去水淫羊藿素對(duì)大鼠視網(wǎng)膜缺血/再灌注損傷的保護(hù)作用

呂昊琴，吳維霖，劉艷芳，劉錦榮，劉星芳，謝佳麗，黃志華，王輝

(1.贛南醫(yī)學(xué)院研究生學(xué)院，江西贛州341000；2.贛南醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，江西贛州341000；3.贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院眼科，江西贛州341000)

去水淫羊藿素對(duì)大鼠視網(wǎng)膜缺血/再灌注損傷的保護(hù)作用

呂昊琴1，吳維霖1，劉艷芳3，劉錦榮1，劉星芳1，謝佳麗1，黃志華2，王輝3

(1.贛南醫(yī)學(xué)院研究生學(xué)院，江西贛州341000；2.贛南醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，江西贛州341000；3.贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院眼科，江西贛州341000)

目的研究去水淫羊藿素(ICT)對(duì)大鼠視網(wǎng)膜缺血/再灌注損傷是否具有保護(hù)作用，并初步探討其作用機(jī)制。方法將40只SD大鼠采取隨機(jī)數(shù)表法分為5組(n=8)，通過(guò)夾閉一側(cè)頸總動(dòng)脈的方法構(gòu)建大鼠視網(wǎng)膜缺血/再灌注(I/R)模型。分別于夾閉前，一次性經(jīng)腹腔注射不同劑量(1.0 mg/kg、2.0 mg/kg、4.0 mg/kg)ICT；假手術(shù)組及模型組給予等體積生理鹽水腹腔注射；假手術(shù)組只分離不夾閉，模型組與藥物組建立視網(wǎng)膜I/R模型。各組分別在夾閉前、缺血30 min時(shí)行視網(wǎng)膜電流圖(ERG)、眼底照相檢查以及再灌注1 h后行ERG、眼底熒光血管造影(FFA)檢查。再灌注6 h后獲取視網(wǎng)膜，通過(guò)免疫印跡法檢測(cè)白介素10(IL-10)蛋白表達(dá)水平。結(jié)果與模型組比較，ICT治療組能顯著改善ERG的a波、b波振幅降低，使后極部視網(wǎng)膜缺血?jiǎng)用}明顯擴(kuò)張，并且能升高視網(wǎng)膜I/R損傷后視網(wǎng)膜組織IL-10蛋白表達(dá)水平[(1.02±0.44)vs(0.47±0.21)]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)論ICT對(duì)視網(wǎng)膜缺血/再灌注損傷具有保護(hù)作用，其保護(hù)機(jī)制可能與上調(diào)抗炎細(xì)胞因子IL-10蛋白表達(dá)水平，抑制炎癥反應(yīng)有關(guān)。

去水淫羊藿素；視網(wǎng)膜；缺血再灌注損傷；IL-10；電流圖

視網(wǎng)膜缺血性眼病是臨床上常見(jiàn)的一種致盲性眼病，缺血-再灌注視網(wǎng)膜損傷(retinal ischemia reperfusion injury，RIRI)是其治療過(guò)程中常發(fā)生的病理過(guò)程，主要表現(xiàn)為缺血視網(wǎng)膜恢復(fù)血液供應(yīng)后，患者視力未見(jiàn)改善反而視網(wǎng)膜出現(xiàn)明顯功能障礙。目前，關(guān)于視網(wǎng)膜缺血/再灌注損傷的確切發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚。有研究發(fā)現(xiàn)，再灌注最早表現(xiàn)為缺血區(qū)白細(xì)胞堆積和炎性細(xì)胞因子增多，可見(jiàn)炎癥反應(yīng)在缺血/再灌注視網(wǎng)膜損傷的發(fā)病機(jī)理中發(fā)揮著重要作用。去水淫羊藿素(icaritin，ICT)是巫山淫羊藿、箭葉淫羊藿、朝鮮淫羊藿等干燥莖和葉的水提取物。國(guó)內(nèi)外有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，ICT具有抗腫瘤[1]、抑制骨質(zhì)疏松[2]、抗纖維化[3]等藥理活性。此外，本課題組前期研究結(jié)果表明，ICT具有中樞抑制[4]、耐缺氧[5]、鎮(zhèn)痛[6]以及保護(hù)腦缺血再灌注損傷作用[7]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立視網(wǎng)膜I/R損傷模型，研究去水淫羊藿素對(duì)視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷是否有保護(hù)作用，并探討其保護(hù)作用與IL-10的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 試劑與藥物去水淫羊藿黃素(C21H20O6)為黃色結(jié)晶粉末，分子量為368.38，由(上海)天習(xí)化工有限公司提供，純度99%以上，實(shí)驗(yàn)前采用二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)及超純水溶解至所需濃度。DMSO購(gòu)自Sigma公司(貨號(hào)：D2650)，IL-10抗體購(gòu)自Santa Cruz公司(貨號(hào)：SC-365858)，超強(qiáng)信號(hào)west pico stable peroxide solution(Thermo公司，貨號(hào)：1862419)，超強(qiáng)信號(hào)west pico luminal/enhancer solution(Thermo公司，貨號(hào)：1862418)，Western bloting luminal reagent(Santa cruze，貨號(hào)：Sc-2048)，BCA蛋白定量試劑盒(北京，天根生化科技有限公司，貨號(hào)：P4715/P4321)，美多麗滴眼液(日本，參天制藥株式會(huì)社)，熒光素鈉注射液(中國(guó)，愛(ài)爾康眼科產(chǎn)品有限公司)，水合氯醛(國(guó)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑有限公司)，乙醇、液氮、生理鹽水、SDS-PAGE電泳液、1×轉(zhuǎn)膜液(贛南醫(yī)學(xué)院科研中心)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物40只SPF級(jí)SD雄性大鼠，體質(zhì)量為(300±25)g，購(gòu)自贛南醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，動(dòng)物中心許可證號(hào)：SCXK(贛)2014-0001。飼養(yǎng)條件：SPF級(jí)動(dòng)物房，12 h光照/12 h黑暗的自然晝夜光線照明，室內(nèi)通風(fēng)良好，室溫恒定在(25±2)℃，標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料，自由飲水和攝食，適應(yīng)性飼養(yǎng)5～7 d后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。

1.3 所用儀器RetiMNER-S視覺(jué)電生理儀(重慶艾爾曦醫(yī)療設(shè)備有限公司)，CF-60UD眼底照相及眼底血管熒光造影儀(日本，科林，佳能)，Universal HoodⅡ型超靈敏度化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(美國(guó)，Bio-Rad公司)，多功能酶標(biāo)儀-3001型(美國(guó)，Thermo公司)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法[8-10]

1.4.1 分組與構(gòu)建視網(wǎng)膜I/R模型SPF級(jí)SD雄性大鼠40只，采用隨機(jī)數(shù)表法將其分為5組(n=8)，即假手術(shù)組、視網(wǎng)膜I/R模型組(簡(jiǎn)稱(chēng)模型組)、I/R+低劑量(1.0 mg/kg)ICT治療組、I/R+中劑量(2.0 mg/kg)ICT治療組及I/R+高劑量(4.0 mg/kg)ICT治療組。采用體積分?jǐn)?shù)為10%的水合氯醛(按350 mg/kg)經(jīng)腹腔注射將老鼠麻醉，固定于動(dòng)物解剖板上，用75%乙醇消毒頸部皮膚，于頸部正中線切開(kāi)大鼠皮膚，用止血鉗將皮下組織逐層進(jìn)行鈍性分離，暴露出右側(cè)頸總動(dòng)脈，動(dòng)脈夾夾閉右側(cè)頸總動(dòng)脈，60 min后松開(kāi)動(dòng)脈夾，縫合皮下組織及皮膚，構(gòu)建大鼠視網(wǎng)膜I/R模型。假手術(shù)組僅分離出頸總動(dòng)脈，不進(jìn)行夾閉。術(shù)中嚴(yán)格控制室溫在23℃～25℃。藥物組和對(duì)照組在夾閉頸總動(dòng)脈前分別經(jīng)腹腔注射1.0 mg/kg、2.0 mg/kg、4.0 mg/kg的ICT和等體積的生理鹽水。

1.4.2 ICT對(duì)視網(wǎng)膜缺血/再灌注損傷的影響麻醉大鼠后，用美多麗滴眼液散瞳，將大鼠固定在動(dòng)物解剖板上，分別在夾閉大鼠頸總動(dòng)脈前和缺血30 min時(shí)行視網(wǎng)膜電流圖(ERG)和眼底照相及眼底熒光血管造影(FFA)檢查；再灌注1 h后分別行ERG和FFA檢查。

1.4.3 視網(wǎng)膜IL-10蛋白表達(dá)水平檢測(cè)再灌注6 h后，用大劑量麻藥麻醉大鼠(方法同1.4.1)致死，迅速摘下眼球，置于冰浴中，依次去除角膜、虹膜、晶狀體及玻璃體，獲取視網(wǎng)膜后迅速放入液氮罐中，后置于-80℃冰箱保存。提取組織蛋白后采用BCA蛋白定量試劑盒，按試劑盒說(shuō)明書(shū)嚴(yán)格進(jìn)行操作，蛋白定量完畢后，采用Western blot法檢測(cè)視網(wǎng)膜組織IL-10的表達(dá)水平。根據(jù)所測(cè)蛋白分子量大小制備12%的SDS-PAGE分離膠和5%的濃縮膠進(jìn)行蛋白電泳后，嚴(yán)格按照濕法轉(zhuǎn)膜的步驟進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜完畢后將硝酸纖維素膜(nitrocellulosee，NC)(Pall Gelman Laboratory，USA)封閉于5%脫脂牛奶中，室溫下水平搖床搖1 h。加入合適比例稀釋的IL-10抗體后封入雜交袋中，4℃水平搖床過(guò)兩夜一天。取出NC膜后，用1×TBST洗滌5 min×3次，加入與一抗對(duì)應(yīng)的二抗，按1:1 000比例，封入雜交袋，擠除所有氣泡，室溫水平搖床搖1 h。用1×TBST洗二抗10 min×3次后，將化學(xué)發(fā)光液A、B等量混合，采用超高靈敏度化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)照相并用圖像分析軟件測(cè)定灰度值。

2 結(jié)果

2.1 ICT對(duì)ERG的影響假手術(shù)組可見(jiàn)明顯的a波和b波；模型組在缺血時(shí)ERG波形完全消失，再灌注1 h時(shí)a波、b波稍有恢復(fù)；模型組和ICT治療組在視網(wǎng)膜缺血30 min時(shí)ERG的a波和b波的振幅明顯降低；再灌注后1 h，與模型組比較，ICT治療組能顯著改善ERG的a波、b波振幅降低，見(jiàn)圖1。提示在整體水平，ICT對(duì)視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用。

2.2 ICT對(duì)FFA的影響與假手術(shù)組比較，模型組大鼠夾閉一側(cè)頸總動(dòng)脈后視網(wǎng)膜血管出現(xiàn)痙攣、變細(xì)，視網(wǎng)膜后極部出現(xiàn)明顯的缺血變白，視乳頭周?chē)霈F(xiàn)輕度水腫；缺血時(shí)及再灌注后，與模型組比較，給予ICT治療后后極部視網(wǎng)膜痙攣血管得到明顯恢復(fù)，見(jiàn)圖2。進(jìn)一步提示在整體水平，ICT對(duì)視網(wǎng)膜I/R損傷具有保護(hù)作用。

圖1 ICT對(duì)大鼠視網(wǎng)膜缺血30 min及再灌注1 h后ERG的影響

圖2 ICT對(duì)大鼠視網(wǎng)膜缺血前、缺血30 min時(shí)及再灌注1 h后眼底照相的影響

2.3 ICT對(duì)大鼠視網(wǎng)膜I/R損傷時(shí)視網(wǎng)膜組織IL-10蛋白表達(dá)的影響圖3為Western blot的結(jié)果，結(jié)合表1所示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠視網(wǎng)膜組織IL-10蛋白表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；1.0 mg/kg、2.0 mg/kg及4.0 mg/kg ICT治療后，視網(wǎng)膜I/R損傷視網(wǎng)膜組織中IL-10蛋白表達(dá)水平均有升高，尤其是2.0 mg/kg ICT組，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q=4.592，P＜0.05)。

圖3 ICT對(duì)大鼠視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷時(shí)視網(wǎng)膜組織IL-10蛋白表達(dá)的影響

3 討論

視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷常發(fā)生在DR、ROP、視網(wǎng)膜血管阻塞性疾病、急性閉角性青光眼等治療過(guò)程中。缺血視網(wǎng)膜實(shí)現(xiàn)血流再通后，由于缺血導(dǎo)致的視網(wǎng)膜功能障礙并沒(méi)有得到緩解反而更加嚴(yán)重，呈現(xiàn)出細(xì)胞不可逆性損傷，可見(jiàn)，再灌注并不能使視網(wǎng)膜損傷得到緩解，卻使細(xì)胞死亡加劇，這就是視網(wǎng)膜缺血/再灌注損傷。大量研究表明，炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、興奮性氨基酸、氧自由基、NO、鈣超載等多因素、多環(huán)節(jié)參與視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷[11-12]。

ERG是一種記錄視網(wǎng)膜的視感細(xì)胞在光刺激作用下產(chǎn)生的一組復(fù)合電位變化情況的方法，對(duì)掌握視網(wǎng)膜的狀況具有特異性。其中，a波主要由光感受器產(chǎn)生，b波振幅的波動(dòng)對(duì)反映視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷程度具有重要作用[13]。因此，檢測(cè)大鼠視網(wǎng)膜的ERG可以反映組織及細(xì)胞的損傷程度。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組眼底照相和FFA顯示夾閉大鼠一側(cè)頸總動(dòng)脈后視網(wǎng)膜血管出現(xiàn)痙攣、變細(xì)，視網(wǎng)膜后極部出現(xiàn)明顯的缺血變白，視乳頭周?chē)霈F(xiàn)輕度水腫，同時(shí)ERG顯示其a波和b波的振幅明顯降低；1.0 mg/kg、2.0 mg/kg及4.0 mg/kg ICT治療后，視網(wǎng)膜I/R損傷視網(wǎng)膜后極部痙攣血管得到明顯恢復(fù)，ERG的a波、b波振幅降低程度得到顯著改善。這表明本實(shí)驗(yàn)制備的視網(wǎng)膜I/R損傷模型是成功的，且ICT對(duì)大鼠短暫性視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷具有一定的保護(hù)作用。

有實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，視網(wǎng)膜I/R損傷后可使內(nèi)源性IL-1和IL-6表達(dá)增加，改變血流動(dòng)力學(xué)，誘導(dǎo)白細(xì)胞向缺血組織浸潤(rùn)，活化血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生自由基、NO，刺激中性粒細(xì)胞釋放炎性反應(yīng)蛋白和炎性介質(zhì)，從而加劇炎性反應(yīng)導(dǎo)致遲發(fā)神經(jīng)元損傷[14]。IL-10作為一種炎性抑制因子，可通過(guò)抑制IL-1、IL-6等的受體的表達(dá)等來(lái)減輕炎癥反應(yīng)，從而減輕組織損傷[15]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，給予ICT治療后，視網(wǎng)膜IL-10蛋白表達(dá)水平升高，尤其是2.0 mg/kg ICT，與模型組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

綜上所述，ICT對(duì)視網(wǎng)膜I/R損傷具有一定的保護(hù)作用，且上調(diào)IL-10蛋白表達(dá)水平，抑制炎癥反應(yīng)是其可能的機(jī)制之一。但I(xiàn)CT的化學(xué)結(jié)構(gòu)與雌激素類(lèi)似，是一種植物性雌激素，其對(duì)視網(wǎng)膜缺血/灌注損傷的保護(hù)作用機(jī)制還有待于進(jìn)一步探究。

[1]Sun L,Peng Q,Qu L,et al.Anticancer agent icaritin induces apoptisis through caspase-dependent pathways in human hepatocellular carcinoma cells[J].Mol Med Rep,2015,11(4):3094-3100.

[2]Jiang J,Li J,Jia X.The antiosteoporotic activity of central icaritin(CIT)on bone metabolism of ovariectomized rats[J].Molecules,2014,19(11):18690-18704.

[3]Liu P,Jin X,Lv H,et al.Icaritin ameliorates carbon tetrachloride-induced acute liver injury mainly because of the antioxidative function through estrogen-like effects[J].In Vtro Cell Dev Biol Anim,2014,50(10):899-908.

[4]賴(lài)飛,曾靖,黃賢華,等.淫羊藿水提取液中樞抑制作用的研究[J].贛南醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2003,23(3):268-270.

[5]曾靖,黃賢華,葉和楊,等.淫羊藿水提取液的耐缺氧作用[J].贛南醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2002,22(4):326-328.

[6]李良東,黃志華,曾靖,等.淫羊藿水提取液鎮(zhèn)痛作用的研究[J].贛南醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2004,24(1):14-16.

[7]賴(lài)麗娟,劉星芳,陳琴,等.去水淫羊藿素對(duì)腦缺血再灌注損傷氧化應(yīng)激的影響[J].贛南醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2015,35(1):14-17.

[8]Minhas G,Morishita R,Shimamura M,et al.Modeling transient retinal ischemia in mouse by ligation of pterygopalatine artery[J].Ann Neurosci,2015,22(4):222-225.

[9]Minhas G,Morishita R,Anand A.Preclinical models to investigate retinal ischemia:advances and drawbacks[J].Front Neurol,2012,3:75.

[10]曾靖,黃志華,李良東,等.3'-大豆苷元磺酸鈉對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷后視網(wǎng)膜作用的影響[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2013,19(12):197-199.

[11]楊丹,余德江,余資江.視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷的機(jī)制及藥物治療進(jìn)展[J].局部手術(shù)學(xué)雜志,2012,21(5):561-563.

[12]朱遠(yuǎn)軍,金敏.視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷機(jī)制研究進(jìn)展[J].中國(guó)病理生理雜志,2007,23(1):195-200.

[13]Lavoie J,Maziade M,Hébert M.The brain through the retina:the flash electroretinogram as a tool to investigate psychiatric disorders[J].Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry,2014,48:129-134.

[14]Li SY,Fung FK,Fu ZJ,et al.Anti-inflammatory effects of Lutein in retinal ischemic/hy-poxic injury:in vivoandin vitrostudies[J].Invest Ophthalmol Vis Sci,2012,53(10):5976-5984.

[15]Grilli M,Barbieri I,Basudev H,et al.Interleukin-10 modulates neuronal threshold of vulnerability to ischaemic damage[J].Eur J Neurosci,2000,12(7):2265-2272.

Protective effects of icaritin on retinal ischemia/reperfusion injury in rats.

LV Hao-qin1,WU Wei-lin1,LIUYan-fang3,LIU Jin-rong1,LIU Xing-fang1,XIE Jia-li1,HUANG Zhi-hua2,WANG Hui3.1.Graduate Faculty of Gannan Medical University,Ganzhou 341000,Jiangxi,CHINA;2.Department of Physiology,Gannan Medical University,Ganzhou 341000,Jiangxi,CHINA;3.Department of Ophthalmology,the First Affiliated Hospital of Gannan Medical University,Ganzhou 341000,Jiangxi,CHINA

ObjectiveTo explore the protective effects of icaritin(ICT)on retinal ischemia/reperfusion injury in rats and its potential mechanism.MethodsForty Sprague-Dawley rats were assigned into the five groups according to random number tables,with 8 cases in each group.The model of retinal ischemia/reperfusion injury was induced by the ligation of the common carotid artery unilaterally.Respectively,these rats were randomized to receive intraperitoneal injection of saline,at the dosage of 1.0 mg/kg,2.0 mg/kg,4.0 mg/kg of ICT before the induction of retinal I/R injury.The rats in the sham group were isolated without ligation of the common carotid artery,and the retinal I/R model was established in the model group and the drug group.Electroretinography(ERG)and fundus photography were used to assess functional changes in retina before and 30 minutes after ligation.One hour after reperfusion,ERG and fluorescein fundus angiography(FFA)were performed.After 6 h of reperfusion,the rats were sacrificed and the eyeballs were extracted for retina.The expression of interleukin 10(IL-10),one of anti-inflammatory mediators was quantified by Western blot analysis.ResultsCompared with the model group,the ICT groups ameliorated notably the decrease of the amplitudes of the a-and b-waves and significantly dilate retinal vessels.Besides,the level of IL-10 in the retinal tissue after retinal I/R damage increased,especially in 2.0 mg/kg ICT group(P＜0.05).ConclusionICT has a protective effect in retinal ischemia/reperfusion injury,possibly by increasing the expression of IL-10 and suppressing inflammation.

Icaritin(ICT);Retinal;Ischemia/reperfusion injury;Interleukin 10(IL-10);Electroretinography

R-332

A

1003—6350（2017）18—2932—04

2017-07-24)

10.3969/i.issn.1003-6350.2017.18.003

王輝。E-mail：gyfywanghui@163.com