)上調(diào)(P均<0.05)。詳見(jiàn)表2。

表2 各組HBx、XPD、Bcl-2、Bax基的mRNA和蛋白表達(dá)比較

注：與實(shí)驗(yàn)組相比，*P<0.01，#P<0.05。

3 討論

HCC是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一。我國(guó)乙肝的高發(fā)，使肝癌患者占全世界較大比例[7]。HBx具有多種生物學(xué)功能，能夠影響宿主細(xì)胞基因表達(dá)，從而調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞的增殖與分化、影響細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等。HBV相關(guān)HCC的發(fā)生可能與HBx對(duì)肝細(xì)胞分裂周期與凋亡的影響有關(guān)[8]。HBV相關(guān)HCC目前尚無(wú)特效治療手段。基因治療具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，可能是HBV相關(guān)HCC治療的新方向。

生物體正常的生存、繁殖與細(xì)胞周期的準(zhǔn)確調(diào)控具有密不可分的關(guān)系。細(xì)胞周期蛋白對(duì)細(xì)胞周期的各時(shí)相均起調(diào)控作用，其中參與細(xì)胞周期調(diào)控的主要因子是Cyclin。細(xì)胞周期中G1期的啟動(dòng)是細(xì)胞周期的關(guān)鍵，而調(diào)控G1期的關(guān)鍵蛋白之一是Cyclin D1。Cyclin D1含295個(gè)氨基酸，由染色體11q13上的基因編碼[9]。動(dòng)物模型和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)均表明，Cyclin D1蛋白過(guò)度表達(dá)可使細(xì)胞G1期縮短，對(duì)分裂原的依賴性減弱[10]。正常細(xì)胞周期中，Cyclin D1僅在G期呈低水平或恒定表達(dá)，而在腫瘤細(xì)胞中Cyclin D1呈過(guò)度表達(dá)，可縮短G1期，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞過(guò)度增殖?，F(xiàn)已證實(shí)許多惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展與Cyclin D1過(guò)度表達(dá)有關(guān)[11]。肝癌的發(fā)病同樣與G/S期檢測(cè)點(diǎn)缺陷有關(guān)[12]。且Cyclin D1高表達(dá)的肝癌患者預(yù)后不良，而Cyclin D1下調(diào)能促進(jìn)肝癌細(xì)胞株Huh7細(xì)胞凋亡，使其停滯在G1期[13]。

本研究將靶向Cyclin D1基因的siRNA轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞株Hep3B構(gòu)建Cyclin D1表達(dá)下調(diào)的肝癌細(xì)胞模型，觀察Cyclin D1表達(dá)下調(diào)對(duì)人肝癌細(xì)胞增殖、凋亡的影響。本研究結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖能力減弱、凋亡率升高、Caspase-3相對(duì)表達(dá)量增高。Caspase-3是細(xì)胞凋亡過(guò)程中最主要的終末剪切酶，其活性增強(qiáng)意味著凋亡被誘導(dǎo)[14]。由此可見(jiàn)，Cyclin D1基因表達(dá)下調(diào)能抑制肝癌細(xì)胞的增殖并促進(jìn)其凋亡。

HBx能整合進(jìn)入宿主肝細(xì)胞的DNA內(nèi)，從而影響肝細(xì)胞的DNA轉(zhuǎn)錄和蛋白翻譯，繼而影響肝細(xì)胞的增殖與分化，影響細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路功能等，是HBV致肝癌的重要因素之一[15, 16]。Hep3B細(xì)胞是能表達(dá)HBx的人肝癌細(xì)胞株。本研究發(fā)現(xiàn)，Cyclin D1基因表達(dá)下調(diào)能抑制HBx的表達(dá)，提示下調(diào)Cyclin D1基因表達(dá)也許能降低感染HBV肝細(xì)胞惡變的可能性。XPD是轉(zhuǎn)錄因子ⅡH組成成分之一。許多研究發(fā)現(xiàn)XPD參與核苷酸的損傷修復(fù)過(guò)程，并影響癌基因和抑癌基因的表達(dá)，與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)[17,18]。本課題組前期研究[19]也證實(shí)，XPD基因可促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡并抑制肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。Bcl-2、Bax同屬Bcl-2基因家族，而前者是原癌基因，后者是抑癌基因。Bax/Bcl-2可調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖與凋亡之間的平衡[20]，Bcl-2/Bax比值越大，說(shuō)明腫瘤細(xì)胞的增殖能力越強(qiáng)、凋亡越少。本研究結(jié)果顯示，Cyclin D1基因表達(dá)下調(diào)能抑制肝癌細(xì)胞中原癌基因Bcl-2表達(dá)，能上調(diào)抑癌基因XPD、Bax的表達(dá)。這些結(jié)果進(jìn)一步提示，Cyclin D1基因表達(dá)下調(diào)對(duì)肝癌細(xì)胞的增殖抑制、促凋亡作用可能與HBx、Bcl-2表達(dá)下調(diào)和XPD、Bax表達(dá)上調(diào)有關(guān)。

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Changes in proliferation and apoptosis of human hepatocellular carcinoma cells transfected with Cyclin D1 siRNA

ZHANGHongying1,HULilin,YUANWenfeng,DINGHao

(1TheSecondAffiliatedHospitalofNanchangUniversity,Nanchang330006,China)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.35.007

R735.7

A

1002-266X(2017)35-0022-04

2017-06-14)

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81300348)；江西省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(20151BAB205100)。

張弘英(1963-)，女，副主任醫(yī)師，主要從事肝病的研究。E-mail：ladh_2000@163.com

丁浩(1981-)，男，博士學(xué)歷，副主任醫(yī)師，主要從事肝病的研究。E-mail: efydinghao@163.com