FISH法對(duì)肺腺癌穿刺標(biāo)本EML4-ALK融合基因的檢測(cè)

成克倫 周永松 陳秀嬋 熊云剛 鄒陽(yáng)強(qiáng) 姜 森 鄧劉丹

（1.貴州航天醫(yī)院病理科，貴州遵義563000；2.廣州安必平醫(yī)藥科技股份有限公司技術(shù)部，廣東廣州510663）

FISH法對(duì)肺腺癌穿刺標(biāo)本EML4-ALK融合基因的檢測(cè)

成克倫1周永松1陳秀嬋1熊云剛1鄒陽(yáng)強(qiáng)1姜 森1鄧劉丹2

（1.貴州航天醫(yī)院病理科，貴州遵義563000；2.廣州安必平醫(yī)藥科技股份有限公司技術(shù)部，廣東廣州510663）

目的 探討采用肺腺癌穿刺活檢標(biāo)本檢測(cè)棘皮動(dòng)物微管相關(guān)類蛋白4（EML4）與間變性淋巴瘤激酶（ALK）融合基因（EML4-ALK）的可行性。方法 對(duì)20例肺腺癌經(jīng)皮肺穿刺標(biāo)本應(yīng)用熒光原位雜交（FISH）法檢測(cè)EML4-ALK融合基因。結(jié)果 20例標(biāo)本中，19例通過(guò)FISH檢測(cè)成功，檢測(cè)成功率為95.00%。其中陽(yáng)性2例，陽(yáng)性率為10.00%。結(jié)論 肺腺癌穿刺活檢標(biāo)本可用作檢測(cè)EML4-ALK融合基因，為靶向治療提供參考依據(jù)。

熒光原位雜交；肺腺癌；EML4-ALK融合基因；經(jīng)皮肺穿刺

肺癌是全世界最常見(jiàn)的惡性腫瘤，發(fā)病率和死亡率位居惡性腫瘤之首，老年人發(fā)病比較多見(jiàn)。最常見(jiàn)的類型是鱗癌和腺癌，腺癌的發(fā)病率近年來(lái)有所上升，已占到60%左右[1]。腺癌的治療除手術(shù)和放、化療外，分子靶向藥物應(yīng)用是目前的一個(gè)熱點(diǎn)，本研究通過(guò)FISH法，探索肺腺癌穿刺標(biāo)本EML4-ALK檢測(cè)的可行性，為靶向治療作一參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料：收集2015年1月至6月在貴州航天醫(yī)院經(jīng)皮肺穿刺的肺腺癌活檢標(biāo)本20例，鏡檢癌細(xì)胞數(shù)均＞50個(gè)。在20例患者中，男13例，女7例，年齡43～78歲，中位年齡61歲。實(shí)性為主性腺癌5例，腺泡為主性腺癌12例，黏液為主性腺癌2例，乳頭為主性腺癌1例。高分化腺癌6例，中分化10例，低分化4例。免疫組化標(biāo)記CK7全部（+），TTF-1（+）17 例，ALK（+）3 例，EGFR（+）5 例，p63 和CK5/6全部（-）。有長(zhǎng)期吸煙史8例。

1.2 試劑：EML4-ALK融合基因檢測(cè)探針試劑盒及輔助試劑均為廣州安必平醫(yī)藥科技股份有限公司產(chǎn)品；免疫組化試劑為福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司產(chǎn)品。

1.3 方法：標(biāo)本經(jīng)中性福爾馬林固定，石蠟包埋切片，厚4 μm。向coplin缸中加入50 mL的預(yù)處理液，加熱至80℃。用緩沖液稀釋蛋白酶IV，加入coplin缸中，37℃水浴。切片70℃烘烤1 h以上，二甲苯Ⅰ、Ⅱ脫蠟各5 min，無(wú)水乙醇Ⅰ、Ⅱ脫水各5 min，室溫風(fēng)干。放入預(yù)熱的預(yù)處理液中10 min，再浸于蒸餾水中5 min。放入預(yù)熱的蛋白酶溶液中20 min，再浸入蒸餾水中5 min，風(fēng)干。把切片放入變性液中，設(shè)定變性溫度為73℃，時(shí)間5 min。將切片浸于70%、85%、無(wú)水乙醇中各1 min，風(fēng)干。每張切片加10 μL探針液，蓋上蓋玻片進(jìn)行雜交。雜交溫度設(shè)定37℃，時(shí)間24 h，注意保濕。將切片浸入洗脫緩沖液I中5 min，直至蓋玻片自動(dòng)浮離，浸入預(yù)熱至75℃的洗脫緩沖液Ⅱ中5 min。室溫避光風(fēng)干切片，加10 μLDAPI，蓋上蓋玻片，避光放置 1 min，熒光顯微鏡觀察。

1.4 判讀方法：油鏡下觀察至少50個(gè)腫瘤細(xì)胞。陽(yáng)性細(xì)胞：紅色和綠色信號(hào)分開(kāi)大于等于2個(gè)信號(hào)寬度或單獨(dú)的紅色信號(hào)。陰性細(xì)胞：紅色和綠色信號(hào)融合或分開(kāi)小于2個(gè)信號(hào)寬度或只有單獨(dú)的綠色信號(hào)。計(jì)數(shù)50個(gè)腫瘤細(xì)胞，＜10%為陰性，＞50%為陽(yáng)性。10%～50%之間則另計(jì)數(shù)50個(gè)腫瘤細(xì)胞，2次結(jié)果相加計(jì)算百分比，＜15%為陰性，≥15%為陽(yáng)性。

2 結(jié)果

20例肺腺癌穿刺標(biāo)本中，19例成功通過(guò)FISH檢測(cè)（3例為二次檢測(cè)成功），檢出成功率為95.00%，1例信號(hào)弱不能判讀，詳見(jiàn)圖1。其中EML4-ALK陽(yáng)性2例，陽(yáng)性率為10.00%，其余為陰性，詳見(jiàn)圖2。2例陽(yáng)性患者為男性，平均年齡53歲，均為中-低分化實(shí)性為主性腺癌，免疫組化 ALK（+），EGFR（-），有吸煙史。

圖1 肺腺癌標(biāo)本檢測(cè)圖

圖2 肺腺癌EML4-ALK檢測(cè)圖（FISH×1000）

3 討論

EML4為棘皮類動(dòng)物微管相關(guān)蛋白樣蛋白家族成員，其結(jié)構(gòu)由N端Basic區(qū)、疏水的棘皮動(dòng)物微管相關(guān)蛋白區(qū)（HELP）以及WD重復(fù)區(qū)三部分構(gòu)成。EML4基因在維持細(xì)胞的基本形態(tài)方面發(fā)揮著主要作用，三部分中Basic區(qū)的作用可能最為重要[2]。ALK是一種受體酪氨酸激酶，與白細(xì)胞酪氨酸激酶（LTK）屬于同一亞家族，均為胰島素受體（IR）超家族成員，由1620個(gè)氨基酸組成該蛋白的膜外部分、跨膜區(qū)域以及膜內(nèi)催化區(qū)域構(gòu)成。ALK的正常生理功能尚未完全闡明，可能與神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和功能有關(guān)[3]。EML4和ALK基因均定位于2號(hào)染色體短臂上的p21帶和p23帶，分布方向相反，發(fā)生融合時(shí)，其中一個(gè)需從染色體上斷裂，調(diào)轉(zhuǎn)方向與另一個(gè)發(fā)生融合。由于EML4具有多變的斷裂位點(diǎn)，所以與ALK發(fā)生融合可以形成多種不同的亞型，部分亞型與腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)[4]。最初人們將EML4-ALK融合基因看作是肺癌所特有，但隨后的研究發(fā)現(xiàn)，在部分乳腺癌、結(jié)直腸癌以及非霍奇金淋巴瘤中也有表達(dá)，但在肺腺癌中表達(dá)最高，可達(dá)15%左右[5]。EML4-ALK融合基因的變異導(dǎo)致癌細(xì)胞的酪氨酸激酶異常高表達(dá)，表明它是一個(gè)新的基因靶點(diǎn)，針對(duì)此靶點(diǎn)的酪氨酸激酶抑制劑如克唑替尼（Crizotinib）在臨床治療中已取得良好療效，所以對(duì)肺腺癌患者進(jìn)行EML4-ALK融合基因檢測(cè)是很有必要的。EML4-ALK融合基因檢測(cè)的方法有多種，F(xiàn)ISH法是其中一種，為美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準(zhǔn)的標(biāo)準(zhǔn)方法，該檢測(cè)法對(duì)確診ALK陽(yáng)性肺癌具有重要意義，缺點(diǎn)是不能識(shí)別融合位點(diǎn)，不能鑒別不同的融合變異亞型。

目前多采用手術(shù)標(biāo)本對(duì)EML4-ALK進(jìn)行研究，單獨(dú)針對(duì)小標(biāo)本的臨床研究較少。本組20例肺腺癌小標(biāo)本中，均經(jīng)過(guò)篩選全部滿足FISH方法檢測(cè)條件，即100.00%的標(biāo)本可用于檢測(cè)。其中1例因FISH信號(hào)弱而未能獲得FISH結(jié)果，F(xiàn)ISH檢測(cè)成功率為95.00%。陽(yáng)性率為10.00%，與報(bào)道的手術(shù)標(biāo)本的陽(yáng)性率相似，雖然只有2例陽(yáng)性，但患者的主要臨床病理特征如年齡、病理類型和吸煙史等與有關(guān)研究符合，說(shuō)明肺腺癌穿刺活檢標(biāo)本可用于檢測(cè)EML4-ALK融合基因，尤其對(duì)中晚期腺癌更適用，因?yàn)榇蟛糠种型砥诜蜗侔┗颊呒菏中g(shù)治療機(jī)會(huì)，無(wú)法取得手術(shù)標(biāo)本。但對(duì)小標(biāo)本先要進(jìn)行篩選，HE切片上癌細(xì)胞數(shù)量＞50個(gè)才宜于FISH檢測(cè)。經(jīng)皮肺穿刺的肺癌活檢標(biāo)本本身組織量少，經(jīng)過(guò)HE切片、免疫組化以及EGFR基因檢測(cè)后，量越來(lái)越少，因此一定要仔細(xì)認(rèn)真合理使用標(biāo)本不浪費(fèi)，以保證EML4-ALK檢測(cè)的正常進(jìn)行，腫瘤細(xì)胞越多，檢出率越高。對(duì)于肺穿刺小標(biāo)本用于檢測(cè)EML4-ALK融合基因，現(xiàn)無(wú)統(tǒng)一的診斷流程。由于該基因一般不與EGFR、Kras基因突變共存，從檢測(cè)效能和成本的角度出發(fā)，理想的流程為對(duì)EGFR、Kras陰性的肺腺癌患者首先采用免疫組化（IHC）ALK（D5F3）抗體檢查，ALK的IHC中0分和3+者可暫不作FISH檢測(cè)，1+和2+者作FISH檢測(cè)更合適，必要時(shí)也結(jié)合臨床和病理特征作選擇。

肺穿刺小標(biāo)本EML4-ALK融合基因的檢測(cè)成功率與嚴(yán)密的操作步驟密切相關(guān)，本實(shí)驗(yàn)中有3例是二次檢測(cè)成功的也證明了這一點(diǎn)。由于目前檢測(cè)成本較高，所以每一步都要一絲不茍去做，爭(zhēng)取一次性成功檢測(cè)。

［1］ 梁小龍，王孟昭，張靜，等.檢測(cè)肺腺癌活檢標(biāo)本間變性淋巴瘤激酶蛋白表達(dá)和基因融合［J］.中華腫瘤雜志，2014，36（7）：501-504.

［2］ 張邢松，魏萬(wàn)里.肺癌組織中EML4-ALK基因表達(dá)的研究進(jìn)展［J］.現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)，2014，22（5）：1226-1230.

［3］ 郭易楠，岳文濤.EML4-ALK融合基因在腫瘤中的研究進(jìn)展［J］.國(guó)際腫瘤學(xué)雜志，2014，41（7）：484-487.

［4］ Sasaki T，Rodig SJ，Chirieac LR，et al.The biology and treatment of EML4-ALK non-small cell lung cancer［J］.Eur J Cancer，2010，46（10）：1773-1780.

［5］ 王夢(mèng)，楊繼元，李軍川，等.EML4-ALK在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及臨床意義［J］.臨床腫瘤學(xué)雜志，2013，18（8）：688-690.

［6］ Gridelli C，Peters S，Sgambato A，et al.ALK inhibitors in the treatment of advanced NSCLC［J］.Cancer Treat Rev，2014，40（2）：300-306.

Detection of EML4-ALK Fusion Gene in Lung Adenocarcinoma Specimens By FISH

Cheng Kelun1Zhou Yongsong1Chen Xiuchan1Xiong Yungang1Zou Yangqiang1Jiang Sen1Deng Liudan2
（1.Department of Pathology，Guizhou Aerospace Hospital，Zunyi 563000，China；2.Department of Polytron Technologies Inc，Guangzhou LBP Medical Technology，Guangzhou 510663，China）

ObjectiveTo test the feasibility of detecting echinoderm microtubule related protein 4 （EML4）and anaplastic lymphoma kinase（ALK）fusion gene（EML4-ALK）in lung adenocarcinoma biopsy samples.Methods Fluorescence in situ hybridization（FISH）was performed for 20 lung adenocarcinoma biopsy samples to detect EML4-ALK fusion gene.Results FISH assay was successful for 19 of the 20 samples，with a success rate of 95%.2 of the 20 cases（10%）was positive for EML4-ALK fusion gene.Conclusion Lung adenocarcinoma biopsy specimens can be used for detection of EML4-ALK fusion gene，which provides references for targeted therapy of this disease.

Fluorescence in situ hybridization；Lung adenocarcinoma；EML4-ALK fusion gene；Percutaneous aspiration lung

R734.2

A 學(xué)科分類代碼： 32067

1001-8131（2017）04-0314-03

2017-02-04

中國(guó)航天科工集團(tuán)公司醫(yī)療衛(wèi)生科研項(xiàng)目（2014-LCLX-009）