體外培養(yǎng)大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞水通道蛋白4的表達(dá)①

徐立新，董麗萍，師忠芳，閆旭，楊少華，袁芳

體外培養(yǎng)大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞水通道蛋白4的表達(dá)①

徐立新1,2，董麗萍1,2，師忠芳1,2，閆旭1,2，楊少華3，袁芳1,2

目的 研究水通道蛋白4(AQP4)在體外培養(yǎng)大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)規(guī)律。方法 取新生1 d Wistar大鼠大腦皮層行星形膠質(zhì)細(xì)胞原代培養(yǎng)，分別于原代培養(yǎng)3 d、5 d、7 d、9 d及傳代培養(yǎng)9 d行膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)免疫熒光染色；實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)及AQP4免疫熒光染色檢測(cè)AQP4 mRNA及蛋白的表達(dá)。結(jié)果 原代及傳代培養(yǎng)不同時(shí)間點(diǎn)95%以上細(xì)胞GFAP免疫熒光染色陽(yáng)性，且GFAP表達(dá)量逐漸增加。原代培養(yǎng)3 d有AQP4 mRNA表達(dá)，3 d和5 d AQP4 mRNA表達(dá)水平無(wú)顯著性差異(P＞0.05)，7 d AQP4 mRNA表達(dá)升高(P＜0.05)，9 d持續(xù)升高(P＜0.05)；傳代培養(yǎng)9 d與原代培養(yǎng)9 d AQP4 mRNA表達(dá)無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。AQP4蛋白表達(dá)與AQP4 mRNA表達(dá)一致。結(jié)論 大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞原代培養(yǎng)3 d即有AQP4表達(dá)，之后逐漸增加，9 d左右表達(dá)漸趨穩(wěn)定。

水通道蛋白4；星形膠質(zhì)細(xì)胞；細(xì)胞培養(yǎng)；大鼠

水通道蛋白(aquaporins,AQPs)是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的位于細(xì)胞膜上與水的通透性相關(guān)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其中AQP4是腦內(nèi)最重要的AQPs，在腦組織中分布最廣，含量最多，主要參與鉀離子緩沖、體液自身調(diào)節(jié)、中樞滲透壓調(diào)節(jié)等[1-2]，特別與癲癇、腦缺血、腦外傷、腦腫瘤等所致的腦水腫密切相關(guān)[3-4]。研究發(fā)現(xiàn)，AQP4高表達(dá)于星形膠質(zhì)細(xì)胞和室管膜細(xì)胞，尤其是與毛細(xì)血管和軟腦膜接觸的星形膠質(zhì)細(xì)胞膜處[5]。Yamamoto等[6]利用體外培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞研究發(fā)現(xiàn)，AQP4只在星形膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)。本研究觀察體外培養(yǎng)條件下大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞AQP4表達(dá)的時(shí)程規(guī)律，為進(jìn)一步研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

最低必需培養(yǎng)基(minimum essential medium,MEM)、 胎 牛 血 清 (fetal bovine serum,FBS)： GIBCO公司。兔抗大鼠膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)多克隆抗體：DAKO公司。AQP4多克隆抗體：ABCAM公司。Alexa Fluor 488標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗：MOLECULAR PROBES公司。TRIzol試劑：LIFE TECHNOLOGIES公司。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒：PROMEGA公司。SYBR GreenⅠ核酸染料試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative real-time quantitative polymerase chain reaction,qRT-PCR)儀(LightCycler480)：ROCHE公司。倒置相差顯微鏡(Axio ObserverA1)：ZEISS公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

新生1 d Wistar大鼠，由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所提供，合格證號(hào)SCSK(京)2005-0013。實(shí)驗(yàn)過(guò)程按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用3R原則給予人道關(guān)懷，并通過(guò)北京市神經(jīng)外科研究所動(dòng)物福利倫理審查(No.201401007)。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)

參考McCarthy的方法[7]并加以改良[8]行大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞原代培養(yǎng)。無(wú)菌條件下，取新生1 d Wistar大鼠大腦皮層組織，用含10%胎牛血清的MEM分散成單細(xì)胞懸液后，接種于底面積75 cm2培養(yǎng)瓶中，5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)37℃培養(yǎng)。每2～3天觀察、半量換液1次。原代培養(yǎng)9 d的星形膠質(zhì)細(xì)胞行傳代培養(yǎng)，GFAP免疫熒光染色鑒定培養(yǎng)細(xì)胞純度。

1.3.2 GFAP及AQP4免疫熒光染色

根據(jù)我們前期研究的方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)[9]。培養(yǎng)細(xì)胞丙酮固定30 min，正常羊血清封閉15 min，加入兔抗大鼠GFAP抗體(1∶50)或兔抗大鼠AQP4抗體(1∶100)，陰性對(duì)照用PBS代替一抗，4℃過(guò)夜。Alexa Fluor 488標(biāo)記山羊抗兔IgG(1∶100)避光孵育3 h。含DAPI的熒光封片劑封片，倒置熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。

根據(jù)我們前期研究的方法[10]，應(yīng)用Image J圖像分析軟件對(duì)GFAP及AQP4免疫熒光結(jié)果進(jìn)行圖像分析。一個(gè)時(shí)間點(diǎn)取3張玻片，高倍鏡下(200×)隨機(jī)選取3個(gè)視野，將圖片黑白反向處理，計(jì)算9個(gè)視野中平均光密度值(average optical density,AOD)。

1.3.3 逆轉(zhuǎn)錄qRT-PCR

方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)[11]。分別于原代培養(yǎng)3 d、5 d、7 d、9 d及傳代培養(yǎng)9 d使用TRIzol試劑提取培養(yǎng)細(xì)胞總RNA，應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，用SYBY Green方法行PCR。根據(jù)GenBank大鼠AQP4(NM012825.4)序列、β-actin(NM031144.3)序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì)：

AQP4上游5'-TGA ATC CAG CTC GAT CCT TTG-3'，下游5'-TAT CCA GTG GTT TTC CCA GTT TC-3'；

β-actin上游 5'-CGT TGA CAT CCG TAA AGA CC-3'，下游5'-CTA GGA GCC AGA GCA GTA ATC-3'。

由深圳華大基因科技服務(wù)有限公司合成。

PCR反應(yīng)體系包括AQP4或β-actin上游引物和下游引物各 1 μl，SYBR Green PCR Master Mix 10 μl，模板cDNA 1 μl，DEPC水7 μl。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)熱10 min，95℃變性15 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。

用LightCycler480 Software 1.5軟件進(jìn)行分析，用AQP4/β-actin表示AQP4 mRNA表達(dá)水平。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取3個(gè)樣品，重復(fù)3次。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。各組數(shù)據(jù)以(xˉ±s)表示，進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 培養(yǎng)細(xì)胞鑒定

培養(yǎng)不同時(shí)間細(xì)胞均呈大致均一的單層扁平細(xì)胞，具有短而粗大的細(xì)胞突起，并且隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞密度逐漸增加(圖1)。培養(yǎng)細(xì)胞95%以上為GFAP染色陽(yáng)性(圖2)。隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，GFAP表達(dá)增加。見(jiàn)表1。

2.2 AQP4 mRNA

原代培養(yǎng)3 d可檢測(cè)到AQP4 mRNA表達(dá)；3 d、5 d AQP4 mRNA表達(dá)無(wú)顯著性改變(P＞0.05)；7 d AQP4 mRNA表達(dá)升高(P＜0.05)，9 d持續(xù)升高(P＜0.05)；傳代培養(yǎng)9 d與原代培養(yǎng)9 d AQP4 mRNA表達(dá)無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。見(jiàn)表1。AQP4免疫熒光定量結(jié)果與AQP4 mRNA表達(dá)變化一致。見(jiàn)圖3、表1。

圖1 培養(yǎng)大鼠細(xì)胞形態(tài)(倒置相差顯微鏡PlasDIC模式,bar=200 μm)

圖2 培養(yǎng)大鼠細(xì)胞GFAP表達(dá)(免疫熒光染色,bar=200 μm)

圖3 培養(yǎng)大鼠細(xì)胞AQP4表達(dá)(免疫熒光染色,bar=200 μm)

表1 培養(yǎng)大鼠細(xì)胞各時(shí)間點(diǎn)GFAP、AQP4 mRNA和AQP4表達(dá)

3 討論

腦水腫是各種腦疾病常見(jiàn)并發(fā)癥，其發(fā)生與多種因素有關(guān)[12]，實(shí)質(zhì)是腦內(nèi)水平衡紊亂。研究顯示，腦水腫主要是星形膠質(zhì)細(xì)胞腫脹[13]。

星形膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)數(shù)量最多的一類(lèi)細(xì)胞，在神經(jīng)元的損傷修復(fù)、信號(hào)傳遞、突觸形成等方面具有重要作用[14-15]。近年來(lái)對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞在各種腦疾病中作用的研究越來(lái)越多，尤其是腦損傷后星形膠質(zhì)細(xì)胞在腦水腫中所發(fā)揮的作用受到研究者關(guān)注。

AQP4是腦內(nèi)最重要的AQPs，主要表達(dá)于星形膠質(zhì)細(xì)胞質(zhì)膜，在各種腦疾病所致腦水腫中起重要作用[16]，其表達(dá)受諸多因素調(diào)節(jié)[17-18]。大量實(shí)驗(yàn)表明，AQP4的功能是雙向的，既可能是腦水腫發(fā)生的促進(jìn)因素，也可能是腦水腫消散的促進(jìn)因素[19]。如何通過(guò)干預(yù)腦內(nèi)AQP4表達(dá)治療腦水腫，已成為開(kāi)發(fā)腦水腫治療新方法的關(guān)鍵[20]。

在體實(shí)驗(yàn)研究不能排除損傷過(guò)程中各種復(fù)雜因素的影響，也不能區(qū)分細(xì)胞的原發(fā)損傷和繼發(fā)損傷，使觀察單因素對(duì)細(xì)胞的影響受到限制。利用星形膠質(zhì)細(xì)胞體外培養(yǎng)進(jìn)行AQP4表達(dá)研究越來(lái)越受到重視。但由于目前為止尚沒(méi)有關(guān)于星形膠質(zhì)細(xì)胞體外培養(yǎng)下AQP4表達(dá)規(guī)律的報(bào)道，使用培養(yǎng)多久的星形膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)研究成為困擾研究者的難題。

鑒于原代培養(yǎng)3 d星形膠質(zhì)細(xì)胞才開(kāi)始貼壁生長(zhǎng)，故本實(shí)驗(yàn)從細(xì)胞培養(yǎng)3 d開(kāi)始觀察，通過(guò)GFAP免疫熒光染色鑒定培養(yǎng)細(xì)胞純度。GFAP是構(gòu)成中間纖維的主要成分，在成熟星形膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)，被公認(rèn)為星形膠質(zhì)細(xì)胞的特征性標(biāo)志物[21]。GFAP也可作為觀察星形膠質(zhì)細(xì)胞增生的指標(biāo)[22-23]。本研究中，我們觀察到原代及傳代培養(yǎng)不同時(shí)間點(diǎn)，95%以上培養(yǎng)細(xì)胞GFAP免疫熒光染色陽(yáng)性，且表達(dá)量隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)逐漸增加，但原代培養(yǎng)9 d和傳代培養(yǎng)9 d無(wú)顯著性差異，提示這時(shí)星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖處于相對(duì)穩(wěn)定狀態(tài)。

倒置相差顯微鏡觀察，原代培養(yǎng)3 d、5 d時(shí)，培養(yǎng)瓶中星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量少，7 d時(shí)細(xì)胞數(shù)量增多，原代培養(yǎng)9 d與傳代培養(yǎng)9 d后，培養(yǎng)瓶中星形膠質(zhì)細(xì)胞匯合程度均達(dá)90%以上。

AQP4免疫熒光和qRT-PCR顯示，原代培養(yǎng)3 d星形膠質(zhì)細(xì)胞就有微弱AQP4表達(dá)，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，AQP4表達(dá)顯著增高；傳代培養(yǎng)9 d與原代培養(yǎng)9 d AQP4表達(dá)無(wú)顯著性差異，表明星形膠質(zhì)細(xì)胞中AQP4表達(dá)水平處于相對(duì)穩(wěn)定狀態(tài)。

Wen等[24]利用Westen blotting對(duì)大鼠出生后腦內(nèi)AQP4表達(dá)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)AQP4表達(dá)由生后7 d時(shí)的2%增加到生后14 d的25%。Li等[25]研究發(fā)現(xiàn)，小鼠腦內(nèi)AQP4在生后1周表達(dá)量是成年小鼠腦內(nèi)總表達(dá)量的21.3%，生后2周可以達(dá)到成年腦的67.4%。與我們觀察到的現(xiàn)象相似。研究AQP4在星形膠質(zhì)細(xì)胞的表達(dá)，選擇適宜的培養(yǎng)時(shí)間非常重要。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)，大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞原代培養(yǎng)3 d就有AQP4表達(dá)，之后逐漸增加，9 d達(dá)穩(wěn)定狀態(tài)，適宜進(jìn)行AQP4在星形膠質(zhì)細(xì)胞生理及病理?xiàng)l件下的相關(guān)研究。

[參考文獻(xiàn)]

[1]Papadopoulos MC,Verkman AS.Aquaporin water channels in the nervous system[J].Nat Rev Neurosci,2013,14(4):265-277.

[2]Filippidis AS,Carozza RB,Rekate HL.Aquaporins in brain edema and neuropathological conditions[J].Int J Mol Sci,2016,18(1):55.

[3]Verkman AS,Anderson MO,Papadopoulos MC.Aquaporins:important but elusive drug targets[J].Nat Rev Drug Discov,2014,13(4):259-277.

[4]徐仟,孫振榮,李桂林,等.人顳葉內(nèi)側(cè)癲癇海馬組織星形膠質(zhì)細(xì)胞水通道蛋白4和內(nèi)向整流性鉀離子通道4.1的再分布[J].中國(guó)康復(fù)理論與實(shí)踐,2012,18(3):215-218.

[5]Nielsen S,Nagelhus EA,Amiry-Moghaddam M,et al.Specialized membrane domains for water transport in glial cells:high-resolution immunogold cytochemistry of aquaporin-4 in rat brain[J].J Neurosci,1997,17(1):171-180.

[6]Yamamoto N,Yoneda K,Asai K,et al.Alterations in the expression of the AQP family in cultured rat astrocytes during hypoxia and reoxygenation[J].Brain Res Mol Brain Res,2001,90(1):26-38.

[7]McCarthy KD,Vellis JD.Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue[J].J Cell Biol,1980,85(3):890-902.

[8]Yuan F,Wang T.Glutamate-induced swelling of cultured astrocytes is mediated by metabotropic glutamate receptor[J].Sci China C Life Sci,1996,39(5):517-522.

[9]Shi ZF,Zhao WJ,Xu LX,et al.Downregulation of aquaporin 4 expression through extracellular signal-regulated kinases1/2 activation in cultured astrocytes following scratch-injury[J].Biomed Environ Sci,2015,28(3):199-205.

[10]王曉璇,孫振榮,吳敏,等.人顳葉內(nèi)側(cè)癲癇海馬組織星形膠質(zhì)細(xì)胞Syntrophin的表達(dá)變化[J].中國(guó)康復(fù)理論與實(shí)踐,2017,23(3):292-297.

[11]Shi Z,Zhang W,Lu Y,et al.Aquaporin 4-mediated glutamate-induced astrocyte swelling is partially mediated through metabotropic glutamate receptor 5 activation[J].Front Cell Neurosci,2017,11:116.

[12]Stokum JA,Kurland DB,Gerzanich V,et al.Mechanisms of astrocyte-mediated cerebral edema[J].Neurochem Res,2015,40(2):317-328.

[13]Thrane AS,Rangroo Thrane V,Nedergaard M.Drowning stars:reassessing the role of astrocytes in brain edema[J].Trends Neurosci,2014,37(11):620-628.

[14]Nuriya M,Hirase H.Involvement of astrocytes in neurovascular communication[J].Prog Brain Res,2016,225:41-62.

[15]Becerra-Calixto A,Cardona-Gómez GP.The role of astrocytes in neuroprotection after brain stroke:potential in cell therapy[J].Front Mol Neurosci,2017,10:88.

[16]Potokar M,Jorgacevski J,Zorec R.Astrocyte aquaporin dynamics in health and disease[J].Int J Mol Sci,2016,17(7):1121.

[17]師忠芳,袁芳.腦內(nèi)水通道蛋白4表達(dá)調(diào)節(jié)的研究進(jìn)展[J].中國(guó)康復(fù)理論與實(shí)踐,2007,13(8):724-726.

[18]Assentoft M,Larsen BR,MacAulay N.Regulation and function of AQP4 in the central nervous system[J].Neurochem Res,2015,40(12):2615-2627.

[19]Chu H,Huang C,Ding H,et al.Aquaporin-4 and cerebrovascular diseases[J].Int J Mol Sci,2016,17(8):1249.

[20]Tang G,Yang GY.Aquaporin-4:a potential therapeutic target for cerebral edema[J].Int J Mol Sci,2016,17(10):1413.

[21]Yang Z,Wang KK.Glial fibrillary acidic protein:from intermediate filament assembly and gliosis to neurobiomarker[J].Trends Neurosci,2015,38(6):364-374.

[22]Hol EM,Pekny M.Glial fibrillary acidic protein(GFAP)and the astrocyte intermediate filament system in diseases of the central nervous system[J].Curr Opin Cell Biol,2015,32:121-130.

[23]吳敏,方慶,師忠芳,等.亞甲基藍(lán)對(duì)大鼠局灶性腦缺血再灌注后血腦屏障的保護(hù)作用[J].中國(guó)康復(fù)理論與實(shí)踐,2016,22(2):125-131.

[24]Wen H,Nagelhus EA,Amiry-Moghaddam M,et al.Ontogeny of water transport in rat brain:postnatal expression of the aquaporin-4 water channel[J].Eur J Neurosci,1999,11(3):935-945.

[25]Li X,Gao J,Ding J,et al.Aquaporin-4 expression contributes to decreases in brain water content during mouse postnatal development[J].Brain Res Bull,2013,94:49-55.

Expression ofAquaporin 4 inAstrocytes of Rats in Vitro

XU Li-xin1,2,DONG Li-ping1,2,SHI Zhong-fang1,2,YAN Xu1,2,YANG Shao-hua3,YUAN Fang1,2
1.Department of Pathophysiology,Beijing Neurosurgical Institute,Beijing 100050,China;2.Beijing Tiantan Hospital,Capital Medical University,Beijing 100050,China;3.Department of Pharmacology and Neuroscience,University of North Texas Health Science Center,Fort Worth,Texas 76107,USA

DONG Li-ping.E-mail:d08270827@163.com

Objective To explore the expression of aquaporin 4(AQP4)in primary and secondary cultured rat astrocytes.Methods Rat cortical astrocytes from a newborn(one day)Wistar rat were cultured.Astrocytes were identified with immunofluorescence staining of glial fibrilillary acidic protein(GFAP).The expression of AQP4 was determined with real-time quantitative polymerase chain reaction and immunofluorescence staining three,five,seven and nine days of primary culture,and nine days of secondary culture.Results The purity of GFAP-positive cells was more than 95%.The expression of AQP4 mRNA was found three days of primary culture,remained unchanged five days of primary culture(P＞0.05),and increased seven and nine days of primary culture(P＜0.05).The expression of AQP4 mRNA was not different between nine days of primary culture and nine days of secondary culture(P＞0.05).AQP4 immunofluorescence staining showed the same trend of AQP4 mRNA.Conclusion AQP4 may express since three days of primary culture in rat astrocytes in vitro,and increase slowly until nine days of primary culture.

aquaporin 4;astrocyte;cell culture;rats

R338.2

A

1006-9771(2017)09-1051-05

2017-05-17

2017-06-22)

10.3969/j.issn.1006-9771.2017.09.012

[本文著錄格式] 徐立新，董麗萍，師忠芳，等.體外培養(yǎng)大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞水通道蛋白4的表達(dá)[J].中國(guó)康復(fù)理論與實(shí)踐,2017,23(9):1051-1055.

CITED AS:Xu LX,Dong LP,Shi ZF,et al.Expression of aquaporin 4 in astrocytes of rats in vitro[J].Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian,2017,23(9):1051-1055.

1.國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No.81271286)；2.北京市自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No.7152027)。

1.北京市神經(jīng)外科研究所病理生理室，北京市100050；2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院，北京市100050；3.北德克薩斯大學(xué)醫(yī)學(xué)中心神經(jīng)與藥理系，美國(guó)德克薩斯州沃思堡76107。作者簡(jiǎn)介：徐立新(1966-)，女，漢族，北京市人，主管技師，主要研究方向：神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)疾病基礎(chǔ)研究。通訊作者：董麗萍，女，研究員。E-mail:d08270827@163.com。