2型單純皰疹病毒感染后HaCaT細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的變化研究

楊勵(lì) 牛妍艷 劉楊 孫曉燕 馬小萍 張美芳（通訊作者）（.陜西省人民醫(yī)院皮膚科，陜西西安70068；.宿遷市第一人民醫(yī)院，江蘇宿遷800；.陜西省人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，陜西西安70068）

·論 著·

2型單純皰疹病毒感染后HaCaT細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的變化研究

楊勵(lì)1牛妍艷2劉楊3孫曉燕1馬小萍1張美芳1（通訊作者）
（1.陜西省人民醫(yī)院皮膚科，陜西西安710068；2.宿遷市第一人民醫(yī)院，江蘇宿遷223800；3.陜西省人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，陜西西安710068）

目的 探討2型單純皰疹病毒（HSV-2）感染后人角質(zhì)形成細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的狀況。方法 采用非洲綠猴腎細(xì)胞株VERO細(xì)胞進(jìn)行HSV-2病毒擴(kuò)增，再以HSV-2感染HaCaT細(xì)胞，采用ELISA和熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測感染后24h、48h和72h時(shí)IL-10、IFN-γ、TGF-β的分泌和表達(dá)情況。結(jié)果 經(jīng)HSV-2感染后HaCaT細(xì)胞分泌和表達(dá)的IL-10、IFN-γ、TGF-β與對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，并呈時(shí)間相關(guān)性。結(jié)論 在HSV-2感染早期KC參與了免疫反應(yīng)，其分泌和表達(dá)的細(xì)胞因子的偏移可能參與了HSV-2的病理機(jī)制。

生殖器皰疹；2型單純皰疹病毒；角質(zhì)形成細(xì)胞；HaCaT；細(xì)胞因子

生殖器皰疹（Genital herpes，GH）是一種由單純皰疹病毒 2型（Herpes simplex virustype 2，HSV-2）引起的感染性疾病，主要通過性接觸傳染，該病發(fā)病率逐年增加[1]。HSV-2增加了人類免疫缺陷病毒（Human immunodeficiency virus，HIV） 黏膜傳播的風(fēng)險(xiǎn)，加速了疾病的進(jìn)展[2]，且復(fù)發(fā)難治性GH患者數(shù)量增多，引起對(duì)該病的研究關(guān)注。

HSV-2具有強(qiáng)的免疫原性，可以通過細(xì)微的裂隙感染角質(zhì)形成細(xì)胞（Keratinocyte cell，KC）致表皮的KC發(fā)生水腫、變性和壞死，且真皮內(nèi)不同程度的炎癥細(xì)胞浸潤，說明病毒可誘導(dǎo)機(jī)體在皮膚局部發(fā)生免疫反應(yīng)。同時(shí)，感染后的角質(zhì)形成細(xì)胞能夠分泌和表達(dá)多種細(xì)胞因子，利用其物理屏障作用成為抵抗HSV感染的機(jī)械性防線[3]。因此，了解HSV-2感染角質(zhì)形成細(xì)胞后早期局部免疫應(yīng)答的變化，在疾病的防治中能有針對(duì)性的進(jìn)行干預(yù)，促進(jìn)機(jī)體局部免疫功能而抑制或清除病毒。

本研究以人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞株（Human eternal cell line，HaCaT）作為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，在體外觀察HSV-2感染HaCaT的早期過程，檢測感染后白介素-10（Interleukin-10，IL-10）、干擾素-γ（Interferon-γ，IFN-γ）、轉(zhuǎn)化生長因子-β（Transforming growth factor-β，TGF-β）的表達(dá)。

1 材料與方法

1.1 一般材料：人永生化表皮細(xì)胞株HaCaT細(xì)胞由第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院皮膚病研究所饋贈(zèng)，非洲綠猴腎細(xì)胞株VERO細(xì)胞由陜西省人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室提供，HSV-2標(biāo)準(zhǔn)株購自中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：HaCaT細(xì)胞與VERO細(xì)胞均用DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)（含10%胎牛血清，100 μ/mL青霉素和50 μ/mL鏈霉素）。維持37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到70%時(shí)進(jìn)行消化傳代。

1.2.2 HSV-2病毒擴(kuò)增：將VERO細(xì)胞培養(yǎng)至約90%密度，換用無血清的DMEM培養(yǎng)基，將病毒液和細(xì)胞培養(yǎng)基以1：100體積比在37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)24～48 h，觀察細(xì)胞形態(tài)，當(dāng)達(dá)到70%細(xì)胞發(fā)生破碎后，收集全部細(xì)胞和培養(yǎng)基，凍存于-80℃。將凍存病毒液于室溫融化，再次復(fù)凍于-80℃，反復(fù)3次，使全部VERO細(xì)胞破裂，釋放病毒。將病毒液于室溫12000 r/min，離心15 min，保存上清液，用以病毒感染性測定。

1.2.3 病毒感染性的測定：將vero細(xì)胞懸液稀釋成1×105個(gè)/mL，每孔0.1 mL接種96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，37℃，5%CO2的條件下培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞單層鋪滿后，將HSV病毒液按10倍遞次稀釋成10-1～10-8不同的濃度梯度，每個(gè)稀釋濃度設(shè)4個(gè)復(fù)孔，并設(shè)正常細(xì)胞對(duì)照組（不加病毒液）。37℃吸附1.5 h后棄上清、換液，每孔維持0.1 mL體積，置37℃、5%CO2的條件下繼續(xù)培養(yǎng)。每日觀察并記錄細(xì)胞病變程度（CPE），最終計(jì)算病毒的半數(shù)感染量（TCID50）。

1.2.4 HSV-2病毒感染HaCaT細(xì)胞：設(shè)立感染組，病毒液+HaCaT細(xì)胞；空白對(duì)照組，病毒滅活液（將病毒液于56℃水浴孵育2 h滅活）+HaCaT細(xì)胞；正常對(duì)照組，HaCaT細(xì)胞。將3×106個(gè)HaCaT細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿，細(xì)胞單層鋪滿后加入病毒液，設(shè)定合適的終濃度，分別培養(yǎng)24、48和72 h。病毒感染后3 h需更換培養(yǎng)基。每次每組同時(shí)設(shè)定三個(gè)培養(yǎng)皿，共進(jìn)行9次重復(fù)但完全獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)。在不同時(shí)間點(diǎn)收集感染后的HaCaT細(xì)胞，-80℃保存，待檢測細(xì)胞因子 IFN-γ、IL-10、TGF-β，并每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的3個(gè)培養(yǎng)皿的全部細(xì)胞，獨(dú)立收集進(jìn)行下一步RNA提取和反轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)。

1.2.5 熒光實(shí)時(shí)定量PCR：PCR反應(yīng)體系中加入SYBR Green染料、正反向引物及cDNA，按照說明書進(jìn)行熒光實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)，分別檢測IFN-γ、IL-10、TGF-βmRNA 的表達(dá)量

1.2.6 ELISA法檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IFN-γ、IL-10、TGF-β水平：按照ELISA說明書分別檢測培養(yǎng)上清中的 IFN-γ、IL-10、TGF-β 水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料采用方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HaCaT細(xì)胞與VERO細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化：VERO細(xì)胞作為病毒擴(kuò)增細(xì)胞，在感染HSV-2后細(xì)胞變大、變圓，逐步變性壞死，HSV-2感染VERO細(xì)胞最佳效果時(shí)間在72 h內(nèi)。使用10-2PFU濃度的HSV-2感染后，HaCaT細(xì)胞出現(xiàn)融合，但死亡細(xì)胞較少，詳見圖1、圖2。

2.2 病毒毒力測定結(jié)果：觀察CPE，按Reed-Muench兩氏法測得病毒的TCDI50為5.8。

圖1 HSV-2感染前、后VERO細(xì)胞形態(tài)

圖2 HSV-2感染前、后HaCaT細(xì)胞形態(tài)

2.3 HSV-2感染HaCaT細(xì)胞檢測：依文氏蘭襯染為紅色背景，綠色為病毒抗原著色，詳見圖3。

圖3 病毒感染細(xì)胞后24h的免疫熒光照片

2.4 經(jīng)HSV-2病毒感染HaCaT細(xì)胞后培養(yǎng)液上清的 IFN-γ、IL-10、TGF-β 的水平：在 24 h、24～48 h、48～72 h，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），詳見表1。

2.5 經(jīng)HSV-2病毒感染后HaCaT細(xì)胞分泌的IFN-γ、IL-10、TGF-βmRNA 的表達(dá)量：詳見表 2。

3 討論

KC是HSV-2入侵的第一防線[4]，被感染后，KC壞死的同時(shí)也能分泌或誘導(dǎo)大量細(xì)胞因子的產(chǎn)生[5]，細(xì)胞因子參與了免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)，在免疫應(yīng)答中起著重要作用，因此檢測HSV-2感染早期KC的細(xì)胞因子在免疫變化中作用是非常重要的。

表 1 IFN-γ、IL-10、TGF-β 的水平的比較

表 1 IFN-γ、IL-10、TGF-β 的水平的比較

時(shí)間 IFN-γ IL-10 TGF-β感染組 對(duì)照組 t值 P值 感染組 對(duì)照組 t值 P值 感染組 對(duì)照組 t值 P值24h 0.24±0.11 0.28±0.11 2.92 0.067 0.25±0.04 0.26±0.13 2.35 0.10 0.26±0.03 0.21±0.17 4.29 0.025 48h 0.31±0.17 0.26±0.14 4.12 0.034 0.21±0.13 0.27±0.15 4.75 0.017 0.31±0.19 0.23±0.13 7.45 0.005 72h 0.39±0.26 0.23±0.13 5.83 0.014 0.19±0.09 0.30±0.12 7.18 0.006 0.22±0.20 0.25±0.11 2.34 0.100

表 2 IFN-γ、IL-10、TGF-βmRNA 的表達(dá)量的比較 x±s

我們的研究選用不引起Hacat細(xì)胞損傷的HSV-2最大感染濃度，證實(shí)了HSV-2感染Hacat細(xì)胞后能產(chǎn)生不同的細(xì)胞因子。HSV-2具有嗜表皮性，感染后可引起KC的水腫、變性和壞死，而TGF-β是調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長和分化的細(xì)胞因子[6]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)TGF-β的表達(dá)均高于對(duì)照組，其動(dòng)態(tài)變化可能影響了KC的增殖。結(jié)果提示，在HSV-2感染造成的皮膚損傷中，動(dòng)態(tài)監(jiān)測TGF-β變化可作為判斷組織損傷的依據(jù)。

實(shí)驗(yàn)觀察到Hacat細(xì)胞被HSV-2感染破壞后48h內(nèi)，Th1型細(xì)胞因子IFN-γ低于對(duì)照組水平，48h后升高。IFN-γ作為重要的免疫效應(yīng)分子，直接反應(yīng)了機(jī)體細(xì)胞免疫的水平[7]。發(fā)生變化可能有多種原因?qū)е?，比如HSV-2感染前48h，HSV-2有較強(qiáng)的侵襲性和破壞力，對(duì)Hacat細(xì)胞產(chǎn)生了破壞作用，致使Th1型細(xì)胞因子表達(dá)減少，細(xì)胞免疫功能部分受到非特異性抑制，難以控制病毒復(fù)制及擴(kuò)散[8]；或是由于抗原特異性的Th1/Th2細(xì)胞因子發(fā)生偏移所致。因此我們進(jìn)一步檢測了Th2細(xì)胞功能相關(guān)的IL-10，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Th2型細(xì)胞因子IL-10呈相對(duì)緩慢下降趨勢，我們同時(shí)發(fā)現(xiàn)感染后TGF-β的表達(dá)水平在48h內(nèi)較高，48h后緩慢下降，既往研究認(rèn)為TGF-β是抑制性細(xì)胞因子，影響Th1/Th2型細(xì)胞因子間的相互作用[9]，在維持皮膚免疫平衡中起重要的作用。本研究結(jié)果認(rèn)為在HSV感染早期，TGF-β的升高可能直接導(dǎo)致KC的免疫功能受到抑制，使IFN-γ的分泌水平降低，IL-10的改變也降低了其的分泌表達(dá)，但隨著疾病發(fā)展，逐步升高的IFN-γ限制了TGF-β負(fù)反饋，從而誘導(dǎo)向Th1型免疫方向發(fā)展。

本研究結(jié)果提示HSV-2感染的早期Th1型免疫反應(yīng)相對(duì)較弱，在48h前KC分泌的細(xì)胞因子以促進(jìn)局部Th2型免疫反應(yīng)為主；而48h后KC向Th1型細(xì)胞免疫分化，KC對(duì)HSV-2感染的識(shí)別和抵抗誘導(dǎo)了Th免疫平衡的變化[10]。根據(jù)此結(jié)論，提示在感染早期可以考慮糾正這種平衡偏移的情況，誘導(dǎo)和增強(qiáng)皮膚對(duì)HSV-2的局部免疫防御可能對(duì)治療有重要意義，特別是抑制或清除病毒并提高KC的免疫防御能力可能是防止HSV-2擴(kuò)散的新途徑。

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The Secretion and Expression of Cytokine in Keratinocyte with Herpes Simplex Virus Type 2 Infections

Yang Li1Niu Yanyan2Liu Yang3Sun Xiaoyan1Ma Xiaoping1Zhang Meifang1
（1.Department of Dermatology，Shaanxi Provincial People′s Hospital，Xi′an 710068，China；2.Department of Dermatology，Suqian First Hospital，Suqian 223800，China；3.Department of Center laboratory，Shaanxi Provincial People’s Hospital，Xi′an 710068，China；）

ObjectiveTo probe the state of cytokine level in the HSV-2-infected human keratinocyte（KC）.Methods VERO cells were used for the propagation and titration of the HSV-2，and HaCaT cells were infected with HSV-2，then were harvested 24h，48h and 72h.Expression levels of IL-10，IFN-γand TGF-βwere detected by ELISA and Real-time PCR.Results We infected HaCaT cells with HSV-2，levels of IL-10，IFN-γand TGF-βchanged significantly in a time-dependent manner（P＜0.05）.Conclusion Keratinocytes participate in the immune response on the early stage of HSV-2 infection，the shift of antiviral cytokine may involved in this process.

Genital herpes；HSV-2；Keratinocyte；HaCaT；Cytokine

R752

A 學(xué)科分類代碼： 32047

1001-8131（2017）04-0301-03

2016-11-03

陜西省科學(xué)技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（2009k18-01）