微生物代謝路徑的優(yōu)化與調(diào)控

陳修來，高 聰，劉 佳，羅秋玲，劉立明

(1．江南大學 食品科學與技術(shù)國家重點實驗室，江蘇 無錫 214122;2．江南大學 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122;3．江南大學 食品微生物制造工程實驗室，江蘇 無錫 214122)

微生物代謝路徑的優(yōu)化與調(diào)控

陳修來1，2，3，高 聰1，2，3，劉 佳1，2，3，羅秋玲1，2，3，劉立明1，2，3

(1．江南大學 食品科學與技術(shù)國家重點實驗室，江蘇 無錫 214122;2．江南大學 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122;3．江南大學 食品微生物制造工程實驗室，江蘇 無錫 214122)

代謝路徑平衡對化學品、藥品和生物燃料的生產(chǎn)具有重要的作用。為了滿足工業(yè)化生產(chǎn)的需求，維持代謝路徑最優(yōu)平衡是實現(xiàn)代謝流高效化導(dǎo)向目標代謝產(chǎn)物的必要手段。從DNA、RNA、蛋白質(zhì)和代謝物四個水平，分析歸納了微生物代謝路徑的優(yōu)化與調(diào)控策略，并展望了代謝路徑平衡進一步精深調(diào)控的發(fā)展方向。

代謝路徑;路徑優(yōu)化;代謝工程;合成生物學

隨著石油資源的日益枯竭，以石油為基礎(chǔ)的化工產(chǎn)業(yè)面臨嚴重的挑戰(zhàn)。微生物發(fā)酵法能夠以廉價可再生碳源為底物生產(chǎn)多種化學品，具有可持續(xù)、綠色環(huán)保等優(yōu)點。因此，微生物發(fā)酵法成為替代傳統(tǒng)石油化工方法的重要技術(shù)手段［1-2］。目前，微生物發(fā)酵法已經(jīng)用于多種同源及異源代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)［3］，包括：生物柴油、大宗化學品、精細化學品、藥物和營養(yǎng)品等，有效地實現(xiàn)了高產(chǎn)量、高得率和高生產(chǎn)強度的目標。

代謝工程通過對底盤微生物進行遺傳改造，重新配置細胞的生化代謝網(wǎng)絡(luò)，構(gòu)建高效的細胞工廠，將可再生原料轉(zhuǎn)化為高附加值化合物。目前，代謝工程已經(jīng)成功應(yīng)用于多種生物基產(chǎn)品的工業(yè)化生產(chǎn)，如：青蒿素［4］和 1，4-丁二醇［5］等。然而，通過操縱內(nèi)源基因和引入異源途徑改造微生物固有代謝網(wǎng)絡(luò)，通常會導(dǎo)致代謝途徑通量不平衡，引起中間代謝物過量積累，從而抑制胞內(nèi)代謝活動，降低菌體生理活性和發(fā)酵性能［6］。Wu等［7］在代謝工程改造大腸桿菌(Escherichia coli)BL21(DE3)生產(chǎn)白藜蘆醇的過程中，通過胞內(nèi)表達源于黏紅酵母(Rhodotorul glutinis)的酪氨酸解氨酶(TAL)、香芹(Petroselinum crispum)的4-香豆酰輔酶 A連接酶(Pc4CL)、車軸草根瘤菌(Rhizobium trifolii)的丙二酸酯合成酶(MatB)/丙二酸載體蛋白(MatC)和葡萄(Vitis vinifera)的芪合酶(STS)，白藜蘆醇的產(chǎn)量僅僅達到3．03 mg/L，主要原因在于中間代謝物香豆酰輔酶A的過量積累對菌株具有毒性［8］。為了有效降低香豆酰輔酶A的毒性，進一步提高白藜蘆醇的產(chǎn)量，可以將白藜蘆醇合成途徑分成3個模塊，并精細化調(diào)控3個模塊中基因表達水平，有效地實現(xiàn)了代謝途徑平衡，最終使得白藜蘆醇產(chǎn)量達到35．02 mg/L［7］。

因此，解決代謝失衡問題，可以有效改善微生物細胞生長狀況、代謝物產(chǎn)量及產(chǎn)率。其中，找到最佳途徑平衡點是微生物代謝工程改造過程中的最重要一步?；诖耍揪C述中，筆者從 DNA、RNA、蛋白質(zhì)和代謝物四個水平 (圖1)詳細論述代謝路徑優(yōu)化與調(diào)控相關(guān)的現(xiàn)代生物技術(shù)，并展望代謝路徑平衡進一步精深調(diào)控的發(fā)展方向。

圖1 微生物代謝路徑的優(yōu)化策略Fig.1 Strategies for optimization of microbial metabolic pathways

1 基于DNA水平的代謝路徑優(yōu)化

啟動子工程，借助基因表達元件，調(diào)節(jié)路徑酶的差異表達，實現(xiàn)代謝流平衡，從而提高細胞工廠的生產(chǎn)效率。啟動子工程常用的路徑優(yōu)化控制策略：1)構(gòu)建啟動子文庫［9］。借助iGEM、PlantCARE等在線分析工具，設(shè)計不同強度的合成啟動子，優(yōu)化代謝路徑關(guān)鍵基因轉(zhuǎn)錄起始效率。該方法已經(jīng)成功用于雙乙酰(圖 2)的生產(chǎn)［10］。2) 替換啟動子［11］。利用iGEM、CellML等軟件，選擇合適強度的啟動子替換合成路徑中限速酶的自身啟動子，提高代謝路徑限速酶的表達效率。該方法已經(jīng)成功用于L-精氨酸［11］和2，3-丁二醇(圖2)［12］的生產(chǎn)。3)調(diào)控核糖體結(jié)合位點(RBS) 強 度［13］。 利 用 RBS Calculator［14］、RBS Designer［15］等預(yù)測軟件，設(shè)計具有不同翻譯起始速率的RBS，精確控制代謝路徑基因的翻譯效率。該方法已經(jīng)成功用于蝦青素［13］和脂肪酸［16］的生產(chǎn)。4) 合成間隔區(qū)［17］。通過構(gòu)建mRNA二級結(jié)構(gòu)突變庫，借助GeneSplicer和SplicePort等在線工具，預(yù)測和改變RNA酶切割位點，實現(xiàn)多基因路徑間隔區(qū)的組合優(yōu)化。該方法已經(jīng)成功用于甲羥戊酸的生產(chǎn)［17］。

圖2 微生物雙乙酰和2，3-丁二醇的代謝途徑Fig.2 Metabolic pathways for diacetyl and 2，3-butanediol production

2 基于RNA水平的代謝路徑優(yōu)化

在正常條件下，RNA分子可以自組裝成具有不同生理功能的多種二級結(jié)構(gòu)，因此，RNA分子結(jié)構(gòu)被廣泛應(yīng)用于合成生物學的研究領(lǐng)域。其中，典型應(yīng)用是利用合成RNA開關(guān)調(diào)控微生物碳代謝流，實現(xiàn)目標代謝物過量積累。合成RNA開關(guān)常用的路徑優(yōu)化控制策略：1)核酶開關(guān)［18］。通過適配子序列構(gòu)成細胞敏感器(感應(yīng)區(qū))，并借助核酶序列控制胞內(nèi)代謝物的時空波動(執(zhí)行區(qū))，實現(xiàn)目標基因理性控制和代謝物積累量的提高。該方法已經(jīng)成功用于黃嘌呤的生產(chǎn)［18］。2) 核糖開關(guān)［19］。由一類順式編碼調(diào)控 RNA組成，如：腺苷鈷胺素(AdoCbl)、黃素單核苷酸(FMN)、S-腺苷甲硫氨酸和甘氨酸核糖開關(guān)等，通過誘導(dǎo)目的基因轉(zhuǎn)錄終止或者抑制轉(zhuǎn)錄起始來實現(xiàn)對基因表達的調(diào)控。該方法已經(jīng)成功用于維生素B12的生產(chǎn)［20］。3)反義RNA開關(guān)［21］。主要由兩部分組成，包括：識別特定mRNA的結(jié)合區(qū)域和招募輔助蛋白的支架區(qū)域，通過控制mRNA降解速率，反義RNA開關(guān)可以針對多個基因的表達進行多尺度調(diào)控。該方法已經(jīng)成功用于尸胺(圖 3)的生產(chǎn)［21］。

圖3 微生物尸胺的代謝途徑Fig.3 Metabolic pathways for cadaverine production

3 基于蛋白質(zhì)水平的代謝路徑優(yōu)化

蛋白質(zhì)工程是合成生物學的重要組成部分，通過對酶的性質(zhì)和酶的組件進行重新設(shè)計，可以獲得人們所需要的代謝物高效合成路徑［22］。蛋白質(zhì)工程常用的路徑優(yōu)化控制策略：1)提高酶的活性。傳統(tǒng)蛋白質(zhì)表達量的改善方法，易形成包涵體，且容易增加菌體代謝負荷?，F(xiàn)代的方法，通過采用易錯PCR、點突變和交叉延伸技術(shù)，改變底物結(jié)合口袋和修飾蛋白質(zhì)編碼序列，從而實現(xiàn)酶活力的提高［23-24］。該方法已經(jīng)成功用于聚羥基脂肪酸酯［25］和左旋海松二烯［23］等化合物的生產(chǎn)。2)改變底物和產(chǎn)物的特異性。由于天然酶催化底物譜較窄，難以合成許多非天然化合物［24］。另外，某些底物特異性不高的天然酶在催化反應(yīng)中容易催化底物類似物生成副產(chǎn)物，降低產(chǎn)品純度。因此，為了解決這些問題，針對酶的活性位點和結(jié)合口袋采取易錯PCR、定點突變和DNA改組等方式，可以有效地調(diào)整酶底物特異性，實現(xiàn)路徑催化效率的提高［26］。該方法已經(jīng)成功用于L-高丙氨酸［22］和3-脫氫莽草酸(圖4)［27］等化合物的生產(chǎn)。3)修飾調(diào)控元件。在代謝物生產(chǎn)過程中，當代謝物濃度達到一定閾值時，代謝路徑就會啟動負反饋調(diào)控。因此，為了解決反饋抑制，通過對轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白采取化學突變、DNA改組及定點飽和突變等方式，可以降低負反饋調(diào)節(jié)，提高路徑催化效率［28］。該方法已經(jīng)成功用于氨基葡萄糖［29］和 L-苯丙氨酸(圖 4)［30］等化合物的生產(chǎn)。

4 基于代謝物水平的代謝路徑優(yōu)化

在正常狀態(tài)下，微生物體內(nèi)的代謝路徑能夠為細胞生長提供適量的構(gòu)架化合物。然而，合成生物學是將異源代謝路徑引入到微生物中，該路徑超出了微生物自我調(diào)控的范圍，容易引起代謝負荷和代謝不平衡［31］。為了解決此問題，可以通過合成生物學的相關(guān)技術(shù)策略，系統(tǒng)性地優(yōu)化代謝路徑，從而為實現(xiàn)細胞代謝網(wǎng)絡(luò)與代謝物合成的平衡奠定基礎(chǔ)［32］。常用的路徑優(yōu)化控制策略包括：結(jié)構(gòu)生物學、區(qū)間工程和模塊路徑工程等。

4.1 結(jié)構(gòu)生物學

在代謝工程改造的過程中，一方面，代謝中間產(chǎn)物的過量積累會對宿主細胞產(chǎn)生毒性;另一方面，中間代謝物會被競爭途徑消耗，從而降低產(chǎn)物合成效率。為解決這些問題，支架技術(shù)作為一種新興的路徑優(yōu)化策略，能夠在空間上縮短路徑酶的底物傳輸距離，構(gòu)建多酶復(fù)合結(jié)構(gòu)。支架技術(shù)常用的路徑優(yōu)化控制策略：1)DNA支架技術(shù)［33］。借助鋅指DNA結(jié)合域，特定的DNA序列能夠與特異性的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)相結(jié)合?；诖?，通過設(shè)定特定的DNA序列，能夠?qū)⒙窂矫赴凑詹煌捻樞颉⒈壤翱臻g位置排布在DNA鏈上，以此增加路徑酶的催化底物濃度，提高路徑催化效率。該方法已經(jīng)成功用于1，2-丙二醇等化合物的生產(chǎn)［33］。2)RNA 支架技術(shù)［34］。利用RNA元件的適配體區(qū)域與路徑酶的結(jié)合作用，將路徑酶組裝成多維的空間結(jié)構(gòu)，從而提高路徑催化效率。該方法已經(jīng)成功用于氫氣(H2)的生產(chǎn)［34］。3) 蛋白質(zhì)支架技術(shù)［35］。借助蛋白質(zhì)的相互作用原理，蛋白質(zhì)的互作區(qū)域能夠與特異性蛋白質(zhì)相結(jié)合。通過將該相互作用區(qū)域定位于支架蛋白上，以此招募并結(jié)合特定的路徑酶，從而縮短路徑酶的實際催化距離，提高路徑催化效率。該方法已經(jīng)成功用于丁酸(圖 5)［36］和 D-葡萄糖二酸［37］等化合物的生產(chǎn)。

圖4 微生物3-脫氫莽草酸和L-苯丙氨酸的代謝途徑Fig.4 Metabolic pathways for 3-dehydroshikimic acid and L-phenylalanine production

圖5 微生物丁酸的代謝途徑Fig.5 Metabolic pathways forbutyrate production

4.2 區(qū)間工程

區(qū)間工程通過區(qū)域化產(chǎn)物合成路徑與胞內(nèi)自身代謝路徑，從而使二者彼此間的交互影響達到最小化。區(qū)間工程將路徑酶反應(yīng)從無限制的胞質(zhì)環(huán)境轉(zhuǎn)換到具有膜結(jié)構(gòu)的細胞器中，有效地降低了底物擴散效應(yīng)和酶催化的空間距離，提升了細胞工廠合成目標化學品的能力［38］。區(qū)間工程常用的路徑優(yōu)化控制策略：1)線粒體工程［39-41］。線粒體中載有許多中心代謝途徑，如：檸檬酸循環(huán)、氨基酸合成和脂肪酸代謝等，而這些代謝路徑能夠為化學品的生物合成提供廣泛的前體譜。在狹小封閉的線粒體中進行催化反應(yīng)合成化學品，將會進一步提高底物濃度，改善催化反應(yīng)的速率和產(chǎn)品的生產(chǎn)強度。該方法已經(jīng)成功用于異丁醇(圖6)［39］和富馬酸［42］等化合物的生產(chǎn)。2) 過氧化物酶體工程［43］。過氧化物酶體是由一層單位膜包裹的囊泡，內(nèi)含豐富的酶類，如：氧化酶、過氧化氫酶和過氧化物酶，不屬于內(nèi)膜系統(tǒng)的膜結(jié)合細胞器。另外，過氧化物酶體區(qū)別于其他細胞器的特點在于清空這些膜內(nèi)蛋白，不會影響菌體自身代謝，而這種密閉的微環(huán)境也為合成路徑的區(qū)間化提供了可能。該方法已經(jīng)成功用于紫色桿菌素［43］和烷烴［44］等化合物的生產(chǎn)。3)羧酶體工程［45］。羧酶體由以蛋白質(zhì)為主的單層膜包圍，內(nèi)含固定CO2所需的1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶和碳酸酐酶，是藍藻細菌和硫桿菌等自養(yǎng)微生物固定CO2的主要場所。因此，羧酶體適合進行涉及CO2固定的生物合成路徑。該方法已經(jīng)成功用于異丁醛(圖6)［46］等化合物的生產(chǎn)。

圖6 微生物異丁醇和異丁醛的代謝途徑Fig.6 Metabolic pathways forisobutanol and isobutyraldehyde production

4.3 模塊路徑工程

針對涉及多條路徑的代謝優(yōu)化，通常采用單條路徑逐一代謝工程優(yōu)化的方式實現(xiàn)代謝流的平衡。但是，該方法往往需要經(jīng)歷多輪的菌株構(gòu)建、篩選和優(yōu)化過程，時間和經(jīng)濟成本較高，不利于進行大規(guī)模的優(yōu)化操作。為了解決上述問題，路徑模塊化這一概念應(yīng)運而生，即采用人為劃分的方式，將多條路徑劃分為幾個小的路徑模塊，并在轉(zhuǎn)錄(如啟動子、基因拷貝數(shù))、翻譯(如RBS強度)或蛋白(如蛋白質(zhì)工程)等水平上，調(diào)整途徑模塊催化特性，在不需要高通量篩選的條件下，實現(xiàn)多條代謝途徑的綜合優(yōu)化［47-48］。根據(jù)實際的操作方式，模塊路徑工程常用的路徑優(yōu)化控制策略：1)基于生化反應(yīng)代謝物特點的模塊化［49］。以路徑中間代謝物濃度、特性等生化指標作為模塊劃分依據(jù)，通過優(yōu)化不同模塊的表達強度，降低中間代謝物的積累，避免對菌體產(chǎn)生毒害作用和負反饋調(diào)節(jié)。該方法已經(jīng)成功用于紫杉醇等化合物的生產(chǎn)［49］。2)基于代謝路徑分支節(jié)點的模塊化［6］。以分支代謝路徑和中心代謝路徑的代謝物交叉節(jié)點作為模塊劃分依據(jù)，通過優(yōu)化不同模塊的碳流輸送強度，調(diào)控代謝流在路徑的實際分布情況，實現(xiàn)菌體生長和產(chǎn)品合成的最優(yōu)協(xié)同。該方法已經(jīng)成功用于(2S)-生松素(圖7)等化合物的生產(chǎn)［50］。3) 基于酶轉(zhuǎn)換數(shù)的模塊化［51］。針對路徑中酶催化效率的不同，以酶轉(zhuǎn)換數(shù)作為參考指標，將代謝路徑中的不同酶促反應(yīng)劃分成不同模塊，通過優(yōu)化不同模塊的催化效率，構(gòu)建最適的底物傳輸通道，實現(xiàn)底物轉(zhuǎn)運效率和催化效率的提高。該方法已經(jīng)成功用于黃酮類化合物(圖7)的生產(chǎn)［52］。

圖7 微生物(2S)-生松素和(2S)-柚皮素的代謝途徑Fig.7 Metabolic pathways for(2S)-pinocembrin and(2S)-naringenin production

5 結(jié)論與展望

針對微生物代謝路徑的優(yōu)化與調(diào)控，國內(nèi)外研究人員從四個方面開展了卓有成效的研究：在DNA水平(如，啟動子工程等);在 RNA水平(如，合成RNA開關(guān));在蛋白質(zhì)水平(如，蛋白質(zhì)工程);在代謝物水平(如，結(jié)構(gòu)生物學、區(qū)間工程、模塊路徑工程)。上述代謝工程新技術(shù)的應(yīng)用，能夠從不同層次水平上對菌株及其代謝路徑進行系統(tǒng)的調(diào)節(jié)和優(yōu)化，實現(xiàn)系統(tǒng)、簡約、高效調(diào)控代謝通路中通量平衡的目標。然而，路徑代謝反應(yīng)速率同時受到多種因素擾動的影響，包括：路徑基因的表達水平、路徑酶的催化能力和中間代謝物的濃度等。現(xiàn)有的代謝路徑優(yōu)化策略，缺乏實時俘獲與控制細胞代謝狀態(tài)的能力，不能有效地維持代謝路徑穩(wěn)態(tài)，從而影響目標代謝物的積累。因此，一方面，借助系統(tǒng)生物學的相關(guān)技術(shù)手段，如：基因組規(guī)模代謝網(wǎng)絡(luò)模型、基因組規(guī)模轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)模型、基因組規(guī)模蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)模型以及全細胞模型等，從細胞整體水平上理解和把握微生物的生理、代謝和功能狀態(tài)，有助于實時識別代謝路徑優(yōu)化過程中的關(guān)鍵因素。另一方面，利用精確代謝工程［53］與動態(tài)代謝工程［54］的相關(guān)策略，如：RNA敏感器(包括天然RNA敏感控制元件、合成的RNA敏感部件等)和蛋白質(zhì)敏感器(包括轉(zhuǎn)錄激活敏感器、蛋白激活敏感器、熒光敏感器、細胞敏感器等)，設(shè)計可實時調(diào)控的微生物代謝系統(tǒng)，動態(tài)改造與調(diào)控基因的整體表達水平，實現(xiàn)代謝路徑的穩(wěn)態(tài)調(diào)控。第三方面，基于高通量篩選技術(shù)，優(yōu)化代謝路徑 DBTL循環(huán)［55］的速率，強化DBTL循環(huán)的操作效率，提高單輪DBTL循環(huán)所能構(gòu)建菌株的通量。綜上所述，新技術(shù)的進一步發(fā)展與應(yīng)用，必將進一步推進微生物細胞工廠的構(gòu)建效率，提高目標化學品的生產(chǎn)能力，降低生物制造化學品的成本，為各種化合物的綠色生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

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(責任編輯 荀志金)

Optimization and regulation of microbial metabolic pathways

CHEN Xiulai1，2，3，GAO Cong1，2，3，LIU Jia1，2，3，LUO Qiuling1，2，3，LIU Liming1，2，3
(1．State Key Laboratory of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China;2．Key Laboratory of Industrial Biotechnology of the Ministry of Education，Jiangnan University，Wuxi 214122，China;3．Laboratory of Food Microbial-Manufacturing Engineering，Jiangnan University，Wuxi 214122，China)

Metabolic pathway balance plays an important role in producing chemicals，pharmaceuticals andbiofuels．To meet thedemand of industrial production，microbes should maintain a maximal carbon flux towards target metabolites withoutfluctuations in metabolic pathway．We reviewed the detailed strategies to optimize and regulate metabolic pathwaybalance at four levels，i．e．，DNA，RNA，protein and metabolite level．Furthermore，we indicated future research directions to further optimize and regulate metabolic pathway balance．

metabolic pathway;pathway optimization;metabolic engineering;synthetic biology

Q815

A

1672-3678(2017)05-0001-08

10．3969/j．issn．1672-3678．2017．05．001

2017-06-07

江蘇省自然科學基金(BK20160163);中國博士后科學基金(2016M600362);江南大學自主科研計劃重點項目(JUSRP51611A);江南大學自主科研計劃青年基金(JUSRP116022)

陳修來(1985—)，男，山東莒縣人，副教授，研究方向：系統(tǒng)代謝工程與合成生物學;劉立明(聯(lián)系人)，教授，E-mail：mingll@jiangnan．edu．cn