實時熒光定量PCR技術(shù)在轉(zhuǎn)基因食品檢測領(lǐng)域中的應用

孫娜+張穎

利用基因工程技術(shù)對基因組的構(gòu)成進行改變，將一些比較優(yōu)良的外源基因?qū)胫参?、動物或者微生物的體內(nèi)，使其遺傳物質(zhì)、性狀、營養(yǎng)價值或者品質(zhì)向人們所需要的目標進行改變，從而獲得產(chǎn)品或者以其為原材料進行加工后得到的食品，稱為轉(zhuǎn)基因食品。目前，我國在轉(zhuǎn)基因作物種植方面也加大了力度，轉(zhuǎn)基因作物的種植項目已經(jīng)增加至25個，但是轉(zhuǎn)基因食品在安全方面的問題還沒有被人們所接受，因此，必須要加強對轉(zhuǎn)基因食品進行有效的標識管理，嚴格控制外源基因的含量，但是這些都需要準確有效的基因檢測技術(shù)。目前，在轉(zhuǎn)基因食品檢測方面的檢測技術(shù)主要有兩方面，分別是對外源基因表達產(chǎn)物進行檢測和直接檢測外源基因，其中對外源基因序列的檢測是目前比較常見的檢測方式，主要的方法是PCR方法，這個方法是以核心作為基礎。隨著科學技術(shù)水平的不斷提高，實時熒光定量PCR 技術(shù)也隨之出現(xiàn)，其結(jié)合PCR技術(shù)和探針雜交技術(shù)的優(yōu)點，具有很高的靈敏度，是傳統(tǒng)PCR技術(shù)的100倍左右，其檢測原理是通過探測PCR工程中熒光信號的變化情況來定量DNA模板量。

實時熒光定量PCR技術(shù)的涵義

實時熒光定量PCR技術(shù)是指在PCR反應體系中加入熒光集團，利用熒光信號的變化來對整個PCR的反應過程進行實時監(jiān)控，根據(jù)熒光信號的強弱來及時獲得特異性擴增產(chǎn)物的量，然后根據(jù)標準曲線來進行定量的檢測方法。實時熒光定量PCR技術(shù)可以對DNA模板進行定量分析，具有靈敏度高、特異性和可靠性強、污染小、準確率高等優(yōu)點。

實時熒光定量PCR技術(shù)的基本原理。在檢測過程中，隨著PCR反應循環(huán)數(shù)增加，反應過程所產(chǎn)生的DNA拷貝數(shù)也不斷增加指數(shù)方式增加，然后逐漸轉(zhuǎn)入平臺期，這個時候?qū)崟r熒光定量PCR就會對整個PCR反應過程進行實時檢測，熒光信息的變化情況經(jīng)過電腦會自動繪成一條曲線，然后根據(jù)曲線中的指數(shù)期內(nèi)的節(jié)點的PCR產(chǎn)物的量來判斷DNA模板的含量。

熒光閾值是以PCR 反應前15個循環(huán)的熒光信號作為熒光本底信號，熒光閾值的缺省設置是3～15個循環(huán)的熒光信號標準差的10倍，一般要判斷熒光信號是否可信就要看測出的熒光信號是不是在熒光閾值以上，這樣可以定義一個樣本的Ct值，Ct指在PCR循環(huán)過程中，熒光信號開始由本底進入指數(shù)增長階段的拐點所對應的循環(huán)次數(shù)，也就是每個反應管內(nèi)的熒光信號達到設定的閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。研究表明，每個模板的Ct值與該模板起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系， 起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標準樣品可作出標準曲線，因此，只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù)。

常用方法。實時熒光定量PCR技術(shù)在化學原理上可以分為兩類，分別是非探針類和探針類；其中探針類是利用探針來指示擴增產(chǎn)物的增加，常用的方法有TaqMan探針法；非探針類是利用熒光染料來對擴增產(chǎn)物的增加進行實時監(jiān)控，常用的有SYBR GreenⅠ檢測法。

實時熒光定量PCR技術(shù)在轉(zhuǎn)基因食品領(lǐng)域中的應用

定量分析策略。在實時熒光定量PCR技術(shù)中，模板定量方法主要有兩種，分別是相對定量和絕對定量。（1）相對定量。主要是指在一定的樣品中靶序列相對于另一參照序列的量的變化，相對定量又分為比較Ct值法和標準曲線法，主要是依據(jù)相對定量方法是否需要建立標準曲線來區(qū)分的。比較Ct值法是不需要建立標準曲線的，但是它的前提是以靶基因和內(nèi)源控制物的擴增效率保持基本一致，效率的偏移將影響實際拷貝數(shù)的估計。這種方法計算出的相對定量結(jié)果通常比實際結(jié)果要高，誤差較大。標準曲線法首先要準備好標準品，其中包括目的的基因和內(nèi)參基因的標準品，然后根據(jù)設定的梯度進行準確的配比稀釋，一般是以1/10的梯度倍比進行稀釋，然后制成標準曲線，通過標準曲線得到目的基因和內(nèi)參基因的值，并將這兩個基因的比值作為定量的最后結(jié)果。這種方法所得出的結(jié)果根據(jù)某個參照物的量而言的，且這種方法制作起來比較簡易，只需要知道標準品的稀釋倍數(shù)就可以了。（2）絕對定量。主要是指已知的標準曲線來推算出未出的樣本的定量。在使用這個方法時首先要克隆目的基因和參照基因的擴增片段，然后構(gòu)建體外轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)，通過體外轉(zhuǎn)錄獲得已知拷貝數(shù)的標準品來構(gòu)建標準曲線，這種方法具有 穩(wěn)定、準確的優(yōu)點。另外，如果要定量多種目的基因，就需要針對不同的目的基因制備不同的定量標準品，但是這樣會影響到定量的效率。

選擇目標序列。在轉(zhuǎn)基因成本定量分析中通常選擇轉(zhuǎn)基因生物基因組中的外源序列作為目標序列，其中包括有啟動子、終止子、目的基因等。根據(jù)檢測的外源目標序列的不同分類，轉(zhuǎn)基因食品在應用實時熒光定量PCR檢測技術(shù)進行檢測時有四種序列的檢測，分別是通用序列檢測、結(jié)構(gòu)特異性序列檢測、基因特異性序列檢測和品系特異性序列檢測。

通用序列檢測包括有調(diào)控基礎序列和抗性標記基因序列，最終檢測特定轉(zhuǎn)化的靶基因。例如針對轉(zhuǎn)基因小麥品系中通用的ubiq-uitin啟動子、NOS終止子以及標記基因bar基因進行定性篩選檢測，同時用已知為單拷貝的Wx012基因作為內(nèi)源特異參照基因，繪制內(nèi)源基因和外源基因的標準曲線，建立了轉(zhuǎn)基因小麥的RTQ-PCR 檢測方法。由于相同的通用元件和標記基因被常用語多種轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的研究和生產(chǎn)中，一般只能用于初步的篩選。

結(jié)構(gòu)特異性序列是指在插入載體的外源基因間的2個元件的連接區(qū)域序列，這種方法具有相對較高的特異性，因而被廣泛應用與轉(zhuǎn)基因食品的檢測中。但是在相同的轉(zhuǎn)基因外源表達載體在轉(zhuǎn)化過程中，可能會出現(xiàn)1個或者2個或者對個拷貝的形式插入不同或者相同的植物基因組中，從而形成不同的轉(zhuǎn)基因品系，這些轉(zhuǎn)基因品系都具有相同的農(nóng)藝性狀，所以說，這種方法在具有相同農(nóng)藝性狀的轉(zhuǎn)基因植物和不同培育品系兩者之間不能夠得到很好區(qū)分。

基因特異性序列主要是指插入的外源特異性基礎的內(nèi)部的一段序列，這段序列可以是天然來源的基因序列，也可以是人工改進的序列。但是，由于相同的外源基因可能在相同或不同的植物中表達會形成新的具有相同農(nóng)藝性狀的品系或新的轉(zhuǎn)基因植物，因此基因特異性檢測方法在檢測具有相同農(nóng)藝性狀的轉(zhuǎn)基因植物及其品系時并不適用。

品系特異性序列是指插入的外源序列與植物基因組連接的邊界序列。這種檢測方法具有較高的特異性和準確性，主要是因為每一個轉(zhuǎn)基因植物品系都具有特異的外源插入載體與植物基因組的連接區(qū)序列，且連接區(qū)序列是單拷貝。這種檢測方法目前在轉(zhuǎn)基因食品檢測中的應用研究是最受關(guān)注和重視的，大多數(shù)的商品化轉(zhuǎn)基因植物都建立了品系特異性檢測方法，如轉(zhuǎn)基因大豆品系（DP-305423-1[18]、GTS40-3-2[19]、DP-356043-5[20]）。

實時熒光定量PCR 技術(shù)在轉(zhuǎn)基因食品檢測領(lǐng)域中的問題與展望

實時熒光定量PCR技術(shù)的出現(xiàn)和應用解決了轉(zhuǎn)基因食品檢測中對于靈敏、準確和快速的要求，實時熒光定量PCR技術(shù)突破了傳統(tǒng)檢測技術(shù)中智能重點檢測的局限，采用了全封閉管分析、利用電腦分析軟件對PCR擴增產(chǎn)物進行實時監(jiān)測和自動定量，從而提高了檢測的靈敏度和精密度；實時熒光定量PCR技術(shù)在定量動態(tài)范圍內(nèi)高達5個數(shù)量級，并且得到的結(jié)果的重現(xiàn)性較好。由于實時熒光定量PCR技術(shù)中熒光探針針對靶序列設計，具有高特異性，可以快速進行定量PCR檢測。但是實時熒光PCR技術(shù)在實際應用中也存在一些問題，如：在檢測的過程中需要特殊的熱循環(huán)儀器和試劑，導致檢測的成本較高；同時在檢測過程中會受到很多因素的影響，可能會導致定量結(jié)果出現(xiàn)誤差較大的情況，如探針比例、同源和異源DNA背景、dNTP的濃度等。因此，針對這些問題，在實時熒光定量PCR技術(shù)的操作過程中必須充分驗證所設計引物的特異性和優(yōu)化反應條件。隨著轉(zhuǎn)基因檢測技術(shù)的不斷進步，在提高實時熒光定量PCR技術(shù)的靈敏度和重復性方面有多種技術(shù)并取得了明顯的效果，從而使樣品的制備更加簡單和程序化。

隨著我國基因工程技術(shù)的不斷發(fā)展，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中也得到了廣泛的應用，越來越多的改良特征轉(zhuǎn)基因食品也隨之出現(xiàn)并得到迅猛的發(fā)展，但是轉(zhuǎn)基因食品的安全性還是目前我們所擔憂的問題。為了保證轉(zhuǎn)基因食品的安全性，制定了轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品標簽制度，建立快速、準確、高通量的定量檢測方法顯得非常必要，是保證轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品標簽制度順利實施的基礎，因而具備這些特點的實時熒光定量PCR 技術(shù)在轉(zhuǎn)基因食品檢測領(lǐng)域中的應用將會得到更大范圍的普及。

實現(xiàn)轉(zhuǎn)基因食品實時熒光定量檢測首要面臨的問題是構(gòu)建相應品系的質(zhì)粒標準品。在傳統(tǒng)的標準品構(gòu)建過程中，主要是以轉(zhuǎn)基因材料與其對應的非轉(zhuǎn)基因材料按一定的質(zhì)量比例配制而成，從而獲得一系列質(zhì)量分數(shù)的標準品，再建立標準曲線來對樣品進行相對定量檢測，這種方法具有一定的局限性，除了目前市場上常用的轉(zhuǎn)基因品系外，許多轉(zhuǎn)基因品系的標準樣品還難以得到。而隨著轉(zhuǎn)基因植物品系的日益增多，對于許多新增的轉(zhuǎn)基因品系的標準樣品的獲得將更加困難，那么對于這些品種的檢測就更加難以實現(xiàn)，使這些轉(zhuǎn)基因食品的安全得不到保障，同時也在很大程度上限制了轉(zhuǎn)基因生物研究和監(jiān)管工作的發(fā)展。

此外，雖然實時熒光定量PCR 技術(shù)在轉(zhuǎn)基因食品檢測上突破了從定性到定量的界限，實現(xiàn)了精確定量到絕對定量的轉(zhuǎn)變，但是隨著全球生物技術(shù)的發(fā)展，很多復合型轉(zhuǎn)基因植物也出現(xiàn)了，新的轉(zhuǎn)基因植物趨向于復合基因改造，如以8 個基因為基礎的Smartstax就是一種新型的復合性狀生物技術(shù)玉米產(chǎn)品，是迄今最先進的獲批的生物技術(shù)作物。同時，轉(zhuǎn)基因食品的生產(chǎn)工藝也在逐漸改善和優(yōu)化，食品加工過程原料中的轉(zhuǎn)基因序列遭到嚴重破壞。這些都對實時熒光定量PCR檢測技術(shù)提出了更高的要求和標準。

綜上所述，實時熒光定量PCR技術(shù)是轉(zhuǎn)基因食品檢測領(lǐng)域的一種突破，可以更加快速、靈敏、準確的對轉(zhuǎn)基因食品進行檢測，提高轉(zhuǎn)基因食品的安全性，在轉(zhuǎn)基因食品檢測領(lǐng)域中具有良好的應用和發(fā)展前景。