TPX2基因在乳腺癌病理進展和放療中作用機制研究

黃超有 吳德華 韓 錚 朱珊珊

（南方醫(yī)科大學，廣州白云510515）

TPX2基因在乳腺癌病理進展和放療中作用機制研究

黃超有 吳德華 韓 錚 朱珊珊

（南方醫(yī)科大學，廣州白云510515）

目的 研究TPX22基因?qū)θ橄侔┎±磉M程和放療的影響及作用機制。方法 建立乳腺腫瘤干細胞裸鼠移植瘤模型，根據(jù)是否接受細胞放射干預分為干預組和未干預組，采用免疫組化法檢測兩組乳腺癌細胞裸鼠模型接受放療干預前后TPX22基因蛋白表達水平，并檢測TPX2相關(guān)靶基因（Bcl-2、Bax、p21及p53）在乳腺癌組織中的蛋白表達，分析TPX2與其相關(guān)靶基因蛋白的相關(guān)性。結(jié)果 兩組乳腺腫瘤裸鼠模型右腋下均有顯著移植瘤生長，腫瘤組織與周圍正常組織分解清晰，移植瘤組織內(nèi)有大量腫瘤細胞彌漫性分布，腫瘤細胞形態(tài)不規(guī)則。干預組接受放療后TPX2陽性率50%，對照組87.5%。TPX2與Bcl-2表達水平呈顯著正相關(guān)性（RBcl-2=0.9688），與Bax、p21及p53呈顯著負相關(guān)性（RBax=-0.9675、Rp21=-0.9563、RP53=-0.9742）。結(jié)論 TPX2在乳腺癌細胞中呈高表達，可能通過調(diào)控Bcl-2、Bax、p21及p53等相關(guān)靶基因表達水平，參與疾病進展，影響放療效果，TPX2有望成為乳腺癌治療的新靶點。

TPX2基因；乳腺癌；病理進程；放療；機制

乳腺癌是臨床常見的惡性腫瘤，TPX2屬蘇氨酸家族新發(fā)現(xiàn)的癌基因，有研究發(fā)現(xiàn)TPX2可通過多種途徑參與腫瘤細胞生長[1]，在癌細胞損傷、修復及凋亡過程中發(fā)揮重要作用。乳腺癌腫瘤干細胞是其放療抵抗的關(guān)鍵，既往資料顯示TPX2與腫瘤干細胞增殖密切相關(guān)[2]，但目前臨床尚缺乏TPX2在乳腺腫瘤干細胞中的表達及其在放療中作用的機制研究。為此，本研究通過動物實驗觀察TPX2在乳腺腫瘤干細胞中的表達，并進一步分析其在乳腺癌病理進程和放療中作用機制，為乳腺癌新治療靶點的尋找提供依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料：實驗裸鼠16只，均由廣東省醫(yī)學實驗動物中心提供，干預組和未干預組各8只，干預組體重 40～76 g，平均（58.4±10.2）g；雌性 5 只，雄性 3 只。未干預組體重 38～78 g，平均（59.0±9.7）g；雌雄性各4只。兩實驗組基本資料無顯著性差異（P＞0.05）。

1.2 實驗方法：①建立乳腺腫瘤裸鼠模型：在10%胎牛血清和160 U/L胰島素PRMH640培養(yǎng)液中培養(yǎng)人乳腺癌細胞株MCF-7，收集對數(shù)生長期細胞懸液。在SPF環(huán)境下將細胞懸液接種至裸鼠背部皮下，0.1 mL/只。待腫瘤生長至肉眼可見后，切取腫瘤組織，處死裸鼠；②細胞放射干預：取組織病理細胞，在溫室下用 137Csirradiator照射，劑量率 0～32 Gy/min，距放射源100 cm，照射完成后在室溫37℃、5%CO2條件下進行細胞培養(yǎng)；③免疫組化：每一病理切片連續(xù)切取4 μm厚切片，60℃烤片2 h，石蠟切片脫蠟水化，PBS 浸泡 5 min，3%H2O2溫室孵育 5 min，再用PBS浸泡5 min，用EDTA抗原修復液高壓修復3 min，一抗稀釋后，4℃環(huán)境下過夜。PBS沖洗，3 min×3次，加入過氧化物酶標記的抗鼠IgG二抗，室溫孵育20 min，PBS沖洗后，用DAB顯色劑顯色，沖洗，蘇木素復染，脫水。判斷標準：高倍鏡下觀察染色結(jié)果，無染色為陰性（-）、淺黃色為弱陽性（+）、棕黃色為陽性（++）、黃褐色為強陽性（+++）。

1.3 統(tǒng)計學處理：選用SPSS19.0統(tǒng)計學軟件，計量資料以均數(shù)±標準差表示，計數(shù)資料以率（%）表示，組間比較行t或χ2檢驗，相關(guān)性分析采用線性回歸分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌裸鼠模型染色：兩組裸鼠右腋下均有顯著移植瘤生長，腫瘤組織病理切片見圖1，腫瘤組織與周圍組織分解清晰，移植瘤組織內(nèi)有大量腫瘤細胞彌漫性分布，腫瘤細胞形態(tài)不規(guī)則，細胞核異型，詳見圖1。

圖1 染色后的裸鼠腫瘤細胞

2.2 TPX2在兩組乳腺癌裸鼠模型中表達：干預組和未干預組放療前后TPX2表達水平詳見表1。

表1 兩組TPX2表達水平

2.3 TPX2表達水平與其相關(guān)靶基因相關(guān)性：TPX2與Bcl-2呈顯著正相關(guān)性，與Bax、p21及p53呈顯著負相關(guān)性（P＜0.05）。

3 討論

TPX2是受細胞周期嚴格調(diào)控的核增殖相關(guān)蛋白，分布于S期和G2期，在腫瘤細胞有絲分裂過程中發(fā)揮重要作用。既往已有研究證實TPX2在食管癌、宮頸癌、肺癌等多種惡性腫瘤中呈現(xiàn)高表達[3]，其表達水平與腫瘤生物學行為密切相關(guān)。劉萬偉等[4]認為TPX2是機體重要的凋亡調(diào)節(jié)因子，參與DNA組織損傷修復過程。本研究也顯示，乳腺癌裸鼠模型中TPX2均呈陽性表達，且在放療干預后陽性表達率顯著降低，故推測TPX2高表達可作為乳腺癌的高危因素，其表達水平對判斷患者預后具有一定的預測價值。有研究還認為TPX2可通過上調(diào)JAK2和STAT1 表達，下調(diào)細胞周期蛋白（Cycline）水平[5]，增強腫瘤侵襲能力。張春梅[6]利用RT-PCR檢測tpx2m RNA表達水平，發(fā)現(xiàn)其在乳腺癌中的表達水平顯著高于癌旁和正常組織，與本文結(jié)論相符。

Bcl-2位于人染色體的18q21，屬抑制細胞凋亡的原癌基因。王美玲[7]認為Bcl-2作用于線粒體PT孔有關(guān)蛋白，阻斷PT孔開放，維持跨膜電位，同時減少細胞色素C釋放。湯少鵬[8]利用Western blot檢測發(fā)現(xiàn)TPX2siRNA載體細胞Bcl-2和Cyclin表達下調(diào)，從而抑制EC1細胞增殖，降低穿透Matrigel腫瘤細胞，誘導細胞凋亡。高德全等檢測胃癌組織Bax和Bcl-2水平，認為上調(diào)Bax，可激活caspase-3，誘導腫瘤細胞凋亡[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，TPX2表達水平與Bcl-2表達水平呈顯著正相關(guān)性，而與Bax呈負相關(guān)性。故推測TPX2和Bax具有負向協(xié)同調(diào)控作用，TPX2可能通過調(diào)控Bax和Bcl-2水平，促進腫瘤進展。

綜上所述，TPX2在乳腺癌細胞中呈高表達，TPX2可能通過調(diào)控Bcl-2、Bax、p21及p53等靶基因蛋白，在腫瘤進展和接受放療后影響其病理進程。

［1］ 沈亮，許一鳴，丁勝光，等.TPX2在食管胃交界部腺癌中的表達及其與侵襲轉(zhuǎn)移的相關(guān)性［J］.中華臨床醫(yī)師雜志，2016，10（11）：1505-1510.

［2］ 梁博，黃毓，何華，等.TPX2在肝細胞癌組織中的表達及其臨床意義［J］.中華醫(yī)學雜志，2015，95（6）：408-411.

［3］ 常海平，王敬芝，田原，等.TPX2在宮頸癌中的表達及意義［J］.基礎(chǔ)醫(yī)學與臨床，2012，32（5）：561-565.

［4］ 劉萬偉，李恩亮，鄔林泉，等.TPX2在細胞間期參與DNA損傷反應(yīng)及其與腫瘤發(fā)生關(guān)系的研究進展［J］.廣東醫(yī)學，2016，37（8）：1245-1248.

［5］ 才保加，祁玉娟，周為，等.結(jié)腸腺癌患者癌組織中TPX2、PTEN和Ki67的關(guān)系及臨床意義［J］.中國老年學雜志，2014，16（9）：2399-2401.

［6］ 張春梅，李敏，周仕嫻，等.乳腺癌組織中TPX2蛋白的表達及其臨床意義［J］.臨床與實驗病理學雜志，2015，9（5）：528-531.

［7］ 王美玲.Bax、Bag-1、Bcl-2在乳腺腫瘤組織中的表達及意義［J］.海南醫(yī)學院學報，2014，20（11）：1472-1474.

［8］ 湯少鵬.TPX2 siRNA對食管鱗癌EC1細胞增殖、凋亡和侵襲的影響［J］.中國實用醫(yī)刊，2014，7（20）：63-66.

［9］ 高存祥，王勤章，丁國富，等.T1b期腎癌及癌旁組織中PCNA、Bax 的表達及意義［J］.山東醫(yī)藥，2013，53（17）：7-8.

Study on the Mechanism of TPX2 Gene in Pathological Process and Radiotherapy of Breast Cancer

Huang Chaoyou Wu Dehua Han Zheng Zhu Shanshan
（Southern Medical University，Baiyun 510515，China）

ObjectiveTo study the effects and mechanism of TPX22 gene in the pathological process and radiotherapy of breast cancer.Methods The nude-mouse transplanted tumor models of breast tumor stem cells were established.According to whether or not to accept cell radiation intervention，they were divided into intervention group and non-intervention group.The expression levels of TPX22 gene protein in both groups were detected by immunohistochemical method，and the expression of TPX2 related target genes （Bcl-2，Bax，p21 and p53）in breast cancer tissues was detected.The correlation between TPX2 and related target genes was analyzed.Results There was significant growth of transplantation tumor under right axilla of the two groups，and the boundaries between tumor tissues and normal tissues were clear.There were a large number of tumor cells which were in diffuse distribution，with irregular shape.After radiotherapy，the positive rate of TPX2 in the intervention group was 50%while in the non-intervention group was 87.5%.TPX2 was significantly positively correlated with expression level of Bcl-2（RBcl-2=0.9688），while it was significantly negatively correlated with Bax，p21 and p53（RBax=-0.9675，Rp21=-0.9563，RP53=-0.9742）.Conclusion TPX2 is highly expressed in breast cancer cells.It may be involved in the progression of the disease by modulating the expression of Bcl-2，Bax，p21，p53 and other related target genes，affecting the effect of radiotherapy.TPX2 is expected to become a new target for treatment of breast cancer.

TPX2 gene；Breast cancer；Pathological process；Radiotherapy；Mechanism

R737.9

A 學科分類代碼： 32067

1001-8131（2017）04-0308-02

2016-12-29

廣東省醫(yī)學科研基金（A2015033）