大鼠陰道上皮細(xì)胞體外培養(yǎng)研究進展

盧偉++祁文瑾

摘要：外陰陰道假絲酵母菌?。╒VC）是由假絲酵母菌引起的機會性真菌感染，約5%～10%的VVC患者可因病情反復(fù)發(fā)作成為復(fù)發(fā)性外陰陰道假絲酵母菌病（RVVC）患者。目前認(rèn)為免疫異常是導(dǎo)致RVVC的主要因素，確切機制不明。大鼠陰道上皮細(xì)胞的體外培養(yǎng)為該病免疫機制的研究提供更多可能，其培養(yǎng)方法主要有組織塊法和酶消化法，一般認(rèn)為酶消化法優(yōu)于組織塊法。動情前期和動情期體外培養(yǎng)獲得的大鼠陰道上皮細(xì)胞數(shù)比動情后期和動情間期多，但尚未形成一致的結(jié)論。細(xì)胞培養(yǎng)基成分也日漸完善，本文就大鼠陰道上皮細(xì)胞體外培養(yǎng)的研究進展做一綜述。

關(guān)鍵詞：復(fù)發(fā)性外陰陰道假絲酵母菌病；陰道上皮；大鼠；細(xì)胞培養(yǎng)

中圖分類號：R711.31 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1006-1959（2017）19-0022-03

Research Progress of Vaginal Epithelial Cells of Rat Cultured in Vitro

LU Wei，QI Wen-jin

（Department of Obstetrics and Gynecology，the First Affiliated Hospital of Kunming Medical University，Kunming 650000，Yunnan，China）

Abstract：Vulvovaginal candidiasis（VVC）is an opportunistic fungal infection caused by Candida，about 5% to 10% of VVC patients may be recurrent as a result of recurrent vulvovaginal candidiasis（RVVC）patient.At present，the immune abnormalities are the main factors leading to RVVC，the exact mechanism is unknown.In vitro culture of rat vaginal epithelial cells provides more possibilities for the study of the immune mechanism of the disease. The culture method is mainly composed of tissue block method and enzyme digestion method.It is generally believed that the enzymatic digestion method is superior to the tissue block method.The number of vaginal epithelial cells in the prenatal and estrous stage was higher than that in the late stage and the estrous stage，but the conclusion was not yet reached.Cell culture medium components are increasingly perfect.In this paper，we reviewed the progress in the study of vaginal epithelial cells in vitro.

Key words：Recurrent vulvovaginal candidiasis；Vaginal epithelium；Rat；Cell culture

外陰陰道假絲酵母菌?。╲ulvovaginal candidiasis，VVC）是由假絲酵母菌感染引起的外陰陰道炎癥，在陰道感染中居第2位，僅次于細(xì)菌性陰道炎[1]。據(jù)資料統(tǒng)計，70%～75%的女性一生中至少患VVC 1次，其中40%～50%患有VVC的女性會有復(fù)發(fā)感染，5%～10%的女性一年內(nèi)發(fā)作4次或4次以上而成為復(fù)發(fā)性假絲酵母菌外陰陰道炎（recurrent vulvovaginal candidiasis，RVVC）[2]。目前認(rèn)為陰道局部免疫功能異常是導(dǎo)致RVVC的主要因素，但是確切發(fā)病機制尚不清楚。大鼠陰道上皮細(xì)胞的體外培養(yǎng)為該病免疫機制的研究提供更多可能，其培養(yǎng)方法主要有組織塊法和酶消化法，國內(nèi)外許多學(xué)者對這兩種方法均有研究，一般認(rèn)為酶消化法優(yōu)于組織塊法[3-4]，動情前期和動情期體外培養(yǎng)獲得的大鼠陰道上皮細(xì)胞數(shù)比動情后期和動情間期多[4-5]，但因研究報道極少，尚不能得出確切結(jié)論，何種培養(yǎng)基成分更適宜大鼠陰道上皮細(xì)胞體外培養(yǎng)也待進一步研究證實，本文就大鼠陰道上皮細(xì)胞體外培養(yǎng)的相關(guān)研究進展綜述如下。

1 培養(yǎng)方法

1.1組織塊培養(yǎng)法

組織塊培養(yǎng)法是大鼠陰道上皮細(xì)胞的傳統(tǒng)培養(yǎng)方法，其基本過程包括麻醉、解剖、培養(yǎng)材料的準(zhǔn)備、接種、置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)等步驟，李雅釵等用組織塊法原代培養(yǎng)大鼠陰道上皮細(xì)胞，結(jié)果顯示組織塊法操作簡單，技術(shù)容易掌握，成功率高，但細(xì)胞爬出慢，效率低，原代培養(yǎng)周期時間長，一般需要數(shù)周時間，由于未分離上皮層與固有層，在上皮細(xì)胞生長的同時，常伴有成纖維細(xì)胞的混雜生長，且其傳代培養(yǎng)成功率低，故在大鼠陰道上皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)中應(yīng)用逐漸減少。

1.2酶消化法

酶消化法的基本過程包括麻醉、解剖、取材、酶消化、中和、清洗、重懸、加入培養(yǎng)基、置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)等步驟，雖然存在較難掌握酶消化時間、對細(xì)胞損傷大、操作繁瑣、費用高等缺點，但由于其培養(yǎng)周期較短，而且可針對上皮細(xì)胞選擇相應(yīng)特異性酶，短時間內(nèi)獲取大量純度高的細(xì)胞，減少成纖維細(xì)胞的混雜，逐漸被廣泛應(yīng)用于上皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)。endprint

酶消化法最常用的消化酶有膠原酶，胰酶和中性蛋白酶（Dispase），這些酶既有單獨使用，又有聯(lián)合使用：①膠原酶：培養(yǎng)陰道上皮細(xì)胞常用的膠原酶包括Ⅰ型膠原酶、Ⅱ型膠原酶和Ⅳ型膠原酶。膠原酶的消化作用針對性較強，Ⅰ型型膠原酶僅對細(xì)胞間質(zhì)有消化作用而對上皮細(xì)胞影響不大，可使上皮細(xì)胞與膠原成分分離而不受損。故膠原酶應(yīng)與其他酶聯(lián)合消化細(xì)胞，不宜單獨使用。②胰酶：胰酶可分解細(xì)胞膜表面蛋白質(zhì)，增加細(xì)胞通透性，而且細(xì)胞粘附相關(guān)的蛋白質(zhì)也可能被消化，從而達(dá)到分離效果，獲得單個細(xì)胞或細(xì)胞團。但若消化時間過長容易造成細(xì)胞損傷。對此，劉方方[5]將胰酶消化方法改進為3步消化法，加0.25%胰酶，37 ℃消化10 min，吸管吹打，吸出的懸液用含10% FBS的DMEM/F12 終止消化，剩余組織再加0.25%胰酶消化，重復(fù)3次。結(jié)果該法獲得的細(xì)胞數(shù)高于一步消化法（直接消化20～30 min），但無顯著性差異。在首次換液時貼壁細(xì)胞數(shù)三步法高于一步法，有顯著性差異，結(jié)果提示減少酶對細(xì)胞的消化作用時間，可以保持細(xì)胞的完整性和活性。因此，采用胰酶短時間多次消化終止的方法，可以避免胰酶對細(xì)胞的過度消化，從而降低對細(xì)胞的損傷。③中性蛋白酶：中性蛋白酶（Dispase）是從多粘芽孢桿菌中提取的金屬蛋白酶，可被EDTA、EGTA、Hg和其他重金屬抑制，屬于氨基酸肽鏈內(nèi)切酶。該酶被證實能快速且溫和地來獲得正常的二倍體細(xì)胞和細(xì)胞系。李亞楠[4]用Dispase酶和胰酶分步消化大鼠陰道上皮，用KBM配制的 DispaseⅡ消化后48 h貼壁細(xì)胞多于用 PBS 配制的DispaseⅡ；1.2 U/ml DispaseⅡ的分離結(jié)果評分及可獲活細(xì)胞數(shù)高于 0.6 U/ml DispaseⅡ。另外，該酶能夠選擇性分解基底膜的纖維連接素和Ⅳ型膠原，破壞半橋粒結(jié)構(gòu)。對橋粒結(jié)構(gòu)作用很少，故Dispase作用于上皮層和固有層連接部位，完整地分離出上皮層而不分解單個細(xì)胞，更好地保留基底細(xì)胞層和上皮細(xì)胞的完整性和活性，與胰酶聯(lián)合使用可獲取更多的增殖細(xì)胞，且冷消化法（4 ℃）效果優(yōu)于其他消化法，同時也解決了成纖維細(xì)胞污染的問題。

2 培養(yǎng)基

目前研究報道常用的上皮細(xì)胞培養(yǎng)基包括1640、DMEM、DMEM/F12、K-SFM、DK-SFM、EPLIFE和KGM[6-10]，國外陰道上皮細(xì)胞培養(yǎng)使用最多的培養(yǎng)基為K-SFM，國內(nèi)多使用DK-SFM和KGM，均可成功培養(yǎng)出大鼠陰道上皮細(xì)胞。 在含血清的培養(yǎng)基中，成纖維細(xì)胞生長優(yōu)勢大于上皮細(xì)胞，導(dǎo)致細(xì)胞純度不夠，且血清有促進細(xì)胞分化的作用，使上皮細(xì)胞易于老化，角質(zhì)形成細(xì)胞無血清培養(yǎng)基（K-SFM）不含有血清，能有效地減少混雜在上皮細(xì)胞中的纖維細(xì)胞生長，適合各種角化上皮細(xì)胞的培養(yǎng)，并可根據(jù)需要添加不同成份：如抗生素、胰島素和表皮生長因子等[8]；此外，當(dāng)鈣離子濃度升至1.0 mmol/L時，上皮細(xì)胞容易發(fā)生分化。研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞外低濃度鈣促進角質(zhì)形成細(xì)胞增生；高濃度鈣促進角質(zhì)形成細(xì)胞分化、細(xì)胞間黏附[11]。K-SFM具有合適的低鈣離子濃度（0.05～0.15 mmol/L），可保持上皮細(xì)胞不分化而處于增殖狀態(tài)[9]。但近年國內(nèi)不允許進口K-SFM，以改良型角質(zhì)形成細(xì)胞無血清培養(yǎng)基（DK-SFM）為其替代培養(yǎng)基，DK-SFM除了supplement和K-SFM不一樣以外，其他成分都與K-SFM一樣，但由于該培養(yǎng)基的 supplement成分中的牛腦垂體提取物（bovine pituitary extract，BPE）是人工合成的確定成分，而非天然成分，可能會影響培養(yǎng)效果。KGM為角質(zhì)化細(xì)胞生長專用培養(yǎng)基，是無血清培養(yǎng)基，基礎(chǔ)培養(yǎng)基中不含生長因子和補充營養(yǎng)物，需配套添加角質(zhì)化細(xì)胞生長因子群（Keratinocyte growth factors），其含有牛垂體提取液、胰島素、表皮生長因子、氫化可的松、腎上腺素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、慶大霉素和兩性霉素B等[10]。EPLIFE本身含有牛垂體提取液、胰島素、表皮生長因子，氯化鈣為獨立包裝，可根據(jù)不同細(xì)胞培養(yǎng)需要自行添加，大量應(yīng)用于角質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)，有研究將其應(yīng)用于小鼠陰道上皮細(xì)胞培養(yǎng)且效果良好，是否可以EPLIFE替代K-SFM用于大鼠陰道上皮細(xì)胞培養(yǎng)還需進一步研究。

3 動情周期

陰道黏膜為復(fù)層鱗狀上皮，且受到內(nèi)分泌系統(tǒng)的影響而呈周期性改變。不同時期的陰道分泌物涂片的特點不同：動情前期大多數(shù)為橢圓形的有核上皮細(xì)胞，偶見少量角化細(xì)胞。動情期絕大多數(shù)為外形不規(guī)則的角化上皮細(xì)胞，呈“落葉狀”堆積或相互連接成片，間有少量有核上皮細(xì)胞。動情后期不規(guī)則角化上皮細(xì)胞、有核上皮細(xì)胞和白細(xì)胞均可見，且比例相當(dāng)。動情間期為大量白細(xì)胞及少量有核上皮細(xì)胞粘液。有研究發(fā)現(xiàn)根據(jù)陰道涂片取動情前期，動情期，動情后期，動情間期大鼠陰道組織塊分離及培養(yǎng)。發(fā)現(xiàn)動情前期，動情期的組織塊上皮層較動情后期及動情間期厚，且動情前期和動情期的組織塊較動情后期及間期獲得更多的上皮細(xì)胞。但動情期分離出的多邊形角化細(xì)胞較多，細(xì)胞活性降低，故在動情前期取陰道上皮可分離更多上皮層，能獲得較多的活細(xì)胞[4-5]。因研究報道少，尚不能得出確切結(jié)論。

4 包被

陰道上皮細(xì)胞體外培養(yǎng)均存在上皮層獲得有限、細(xì)胞貼壁不佳甚至不貼壁等問題，因此，李亞楠[4]嘗試用纖連蛋白/Ⅰ型膠原（FN/C）及去離子水包被培養(yǎng)瓶后培養(yǎng)大鼠陰道上皮細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)FN/C 包被液處理的培養(yǎng)瓶相比去離子水可以獲得更多的貼壁細(xì)胞。因而認(rèn)為，在原代培養(yǎng)大鼠陰道上皮細(xì)胞時用FN/C等包被的培養(yǎng)瓶可以獲得更多的貼壁細(xì)胞。纖連蛋白是細(xì)胞外基質(zhì)一種高分子量糖蛋白（約440 kDa），它結(jié)合跨膜受體蛋白整合素，可以結(jié)合細(xì)胞外基質(zhì)成分如膠原蛋白、纖維蛋白和硫酸乙酰肝素蛋白聚糖等，它的肽鏈分成細(xì)胞粘附區(qū)和膠原粘附區(qū)，它能促進細(xì)胞在塑料培養(yǎng)表面的附著，同時也能促進細(xì)胞粘附到膠原上，故纖連蛋白在細(xì)胞粘附、生長、遷移和分化中起著非常重要的作用。endprint

綜上所述，現(xiàn)有體外培養(yǎng)大鼠陰道上皮細(xì)胞方法各有優(yōu)缺點，組織塊培養(yǎng)法為經(jīng)典且基礎(chǔ)的培養(yǎng)法，其操作簡單，成功率高，且成本較低，但培養(yǎng)周期長；酶消化法培養(yǎng)周期短，可在短時間內(nèi)獲得大量純度較高的細(xì)胞用于實驗研究，優(yōu)于組織法，使用較為廣泛，但除了胰酶、膠原酶和中性蛋白酶應(yīng)用比較成熟外，其它酶類很少深入研討。培養(yǎng)基成分尚待進一步完善，以模擬細(xì)胞體內(nèi)生長環(huán)境，為更深層次的研究提供基礎(chǔ)。對于動情周期的選取與陰道上皮細(xì)胞培養(yǎng)的關(guān)系目前研究極少，仍需進一步研究探討其意義。培養(yǎng)瓶包被技術(shù)的應(yīng)用一定程度上解決了細(xì)胞貼壁困難的問題。

參考文獻(xiàn)：

[1]Zhang Jie-Yu，Liu Jin-Hui，Liu Fa-Di，et al.Vulvovaginal candidiasis：species distribution，fluconazole resistance and drug efflux pump gene overexpression[J].Mycoses，2014，57（10）：584.

[2]Rathod S D，Buffler P A.Highly-cited estimates of the cumulative incidence and recurrence of vulvovaginal candidiasis are inadequately documented[J].Bmc Womens Health，2014，14（1）：1-4.

[3]李雅釵，黃向華，張明樂.聚乳酸-聚羥基乙酸/Ⅰ型膠原復(fù)合支架的生物相容性研究[J].中國修復(fù)重建外科雜志，2015（9）：1144-1149.

[4]李亞楠.陰道上皮細(xì)胞體外誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向上皮細(xì)胞分化的研究[D].河北醫(yī)科大學(xué)，2013.

[5]劉方方，李亞楠，黃向華.大鼠陰道黏膜上皮細(xì)胞原代分離及培養(yǎng)方法的改進[J].現(xiàn)代婦產(chǎn)科進展，2013，22（6）：465-468.

[6]Haseeb M A，Agrawal R，F(xiàn)ried B.Reduced [14C]-methionine uptake and fecundity in Schistosoma mansoni females treated with recombinant tumor necrosis factor α in vitro[J].Acta Parasitologica，2017，62（1）：164-170.

[7]Li X，Liu X，Yu S.Psychological Stress-Derived Prolactin Modulates Occludin Expression in Vaginal Epithelial Cells to Compromise Barrier Function[J].Cell Physiol Biochem，2015，37（1）：153-161.

[8]Liu Y Z，Wang T T，Zhang Y Z.A modified method for the culture of naturally HPV-infected high-grade cervical intraepithelial neoplasia keratinocytes from human neoplastic cervical biopsies[J].Oncology Letters，2016，11（2）：1457-1462.

[9]Loureiro R R，Cristovam P C，Martins C M，et al.Comparison of culture media for ex vivo cultivation of limbal epithelial progenitor cells[J].Molecular Vision，2013，19（1）：69-77.

[10]Li Y，Liu F，Zhang Z，et al.Bone marrow mesenchymal stem cells could acquire the phenotypes of epithelial cells and accelerate vaginal reconstruction combined with small intestinal submucosa[J].Cell Biology International，2015，39（11）：1225-1233.

[11]Bikle D D，Xie Z，Tu C L.Calcium regulation of keratinocyte differentiation[J].Expert Review of Endocrinology& Metabolism，2012，7（4）：461-472.編輯/成森endprint