沉默ski基因對大鼠星形膠質細胞活化增殖及Cyclin D1表達的影響①

趙鑫，郭永強，寇江力，丁寧，周開升，南偉，張海鴻

沉默ski基因對大鼠星形膠質細胞活化增殖及Cyclin D1表達的影響①

趙鑫1,2，郭永強1,2，寇江力1,2，丁寧1,2，周開升1,2，南偉1,2，張海鴻1

目的 研究ski基因對大鼠星形膠質細胞增殖的影響及其分子機制。方法 分離3日齡Sprague-Dawley大鼠腦皮質星形膠質細胞，體外培養(yǎng)。合成ski和陰性對照小干擾片段。設置ski-siRNA組、陰性對照組和空白對照組，采用脂質體法將特異性針對ski基因的siRNA和陰性對照siRNA轉入ski-siRNA組、陰性對照組星形膠質細胞中。Western blotting分析ski、膠質纖維酸性蛋白(GFAP)和Cyclin D1蛋白表達；CCK8法檢測星形膠質細胞增殖活力；流式細胞儀檢測細胞周期。結果 ski-siRNA組星形膠質細胞ski蛋白表達明顯降低(F=38.611,P＜0.01)，GFAP(F=7.547,P＜0.05)和Cyclin D1蛋白(F=3.901,P＜0.05)表達降低；培養(yǎng)12 h后，ski-siRNA組增殖活力明顯降低(F＞30.507,P＜0.01)，G1期細胞比例明顯增加，S期明顯減少(F＞48.425,P＜0.01)。結論 沉默ski基因可能通過下調Cyclin D1表達，抑制星形膠質細胞增殖。

ski；RNA干擾；增殖；星形膠質細胞；大鼠

ski基因是Stavnezer等[1]于1986年首次在感染病毒Bratislava77的雞胚細胞中發(fā)現的。ski作為細胞內的一個原癌基因，在不同物種間和組織內分布極為廣泛，參與并調節(jié)機體多種生理和病理過程[2-4]。本課題組已明確ski在正常脊髓組織和星形膠質細胞中表達很低，而在脊髓損傷和活化星形膠質細胞中表達逐漸增高，推測ski可能作為新型信號分子影響星形膠質細胞的增殖特性，進而調節(jié)致密膠質瘢痕的生成[5-7]。本研究采用RNA干擾技術，觀察ski對大鼠星形膠質細胞增殖及其相關蛋白的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和主要試劑

3日齡Sprague-Dawley大鼠，購于甘肅省中醫(yī)藥大學動物實驗中心。

DMEM/F12培養(yǎng)基、胰蛋白酶：GIBCO公司。胎牛血清(FBS)：PAN-BIOTECH GMBH公司。TritionX-100、SDS、小鼠抗大鼠及兔抗大鼠神經膠質纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)多克隆抗體(G3893)：SIGMA公司。RIPA裂解液和BCA蛋白定量檢測試劑盒：碧云天公司。加兔抗大鼠ski多克隆抗體(H-329,sc-9140)、小鼠抗大鼠Cyclin D1多克隆抗體(A-12,sc-8396)：SANTA CRUZ。ski干擾RNA及陰性對照：THERMOFISHER公司合成。Lipofectamine?RNAiMAX Reagent：THERMOFISHER 公司。小鼠抗大鼠β-actin單克隆抗體：PROTEINTECH公司。山羊抗小鼠lgG、FITC標記山羊抗兔lgG、PI、Rnase、山羊封閉血清、PVDF 膜(0.45 μm)：SOLARBIO公司。辣根過氧化物酶標記山羊抗兔或抗小鼠lgG：北京中杉金橋公司。CCK8試劑盒：日本同仁化學公司。ECL試劑盒：MILLOPORE公司。

1.2 方法

1.2.1 原代大鼠星形膠質細胞的培養(yǎng)、純化和鑒定

3日齡Sprague-Dawley乳鼠，提取大腦皮質星形膠質細胞，具體操作步驟參見文獻[3,7]。

1.2.2 細胞純度鑒定

將原代細胞接種到蓋玻片上，貼壁后PBS洗滌，多聚甲醛固定30 min，PBS洗滌，TritionX-100通透20 min，PBS洗滌；滴加山羊封閉血清，37℃封閉30 min；吸凈封閉液，勿洗，加入小鼠抗大鼠GFAP多克隆抗體(1∶300)，玻片置于濕盒中，于4℃冰箱中孵育過夜。PBS洗滌，避光下加山羊抗小鼠lgG(1∶300)，37℃溫箱中避光孵育90 min，PBS洗滌，避光下附加DAPI，室溫孵育20 min，PBS洗滌。各步PBS洗滌均為2遍。甘油封片。熒光顯微鏡下觀察。陰性對照用PBS代替一抗。

在200倍視野下隨機選取6個互不重疊的視野，計數GFAP陽性細胞數和總細胞數，陽性細胞數占總細胞數達96%以上的星形膠質細胞集落用于后續(xù)實驗。

1.2.3 siRNA轉染

轉染前1 d，取純化后呈對數生長期的星形膠質細胞，2×105/ml接種于6孔板。用含12%胎牛血清的DMEM/F12完全培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜，待細胞匯合度為80%時，行siRNA轉染，具體步驟按siRNA轉染試劑盒說明書提供的方法。待細胞轉染72 h后，倒置光學顯微鏡下觀察細胞形態(tài)學變化，提取細胞總蛋白，Western blotting檢測沉默效果。

siRNA轉染效率的檢測：將FITC-control-siRNA(終 濃 度 100 nmol/L)6 μl 與 siRNA Lipofectamine?RNAiMAX Reagent 8 μl混勻后，轉染星形膠質細胞；12 h后在熒光顯微鏡下計數出現綠色熒光的細胞數。轉染效率(%)=熒光細胞數/細胞總數×100%。

細胞分為3組：ski-siRNA組采用siRNA Lipofectamine?RNAiMAX Reagent將ski-siRNA轉入星形膠質細胞，陰性對照組采用siRNA Lipofectamine?RNAiMAX Reagent將陰性對照-siRNA(negative control-siRNA,NC-siRNA)轉入星形膠質細胞，空白對照組僅加入siRNALipofectamine?RNAiMAX Reagent。

ski-siRNA正義鏈序列為5'-GCC CUG AUU CGA GAC AGC UUC UAC U-3'，反義鏈序列為5'-AGU AGA AGC UGU CUC GAA UCA GGG C-3'；NC-siRNA正義鏈序列為5'-UUG UGG CCU GUU AGC UUC AGA GCG A-3'，反義鏈序列為5'-UCG CUC UGA AGC UAACAG GCCACAA-3'。

1.2.4 Western blotting

收集轉染72 h后各組細胞，用預冷PBS清洗細胞2遍，RIPA裂解液提取總蛋白，BCA試劑盒測定總蛋白濃度。10%SDS-PAGE電泳(濃縮膠90 V，分離膠120 V)，將電泳分離的蛋白電轉至甲醇浸透的PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，TBST(10 mmol/L Tris-HCI、150 mmol/L NaCI、0.5%Tween 20,pH=7.5)洗滌10 min，共3遍。加兔抗大鼠ski多克隆抗體(1∶100)、兔抗大鼠GFAP多克隆抗體(1∶2000)、小鼠抗大鼠Cyclin D1多克隆抗體(1∶500)、小鼠抗大鼠β-actin單克隆抗體(1∶5000)，4℃冰箱過夜；TBST洗膜，方法同前；加辣根過氧化物標記的山羊抗兔或抗小鼠lgG(1∶5000)，室溫2 h；TBST洗膜3次，方法同前；滴加ECL發(fā)光液，GE凝膠成像系統測量目的條帶的灰度值，計算目的蛋白與內參β-actin蛋白條帶的相對灰度。

1.2.5 CCK8檢測

收集轉染72 h后各組星形膠質細胞，胰蛋白酶消化，調整為1×104/ml單細胞懸液，接種于96孔板內，每孔100 μl，各組均設5個復孔；96孔板周圍加PBS液100 μl保持濕度。細胞培養(yǎng)箱(37℃、5%CO2)內培養(yǎng)。分別在細胞貼壁后0 h、6 h、12 h、24 h、48 h，向相應培養(yǎng)板中加入CCK8試劑，再將孔板重新放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)，2 h后終止顯色，酶聯免疫檢測儀上測量對應孔中細胞在450 mm波長處的吸光度值(OD)。

1.2.6 流式細胞儀分析

PBS洗滌各組星形膠質細胞，0.25%胰蛋白酶消化，PBS吹打制成細胞懸液。1000 r/min離心5 min，棄上清，預冷PBS洗滌2次；PBS 1 ml重懸，邊震蕩邊滴入預冷的75%乙醇中，4℃冷藏過夜。重復洗滌和離心收集細胞2次，預冷PBS 1 ml重懸，加入EDTA 190 μl和 10 mg/ml RNase 10 μl，室溫5 min，加入PI染液，4℃避光反應10 min，目篩過濾到上樣管，上機檢測細胞周期各階段細胞數。

圖1 星形膠質細胞純度鑒定(GFAP免疫熒光染色,200×)

圖2 轉染前后細胞形態(tài)

1.3 統計學分析

采用SPSS 21.0統計軟件進行分析。每組數據來自3次獨立實驗，以(xˉ±s)表示，采用單因素方差分析。顯著性水平α=0.05。

2 結果

2.1 純度鑒定

熒光顯微鏡下可見星形膠質細胞形態(tài)學特征，胞核呈圓形或橢圓形。陽性細胞數占總細胞數96%，符合設計要求。特異性標記抗原GFAP位紅色熒光，DAPI標記細胞核為藍色熒光，均清晰可辨(圖1)。

2.2 轉染后細胞形態(tài)

轉染前，星形膠質細胞呈貼壁生長，可見細胞輪廓清晰，突起較多，胞突間交叉連接明顯；胞體多數呈星狀或不規(guī)則狀，細胞核清晰，呈圓形或橢圓形，核仁明顯可見，細胞胞膜完整；轉染ski-siRNA 72 h后，可見星形膠質細胞體積較轉染前增大，胞突增粗，但細胞集落減少，未貼壁細胞增多，細胞碎片增多。轉染效率(86.71±4.18)%。見圖2。

2.3 Western blotting

ski-siRNA組ski相對灰度(0.130±0.065)，低于空白對照組(0.767±0.103)、NC-siRNA組(0.667±0.111)(F=38.611,P=0.001)，NC-siRNA組與空白對照組之間無顯著性差異(P=0.247)(圖3)。

ski-siRNA組GFAP相對灰度(0.193±0.044)，低于空白對照組(0.449±0.108)、NC-siRNA組(0.393±0.089)(F=7.547,P=0.023)(圖3)。

ski-siRNA組Cyclin D1相對灰度(0.088±0.053)，低于空白對照組(0.265±0.101)、NC-siRNA組(0.234±0.087)(F=3.901,P=0.023)。NC-siRNA組與空白對照組之間無顯著性差異(P=0.666)(圖3)。

圖3 Western blotting條帶圖

2.4 CCK-8

ski-siRNA組培養(yǎng)12 h后，OD值均明顯低于空白對照組和NC-siRNA組(P＜0.01)。見表1。

2.5 流式細胞儀分析

ski-siRNA組G1期細胞百分比為(79.62±1.04)%，明顯高于空白對照組(71.02±1.53)%、NC-siRNA組(71.69±1.09)%(F=48.425,P=0.002)；ski-siRNA組S期細胞百分比為(12.47±0.84)%，明顯低于空白對照組(17.20±2.26)%、NC-siRNA組(16.87±1.69)%(F=83.343,P=0.001)。見圖4。

3 討論

ski作為進化保守蛋白，在不同物種中廣泛參與并調節(jié)多種細胞的增殖及分化等過程[4]。研究表明，ski與多種細胞的增殖、分化、轉化及腫瘤發(fā)生發(fā)展相關[9-11]。目前關于ski分子的調控研究主要集中在胚胎發(fā)育、組織創(chuàng)傷修復及對腫瘤細胞發(fā)生發(fā)展的調節(jié)等方面[4]。我們前期實驗首次證實，ski在星形膠質細胞生物功能方面起一定作用[6-8]。

星形膠質細胞是中樞神經系統(central nervous system,CNS)中數量最多、分布最廣的膠質細胞，對神經遞質調節(jié)、內環(huán)境穩(wěn)態(tài)、血腦屏障的維持起著重要作用[7,12-13]?；罨切文z質細胞增生早期可分泌某些神經元營養(yǎng)因子，對維持和促進神經元生長、發(fā)育、分化具有重要作用[14-15]；晚期形成膠質瘢痕，可作為物理屏障，妨礙軸突的再生、延長[16-17]。膠質瘢痕的形成是影響CNS損傷后功能恢復的重要因素，而膠質瘢痕的形成與星形膠質細胞增殖特性密不可分。

表1 各組星形膠質細胞增殖活力比較(OD)

圖4 各組細胞周期G1期和S期百分比(流式細胞儀)

siRNA是一種高效、特異的基因沉默技術，能與目的基因mRNA的同源序列互補結合，使整條mRNA失去翻譯成蛋白質的功能[18]。本研究采用siRNA技術，將特異針對ski序列的siRNA轉染大鼠星形膠質細胞，Western blotting顯示轉染后星形膠質細胞ski基因成功沉默。沉默ski基因后，星形膠質細胞增殖能力明顯被削弱，證明ski在促進星形膠質細胞增殖方面起重要作用。

此前研究顯示，ski與GFAP之間存在一定的關聯[6]，而GFAP作為星形膠質細胞活化特有標志蛋白，參與星形膠質細胞生物學活性的調節(jié)，我們推測ski可能調控星形膠質細胞的生物學活性。本研究顯示，ski-siRNA轉染后，細胞GFAP表達水平與ski表達水平同時下調。結合CCK8結果，證實ski在星形膠質細胞活化、增殖等方面起重要作用。

細胞分裂中，從G1到S期的過渡是調節(jié)細胞周期的主要作用節(jié)點[19-20]。G1期細胞處于DNA合成階段，尚未開始分裂，而S期細胞處于DNA復制合成和分裂階段[21]。本研究表明，ski-siRNA組較多細胞停留于G1期，而S期細胞比例降低。

有研究指出[22-25]，細胞周期G1期進程主要由D型Cyclin-Cdk4細胞周期調節(jié)子支配。本研究顯示，沉默ski基因后，Cyclin D1表達顯著下調。推測ski可能通過促進Cyclin D1的表達，調節(jié)星形膠質細胞DNA復制、合成與細胞分裂，進而促進星形膠質細胞增殖。

綜上所述，采用ski-siRNA技術可以成功沉默ski基因；沉默ski基因后，星形膠質細胞活化增殖能力明顯抑制，此作用可能通過下調Cyclin D1的表達實現。由于ski下游通路機制非常復雜，具體分子機制尚需進一步研究。

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Effects of Knocking Down ski on Proliferation ofAstrocytes and Expression of Cyclin D1 in Rats

ZHAO Xin1,2,GUO Yong-qiang1,2,KOU Jiang-li1,2,DING Ning1,2,ZHOU Kai-sheng1,2,NAN Wei1,2,ZHANG Hai-hong1
1.Department of Orthopedics,Second Clinical Medical College of Lanzhou University,Lanzhou,Gansu 730030,China;2.Key Laboratory of Orthopedics of Gansu Province,Lanzhou,Gansu 730030,China

ZHANG Hai-hong.E-mail:zhanghaihong1968@sina.com

Objective To investigate the role of ski in proliferation of astrocytes and the molecular mechanisms in rats.Methods Astrocytes were obtained from cerebral cortex of a three-day old rat and cultured in vitro.siRNA targeted to ski and negative control sequences were prepared.The astrocytes were divided into ski-siRNA group,siRNA negative control group and untreated control group,while the specific siRNA targeting ski negative control sequences were transfected into astrocytes with Lipofectamine?RNAiMAX Reagent.The protein levels of ski,glial fibrillary acidic protein(GFAP)and Cyclin D1 were determined with Western blotting.The proliferation of astrocytes were measured with CCK8 assay.The cell-cycle of astrocytes were analyzed with flow cytometer.Results The protein level of ski(F=38.611,P＜0.01),GFAP(F=7.547,P＜0.05)and Cyclin D1(F=3.901,P＜0.05)reduced in ski-siRNA group,the proliferation of astrocyte was significantly inhibited since twelve hours after culture(F＞30.507,P＜0.01),and less cells were in S phase and more in G1/G0 phase(F＞48.425,P＜0.01),compared with the control groups.Conclusion ski knocking down by siRNAsignificantly inhibits the proliferation of astrocytes,which may associate with the down-regulation of Cyclin D1 expression.

ski;small interfering RNA;proliferation;astrocyte;rats

R338.2

A

1006-9771(2017)09-1032-05

2017-05-25

2017-06-22)

10.3969/j.issn.1006-9771.2017.09.009

[本文著錄格式] 趙鑫，郭永強，寇江力，等.沉默ski基因對大鼠星形膠質細胞活化增殖及Cyclin D1表達的影響[J].中國康復理論與實踐,2017,23(9):1032-1036.

CITED AS:Zhao X,Guo YQ,Kou JL,et al.Effects of knocking down ski on proliferation of astrocytes and expression of Cyclin D1 in rats[J].Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian,2017,23(9):1032-1036.

1.國家自然科學基金項目(No.30772299)；2.蘭州大學第二醫(yī)院科研基金項目(No.sdkyjj-04)。

1.蘭州大學第二醫(yī)院骨科，甘肅蘭州市730030；2.甘肅省骨關節(jié)疾病研究重點實驗室，甘肅蘭州市730030。作者簡介：趙鑫(1991-)，男，漢族，山東濰坊市人，碩士研究生，主要研究方向：脊柱脊髓損傷。通訊作者：張海鴻，主任醫(yī)師，副教授，碩士研究生導師，主要研究方向：脊柱外科。E-mail:zhanghaihong1968@sina.com。