香菇胞外多糖高產(chǎn)菌株的紫外誘變選育

黃曼曼+喬帥 王夢(mèng)姣++鄧百萬(wàn)++陳文強(qiáng)

doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2017.13.059[HT9.]

摘要：以香菇808#為出發(fā)菇，采用紫外輻射誘變處理其孢子，通過(guò)拮抗試驗(yàn)，篩選出與親本菌株有較明顯拮抗線的誘變菌株，并測(cè)定其香菇胞外多糖含量。結(jié)果表明，通過(guò)篩選，獲得20個(gè)誘變菌株產(chǎn)胞外多糖高于親本菌株，其中誘變菌株YBS21的胞外多糖含量相對(duì)較高，為1.34 g/L，比親本菌株高42.6%；經(jīng)10代培養(yǎng)，菌株YBS21的胞外多糖含量為1.33 g/L，高產(chǎn)胞外多糖遺傳性狀較為穩(wěn)定。

關(guān)鍵詞：香菇；紫外誘變；拮抗；胞外多糖；菌株YBS21

中圖分類號(hào)： S182文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A[HK]

文章編號(hào)：1002-1302（2017）13-0222-04[HS）][HT9.SS]

收稿日期：2016-12-19

基金項(xiàng)目：陜西省科技創(chuàng)新工程項(xiàng)目（編號(hào)：2016HBGC-07）。

作者簡(jiǎn)介：黃曼曼（1991—），女，寧夏銀川人，碩士研究生，從事微生物資源保育研究。E-mail：765447467@qq.com。

通信作者：鄧百萬(wàn)（1963—），男，陜西眉縣人，教授，主要從事微生物資源保護(hù)與開發(fā)利用研究。E-mail：2210309868@qq.com。

[ZK）]

香菇（Lentinus edodes）別稱花菇、香菌、中國(guó)蘑菇，真菌分類中屬層菌綱擔(dān)子菌亞綱傘菌目口蘑科香菇屬[1]。我國(guó)是香菇的原生地及優(yōu)產(chǎn)區(qū)，主產(chǎn)于河南、山東、福建、浙江等省。香菇不僅香味獨(dú)特、味道鮮美，且具有抗菌抗病毒、防治腫瘤、增強(qiáng)人體免疫力、降血脂等多種藥用價(jià)值[2]。香菇的主要成分為香菇多糖，而從香菇子實(shí)體中直接提取香菇多糖的生產(chǎn)周期相對(duì)較長(zhǎng)、成本較高。菌種選育常用方法有紫外誘變、化學(xué)誘變、原生質(zhì)體融合、代謝工程育種等。紫外誘變是一種傳統(tǒng)而經(jīng)典的微生物菌種選育技術(shù)，對(duì)原生質(zhì)體紫外誘變有較多研究且成果豐碩，而直接對(duì)孢子進(jìn)行紫外誘變的相關(guān)研究較少。本試驗(yàn)采用紫外輻射對(duì)香菇孢子進(jìn)行誘變處理，通過(guò)拮抗試驗(yàn)對(duì)誘變菌株進(jìn)行初步鑒定，對(duì)產(chǎn)生拮抗線較明顯的誘變菌株測(cè)定胞外多糖，以篩選出胞外多糖高產(chǎn)的誘變菌株。在此基礎(chǔ)上，利用香菇營(yíng)養(yǎng)菌絲液體發(fā)酵生產(chǎn)香菇多糖，不僅生產(chǎn)效率得到提高，而且生產(chǎn)成本有明顯降低。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1供試菌株香菇808#，由陜西省食藥用菌工程技術(shù)研究中心提供。

1.1.2培養(yǎng)基的配制綜合馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（CPDA 綜合培養(yǎng)基）：去皮馬鈴薯200.0 g，葡萄糖20.0 g，KH2PO4 5.0 g，MgSO4 3.0 g，蛋白胨5.0 g，維生素B1、維生素B2 各10.0 mg，瓊脂15.0 g，pH值自然，加水定容至 1 000.0 mL；CPDA液體培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯200.0 g，葡萄糖20.0 g，KH2PO4 5.0 g，MgSO4 3.0 g，蛋白胨5.0 g，維生素B1、維生素B2 各10.0 mg，pH值自然，加水定容至 1 000.0 mL；查氏培養(yǎng)基：水1 000 mL，NaNO3 2.0 g，F(xiàn)eSO4 001 g，MgSO4 0.5 g，K2HPO4 1.0 g，KCl 0.5 g，葡萄糖 30.0 g，瓊脂15.0 g。

1.1.3主要儀器及設(shè)備RV10基本型數(shù)顯旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，廣州儀科實(shí)驗(yàn)室技術(shù)有限公司生產(chǎn)；Sx-300型全自動(dòng)滅菌鍋，日本Tomy Digital Biology公司生產(chǎn)；UV-1750型紫外分光光度計(jì)，日本島津儀器公司生產(chǎn)；5PX-250B5H型生化培養(yǎng)箱，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司生產(chǎn)；ZHWY-B2112B型恒溫培養(yǎng)振蕩器，上海志城分析儀器制造有限公司生產(chǎn)；SW-CJ-2D型無(wú)菌潔凈工作臺(tái)，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司生產(chǎn)；DYCZ-22A型水平電泳儀，北京六一廠生產(chǎn)。

1.2誘變菌株的初篩

采用孢子彈射法[3-4]，將香菇子實(shí)體去除菌柄，移入無(wú)菌操作臺(tái)中，用0.1% HgCl2溶液表面消毒30 s，75%乙醇擦拭，無(wú)菌水沖洗2～3次；用無(wú)菌濾紙吸干表面水分，將其正放在培養(yǎng)皿上，蓋上玻璃鐘罩，置于有漫射光照射、20～26 ℃溫度下培養(yǎng)1～2 d；收集孢子，無(wú)菌水稀釋，制成104個(gè)孢子/mL的孢子懸浮液，4 ℃冰箱保存，備用；將孢子懸浮液適當(dāng)稀釋，吸取200 mL涂布于CPDA培養(yǎng)基中，共涂布60個(gè)，每10個(gè)為1組；在黑暗條件下，打開培養(yǎng)皿蓋，放入紫外燈功率為 15 W、已預(yù)熱15 min的紫外燈下分別照射0、30、60、90、120、150、180 s，照射位置與紫外燈垂直距離為30 cm；將平板用黑布包裹，黑暗避光、28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 d；將平板從黑布中取出，觀察記錄菌落數(shù)，統(tǒng)計(jì)致死率[5]，計(jì)算公式為：

致死率=（未經(jīng)誘變處理的菌落數(shù)-誘變處理的菌落數(shù)）/未經(jīng)誘變處理的菌落數(shù)×100%。

有研究表明，致死率達(dá)到70%～80%時(shí)的誘變效果相對(duì)最佳[6]。因此，根據(jù)測(cè)定結(jié)果選擇最佳誘變劑量。挑取單菌落純化培養(yǎng)，28 ℃培養(yǎng)10～15 d；采用拮抗反應(yīng)方法檢測(cè)誘變菌株：將親本菌株與誘變菌株接于同一個(gè)培養(yǎng)皿上，28 ℃培養(yǎng)10～15 d，觀察拮抗反應(yīng)；將產(chǎn)生拮抗線明顯的誘變菌株在培養(yǎng)皿中連續(xù)培養(yǎng)3～4代，觀察其穩(wěn)定性。

1.3產(chǎn)香菇多糖菌株的復(fù)篩

1.3.1多糖液體發(fā)酵取親本菌株與誘變菌株的菌塊各05 cm2，分別接種于含CPDA液體培養(yǎng)基300 mL的500 mL三角瓶中，靜置24 h，28 ℃ 160 r/min搖瓶振蕩發(fā)酵10 d；將發(fā)酵液抽濾除去菌絲體，剩余菌液備用[7]。

1.3.2香菇多糖含量的測(cè)定發(fā)酵液 3 000 r/min 離心，上清液直接進(jìn)行真空蒸發(fā)，濃縮至原體積的 1/5；乙醇分步沉淀，離心收集沉淀，烘干即得到胞外粗多糖[8]。采用蒽酮硫酸法測(cè)定粗多糖含量[9]：分析天平上準(zhǔn)確稱取0.100 0 g預(yù)先100 ℃干燥至恒質(zhì)量的分析純葡萄糖，蒸餾水溶解，定容至100 mL；分別取1、2、3、4、5 mL的葡萄糖溶液加入到50 mL容量瓶中，蒸餾水定容至50 mL，即得濃度分別為20、40、60、80、100 μg/mL的溶液，以蒸餾水為空白試劑；再稱取胞外粗多糖樣品0.100 0 g，加入到100 mL容量瓶中，蒸餾水溶解，定容搖勻；取2 mL粗多糖溶解液，加入到50 mL的容量瓶中，蒸餾水定容；分別取不同濃度的葡萄糖標(biāo)品和粗多糖樣品溶液各1 mL于試管中，加入濃度為2 mg/mL的蒽酮試劑4 mL，搖勻，迅速浸入冰水浴中冷卻；100 ℃沸水浴10 min，取出，用流動(dòng)水冷卻；以空白為參比，紫外分光光度計(jì)測(cè)定波長(zhǎng) 620 nm 處不同濃度葡萄糖標(biāo)品及粗多糖樣品的吸光度，得到葡萄糖質(zhì)量濃度對(duì)吸光度的線性回歸方程，計(jì)算香菇粗多糖的含量，公式為endprint

[JZ]多糖含量=（C×D×V）/m×100%。

式中，C為樣品濃度，g/mL；D為樣品稀釋倍數(shù)；V為樣品稀釋體積，mL；m為樣品溶解質(zhì)量，g。

1.3.3香菇多糖高產(chǎn)菌株的穩(wěn)定性試驗(yàn)將篩選出的高產(chǎn)香菇多糖誘變菌株經(jīng)10代傳代培養(yǎng)，測(cè)定每1代的香菇多糖，以檢測(cè)其產(chǎn)多糖的遺傳性狀穩(wěn)定性。

[HTK]1.4親本菌株與誘變菌株的菌落形態(tài)特征觀察及菌絲生長(zhǎng)速度測(cè)定[HT]

將篩選出的誘變菌株與親本菌株分別接種于查氏培養(yǎng)基上，28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15 d，觀察菌落顏色、隆起度、邊緣是否整齊、菌絲致密度等菌落形態(tài)特征，記錄菌絲每天的生長(zhǎng)速度，重復(fù)3次。

[HTK]1.5親本菌株與誘變菌株rDNA-ITS擴(kuò)增堿基序列分析[HT]

利用十六烷基三甲基溴化銨法（CTAB法）提取親本菌株與誘變菌株DNA，采用真菌通用引物 ITS1、ITS4擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系（50 μL）：2×Taq Master Mix 0.25 μL，10 μmol/L上、下游引物各2 μL，模板 DNA 1 μL，ddH2O 34.75 μL，10×buffer 5 μL，10 mmol/L dNTP 5 μL。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性 5 min；94 ℃變性1 min，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸 1 min，36個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。4 ℃保存，備用；PCR產(chǎn)物送上海生工生物工程有限公司測(cè)序，將親本菌株與誘變菌株測(cè)序結(jié)果進(jìn)行堿基序列比對(duì)，并提交NCBI，申請(qǐng)香菇菌株登錄號(hào)。

2結(jié)果與分析

2.1誘變菌株的初篩

2.1.1香菇孢子的紫外誘變效應(yīng)由圖1可見，隨紫外光照射時(shí)間的延長(zhǎng)，香菇菌株的菌落數(shù)不斷減少；紫外照射為0 s時(shí)，菌落數(shù)為28個(gè)；紫外照射分別為30、60、90、120、150、180 s 時(shí)，菌落數(shù)分別為15、12、8、6、3、0個(gè)，誘變致死率分別為46%、57%、71%、79%、89%、100%。因此，為獲得較高的正誘變率，試驗(yàn)選擇致死率為71%～79%、紫外光照射時(shí)間 90～120 s作為誘變條件[10]。

[FK（W11][TPWMM11.tif][FK）]

2.1.2誘變菌株的檢出結(jié)果表明，誘變菌株中，39個(gè)誘變菌株與親本菌株中間有較明顯的拮抗線（圖2），分別為誘變菌株YBS1、YBS2、YBS3、YBS4、YBS5、YBS6、YBS7、YBS8、YBS9、YBS10、YBS11、YBS12、YBS13、YBS14、YBS15、YBS16、YBS17、YBS18、YBS19、YBS20、YBS21、YBZ1、YBZ2、YBZ3、YBZ4、YBZ5、YBZ6、YBZ7、YBZ8、YBZ9、YBZ10、YBZ11、YBZ12、YBZ13、YBZ14、YBZ15、YBZ16、YBZ17、YBZ18，說(shuō)明菌株有拮抗反應(yīng)發(fā)生，其中誘變菌株YBS21的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)較為明顯。

2.2產(chǎn)多糖菌株的復(fù)篩

2.2.1親本菌株和誘變菌株多糖含量的測(cè)定

由圖3可見，葡萄糖質(zhì)量濃度對(duì)吸光度的線性回歸方程為y=0.005 5x+0065 5（r2=0.999 1）。由表1可見，親本菌株多糖含量為094 g/L，誘變菌株香菇多糖含量低于親本菌株的有19個(gè)，分別為YBS1、YBS2、YBS4、YBS5、YBS6、YBS7、YBS8、YBS9、YBS10、YBS11、YBS15、YBZ5、YBZ6、YBZ7、YBZ9、YBZ11、YBZ12、YBZ13、YBZ15，其中菌株YBS6的多糖含量相對(duì)最低，為0.75 g/L，比親本菌株低20.2%。誘變菌株香菇多糖含量高于親本菌株的有20株，分別為YBS3、YBS12、YBS13、YBS14、YBS16、YBS17、YBS18、YBS19、YBS20、YBS21、YBZ1、YBZ2、YBZ3、YBZ4、YBZ8、YBZ10、YBZ14、YBZ16、YBZ17、YBZ18，其中多糖含量相對(duì)較高的2株誘變菌株YBS21、YBZ18，其多糖含量分別為1.34、1.36 g/L，分別比親本菌株高42.6%、44.7%。

[FK（W11][TPWMM33.tif][FK）]

2.2.2胞外多糖高產(chǎn)菌株穩(wěn)定性測(cè)定由表2可見，誘變菌株YBZ18第7、8、9、10代的香菇多糖含量分別為1.21、1.18、1.11、1.08 g/L，與第1代香菇多糖含量1.36 g/L相比有明顯下降，遺傳學(xué)性狀較不穩(wěn)定；誘變菌株YBS21第7、8、9、10代的香菇多糖含量分別為1.35、1.34、1.33、1.33 g/L，與第1代香菇多糖含量1.34 g/L相比幾乎無(wú)變化，說(shuō)明其遺傳穩(wěn)定性較好，而遺傳學(xué)性狀是否穩(wěn)定是鑒定菌株能否投入生產(chǎn)的重要指標(biāo)。

2.3親本菌株與誘變菌株的菌落形態(tài)及菌絲生長(zhǎng)速度[HT]

由圖4、表3可見，親本菌株菌絲為白色絮狀，疏松，菌落邊緣整齊，顯微鏡下菌絲體稍細(xì)，鎖狀聯(lián)合較明顯；菌株YBS21菌絲為白色絮狀，緊密、爬壁力強(qiáng)，菌落中間隆起度較高且有菌絲體結(jié)塊；菌株YBS21的菌絲平均生長(zhǎng)速度為 （0.33±0.02） cm/d，親本菌株的菌絲平均生長(zhǎng)速度為（0.25±0.02） cm/d，與親本菌株相比，菌株YBS21的菌絲生長(zhǎng)速率相對(duì)較快，而粗壯緊密的菌絲體有利于多糖的沉積和菌絲生長(zhǎng)。

[HTK]2.4親本菌株與誘變菌株YBS21的rDNA-ITS擴(kuò)增堿基序列分析[HT]

由表4可見，香菇親本菌株（登錄號(hào)為：KX512805）第453個(gè)堿基A經(jīng)誘變突變?yōu)镚，第627個(gè)堿基T經(jīng)誘變突變?yōu)镃，從第733個(gè)堿基開始序列CTAGCGGAGGGGGG經(jīng)誘變突變?yōu)樾蛄蠥TAAGGCGGAGGAG，這說(shuō)明菌株YBS21（登錄號(hào)為：KX512806）是誘變產(chǎn)生。endprint

3結(jié)論與討論

香菇多糖作為香菇最主要的食藥用成分，篩選出多糖含量較高的香菇菌株是現(xiàn)在農(nóng)業(yè)發(fā)展所需。以陜南地區(qū)主栽香菇品種808#為出發(fā)菌株，采用紫外輻射對(duì)其孢子進(jìn)行誘變，初步篩選出39個(gè)與親本菌株拮抗線較明顯的誘變菌株。在此基礎(chǔ)上，對(duì)篩選出的39個(gè)誘變菌株進(jìn)行胞外多糖測(cè)定，其中20個(gè)誘變菌株的香菇胞外多糖含量高于親本菌株，19個(gè)誘變菌株的香菇胞外多糖含量低于親本菌株，其中菌株YBS21的胞外多糖含量為1.34 g/L，高于親本菌株42.6%，經(jīng)10代培養(yǎng)，其胞外多糖含量為1.33 g/L，產(chǎn)胞外多糖遺傳性狀較穩(wěn)定，鑒定菌株YBS21為香菇胞外多糖高產(chǎn)菌株，并從形態(tài)學(xué)、分子生物學(xué)進(jìn)一步確定該菌株為誘變產(chǎn)生。

紫外誘變是一種傳統(tǒng)而經(jīng)典的微生物菌種選育技術(shù)。梁枝榮等采用紫外輻射對(duì)香菇原生質(zhì)體進(jìn)行誘變，篩選出2個(gè)菌絲生長(zhǎng)速度快、產(chǎn)量高且遺傳性狀穩(wěn)定的香菇優(yōu)良菌株[11]；王麗寧等采用原生質(zhì)體紫外誘變篩選出產(chǎn)量高且耐高溫的4個(gè)瀘農(nóng)2號(hào)香菇誘變株[12]。本研究直接對(duì)香菇孢子進(jìn)行紫外誘變，在現(xiàn)有研究的基礎(chǔ)上簡(jiǎn)單易行且成本低，減少了原生質(zhì)體制備過(guò)程中操作復(fù)雜、難控制、易污染等問(wèn)題的發(fā)生，且本研究從香菇發(fā)酵液中獲取香菇多糖，與傳統(tǒng)的從香菇子實(shí)體中提取香菇多糖相比，生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單，成本低且提取效率高，這為香菇優(yōu)質(zhì)菌種資源的篩選、研究與開發(fā)及香菇代謝產(chǎn)胞外多糖的進(jìn)一步研究提供了理論參考。

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