QuEChERS- 超高效液相色譜- 串聯(lián)質(zhì)譜法快速測定草莓中2，4- 表蕓苔素內(nèi)酯殘留量

虞 冰，劉 莉，汪志威，齊沛沛，王新全，徐霞紅，王祥云(.金華市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量綜合監(jiān)督檢測中心，浙江 金華 3000； .省部共建國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地浙江省植物有害生物防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室農(nóng)業(yè)部農(nóng)藥殘留檢測重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究所，浙江 杭州 300)

QuEChERS- 超高效液相色譜- 串聯(lián)質(zhì)譜法快速測定草莓中2，4- 表蕓苔素內(nèi)酯殘留量

虞 冰1，劉 莉1，汪志威2*，齊沛沛2，王新全2，徐霞紅2，王祥云2
(1.金華市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量綜合監(jiān)督檢測中心，浙江 金華 321000； 2.省部共建國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地浙江省植物有害生物防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室農(nóng)業(yè)部農(nóng)藥殘留檢測重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究所，浙江 杭州 310021)

建立了超高效液相色譜- 三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜測定草莓中2，4- 表蕓苔素內(nèi)酯殘留量的方法?；赒uEChERS方法進(jìn)行了凈化材料及其配比的優(yōu)化，最終采用40 mg PSA 和40 mg C18的組合進(jìn)行凈化。試驗(yàn)結(jié)果表明，2，4- 表蕓苔素內(nèi)酯在2.5～1 000 μg·L-1內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)為0.999，其最低檢出限為5 μg·kg-1，定量限為20 μg·kg-1。在20、50、100和200 μg·kg-1添加水平下，對草莓空白樣品添加2，4- 表蕓苔素內(nèi)酯，方法回收率為98.1%～110%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.3%～5.4%，滿足農(nóng)藥殘留分析方法的要求。應(yīng)用本方法對市售的47個草莓樣品進(jìn)行檢測，均為未檢出2，4- 表蕓苔素內(nèi)酯殘留。

2,4- 表蕓苔素內(nèi)酯； 超高效液相色譜- 三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜； 草莓； 植物生長調(diào)節(jié)劑

1970年，Mitchell[1]首先從油菜花粉中提取到可促進(jìn)植物生長的活性物質(zhì)，命名為Brassins(蕓苔素內(nèi)酯)，之后又有50余種天然蕓苔素內(nèi)酯類化合物(brassinolide)及其類似物激素從大量物種的花、種子、根莖和葉中被分離出來，被統(tǒng)稱為蕓苔素甾醇(brassinosteroids，BRs)。在蕓苔素甾醇植物激素中，蕓苔素內(nèi)酯類化合物因其活性最高而被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)[2]。目前我國已登記的蕓苔素內(nèi)酯主要有4種[3]，分別為2，4- 表蕓苔素內(nèi)酯、22，23，24- 表蕓苔素內(nèi)酯、28- 高蕓苔素內(nèi)酯和28- 表高蕓苔素內(nèi)酯。其中，2，4- 表蕓苔素內(nèi)酯由于合成所需工業(yè)原料麥角甾醇易得，因此應(yīng)用更為廣泛[4]。

草莓以其香味誘人、口感甜美、具有藥用價值以及高經(jīng)濟(jì)價值的特點(diǎn)而廣受青睞[5]。2，4- 蕓苔素內(nèi)酯的使用有助于提高草莓產(chǎn)量[6]，現(xiàn)已有相關(guān)產(chǎn)品獲得登記[7]。目前對蕓苔素內(nèi)酯類化合物報道的檢測方法包括氣相色譜- 質(zhì)譜法[8- 9]、高效液相色譜- 電化學(xué)檢測器[10]/熒光[11]/質(zhì)譜法[12]。其中，氣相色譜- 質(zhì)譜法主要用于鑒定，其靈敏度較差；而高效液相色譜- 電化學(xué)檢測器/熒光/質(zhì)譜法主要采用苯硼酸、菲硼酸、萘硼酸、二茂鐵硼酸、9- 菲硼酸和2- 溴吡啶- 5- 硼酸等硼酸衍生試劑[11- 14]提高蕓苔素內(nèi)酯的儀器響應(yīng)值，確保靈敏度，但衍生過程前處理方法較為繁瑣，且衍生試劑通?；钚暂^高難以長期保存。本試驗(yàn)擬基于QuEChERs方法，結(jié)合超高效液相色譜- 三重四極桿質(zhì)譜建立草莓中2，4- 表蕓苔素內(nèi)酯殘留量的快速檢測方法，并對實(shí)際樣品進(jìn)行檢測驗(yàn)證。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

采用超高效液相色譜儀LC- 30A(日本Shimadzu公司)和三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀AB- SCIEX 4500(美國AB公司)；Masslynx 4.1軟件用于儀器控制、數(shù)據(jù)采集和結(jié)果分析。色譜柱為Waters T3柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)；臺式離心機(jī)(美國Thermo公司)；Filter Unit濾膜(0.22 μm，Agela Technologies公司)。

甲醇、乙腈(色譜純，美國Merck公司)；乙酸銨、甲酸(HPLC級，美國Tedia公司)；氯化鈉、無水硫酸鎂等均為分析純，購自華東醫(yī)藥有限公司；PSA、C18、GCB凈化材料均購于Agela Technologies公司。

1.2 樣品前處理方法

萃取。稱取草莓樣品10.00 g(0.01 g)于50 mL離心管中，準(zhǔn)確加入10 mL乙腈，渦旋1 min。加入1 g氯化鈉和4 g無水硫酸鎂，渦旋1 min，在7 000 r·min-1條件下離心3 min，取上清液待凈化。

凈化。移取上清液1.5 mL于2 mL離心管中，加入40 mg PSA+40 mg C18，劇烈震蕩1 min后，在7 000 r·min-1條件下離心3 min，準(zhǔn)確吸取上清液0.5 mL至裝有0.5 mL水的2 mL離心管中，混勻，以0.22 μm濾膜過濾，待超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC- MS/MS)測定。

1.3 儀器分析方法

采用UPLC- MS/MS進(jìn)行樣品中2，4- 表蕓苔素內(nèi)酯的分析測定。色譜柱為Waters T3柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)，流動相為水和甲醇(1∶9，V/V)，其中水相含2 mmol·L-1乙酸銨和甲醇中含0.1%甲酸；流速為0.25 mL·min-1，柱溫35 ℃，進(jìn)樣量5 μL。

質(zhì)譜條件。采用電噴霧離子源，多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM)，加熱溫度500 ℃，噴霧電壓5 500 V。該化合物的特征離子對有4對，其母離子- 子離子對及相應(yīng)的碰撞能量和去簇電壓經(jīng)方法優(yōu)化后條件見表1，表中標(biāo)注*子離子為定量離子。

表1 2，4- 表蕓苔素內(nèi)酯的UPLC- MS/MS離子對及碰撞能量、去簇電壓

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化

本試驗(yàn)基于三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀確立2，4- 表蕓苔素內(nèi)酯的質(zhì)譜條件，主要包括離子對選擇、碰撞能量和去簇電壓等參數(shù)優(yōu)化。配制1.0 mg·L-12，4- 表蕓苔素內(nèi)酯標(biāo)準(zhǔn)溶液，通過蠕動泵以7 μL·min-1的流速直接進(jìn)入質(zhì)譜進(jìn)行分析。首先，在Q1 MS模式下，m/z為300～600的質(zhì)量范圍內(nèi)進(jìn)行全掃描，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其母離子[M+H]+的質(zhì)核比m/z為481.4。然后，在Product模式下，以481.4為母離子篩選子離子，在0～40 eV內(nèi)，改變碰撞電壓獲得響應(yīng)值較高的子離子依次為315.2，349.3，445.2和113.0。最后，在MRM模式下優(yōu)化每對離子對的碰撞能量和去簇電壓(表1)。圖1展示了50 μg·L-12，4- 表蕓苔素內(nèi)酯標(biāo)準(zhǔn)溶液經(jīng)色譜- 質(zhì)譜分析后得到的4對離子對的提取離子流色譜圖，響應(yīng)值較高的離子對依次為481.4>315.2和481.4>445.2。通過分析草莓基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液也驗(yàn)證這兩對離子對具有最高的響應(yīng)值和較低的干擾，確定以481.4>315.2為定量離子，481.4>445.2為定性離子。

圖1 50 μg·L-1蕓苔素內(nèi)酯標(biāo)準(zhǔn)溶液4組離子對的特征

2.2 樣品凈化材料的選擇和優(yōu)化

QuEChERS[15]方法是近年來發(fā)展十分迅速的一種前處理方法，該方法的重要環(huán)節(jié)在于除雜吸附劑的選擇。本試驗(yàn)首先開展了4種吸附劑組合，即PSA+C18、PSA+GCB、PSA+GCB+C18和GCB+C18，對草莓提取液凈化效果的比較。結(jié)果表明，當(dāng)吸附劑使用量各40 mg時，對樣品色素的去除效果依次為PSA+C18≈PSA+GCB>PSA+GCB+C18>GCB+C18。同時在空白草莓樣品中添加200 μg·kg-1蕓苔素內(nèi)酯后，比較4種吸附劑組合的回收率，結(jié)果表明，40 mg PSA+40 mg C18的填料組合凈化后蕓苔素內(nèi)酯的回收率最高為103.8%，其余填料組合凈化后對蕓苔素內(nèi)酯損失較大，其回收率僅為51.2%～63.7%，故選擇以PSA+C18的填料組合作為凈化材料。

在選定以PSA和C18組合作為凈化材料后，本試驗(yàn)又比較了20、40、60和80 mg等4種不同用量對草莓提取液的凈化效果(表2)，20 mg添加水平草莓萃取樣品的顏色較紅，40、60和80 mg添加量凈化效果明顯優(yōu)于20 mg；添加比例為40 mg時，繼續(xù)增加凈化材料比例對樣品去色效果不明顯。

同時，評價了4檔凈化材料添加后草莓中2，4- 表蕓苔素內(nèi)酯在200 μg·kg-1的添加回收率，結(jié)果顯示，回收率在95.3%～111.0%，能滿足檢測要求。本方法最終以40 mg PSA+40 mg C18作為草莓樣品提取液的凈化材料。

表2 2，4- 表蕓苔素內(nèi)酯各前處理方法的回收率

2.3 線性、靈敏度、基質(zhì)效應(yīng)和方法回收率

配置2.5、5、10、25、50、100、250、500和1 000 μg·L-12，4- 表蕓苔素內(nèi)酯的溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液和草莓基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液，以定量離子對481.4>315.2響應(yīng)值對標(biāo)樣濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。試驗(yàn)結(jié)果表明，在2.5～1 000 μg·L-1，溶劑標(biāo)線性擬合方程為Y=2423.8X+10 250，相關(guān)系數(shù)r為0.999，其中Y為峰面積，X為標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度；在2.5～1 000 μg·L-1，基質(zhì)標(biāo)線性擬合方程Y=1 866.1X+16 545，相關(guān)系數(shù)r為0.999。以兩組標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合方法的斜率比值作為基質(zhì)效應(yīng)判定的依據(jù)，結(jié)果表明，草莓萃取樣品經(jīng)本方法凈化后的基質(zhì)效應(yīng)為0.77，基質(zhì)效應(yīng)表現(xiàn)為抑制，因此采用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液外標(biāo)法進(jìn)行定量。

該方法對2，4表蕓苔素內(nèi)酯在草莓樣品中的最低檢出限以3倍信噪比計(jì)為5 μg·kg-1，最低定量限以10倍信噪比為20 μg·kg-1。在草莓空白樣品中添加適當(dāng)體積的2，4- 表蕓苔素內(nèi)酯標(biāo)準(zhǔn)溶液，使樣品中添加濃度分別為20、50、100和200 μg·kg-1，靜置30 min，使藥液被草莓樣品充分吸附，隨后按照1.2節(jié)的前處理方法和1.3節(jié)的儀器條件進(jìn)行方法驗(yàn)證，回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差見表3。結(jié)果表明，本方法對草莓中蕓苔素內(nèi)酯在定量限濃度(20 μg·kg-1)，中等濃度(50和100 μg·kg-1)和高濃度(200 μg·kg-1)的加標(biāo)回收率在98%～110%，完全滿足方法檢測需要。

表3 不同添加水平下草莓中2，4- 表蕓苔素內(nèi)酯的回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差

2.4 實(shí)際樣品驗(yàn)證

以本方法對47個市售草莓樣品進(jìn)行檢測，均未檢出2，4- 表蕓苔素內(nèi)酯殘留。

3 小結(jié)

本研究建立了草莓樣品中2，4- 表蕓苔素內(nèi)酯殘留量的QuEChERs- 超高效液相色譜- 串聯(lián)質(zhì)譜的快速檢測方法。對PSA、C18和GCB等凈化材料組合和用量進(jìn)行了比較優(yōu)化，最終采用40 mg PSA和40 mg C18作為凈化材料組合。本方法前處理簡單、靈敏度高，線性范圍、準(zhǔn)確度和精密度均可滿足農(nóng)藥殘留檢測的要求。

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(責(zé)任編輯：張瑞麟)

S668.4

：B

：0528- 9017(2017)09- 1538- 03

2017- 06- 18

國家自然科學(xué)基金(21607133)；浙江省公益技術(shù)應(yīng)用研究(2016C32G4010122)

虞 冰(1986—)，女，浙江金華人，助理工程師，本科，從事農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測研究工作，E- mail：563640286@qq.com。

汪志威，助理研究員，博士，從事農(nóng)藥環(huán)境行為和殘留分析工作，E- mail：wangzhiwei1106@126.com。

文獻(xiàn)著錄格式：虞冰，劉莉，汪志威，等. QuEChERS- 超高效液相色譜- 串聯(lián)質(zhì)譜法快速測定草莓中2，4- 表蕓苔素內(nèi)酯殘留量[J].浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，58(9)：1538- 1540，1545.

10.16178/j.issn.0528- 9017.20170912