早期針刺對創(chuàng)傷性腦損傷大鼠血清GFAP和S-100B蛋白水平的影響*

杜若桑 苑鴻雯 鄭淑美 王寶華 崔 海（首都醫(yī)科大學(xué)，北京 100069）

·實驗報告·

早期針刺對創(chuàng)傷性腦損傷大鼠血清GFAP和S-100B蛋白水平的影響*

杜若桑 苑鴻雯 鄭淑美 王寶華 崔 ?！鳎ㄊ锥坚t(yī)科大學(xué)，北京 100069）

目的 觀察針刺對創(chuàng)傷性腦損傷（TBI）大鼠血清膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）和S-100B蛋白水平的影響，評估針刺對創(chuàng)傷性腦損傷的療效。方法 按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)將120只雄性SD大鼠隨機(jī)分成3組，每組40只：假手術(shù)組、模型組、針刺組。假手術(shù)組只開骨窗，不進(jìn)行模型制備；模型組和針刺組制備TBI模型；針刺組造模后即接受針刺治療，每日1次。術(shù)后6 h、1 d、3 d、5 d 4個時間點每組均隨機(jī)選出10只大鼠進(jìn)行血清GFAP、S-100B蛋白水平和改良的神經(jīng)功能缺損（mNSS）評分觀察與檢測。結(jié)果 相較假手術(shù)組，模型組6 h即檢測到血清GFAP和S-100B蛋白水平升高（P＜0.01）。傷后6 h、1 d檢測發(fā)現(xiàn)針刺組GFAP水平比同期模型組降低（P＜0.05），傷后6 h、1 d、3 d檢測發(fā)現(xiàn)針刺組S-100B蛋白水平比同期模型組顯著降低（P＜0.01）。4個檢測時間點上，模型組大鼠mNSS評分均高于同期假手術(shù)組（P＜0.01），針刺組評分顯著低于同期模型組（P＜0.05或P＜0.01）。結(jié)論 TBI早期采用針刺干預(yù)可明顯減輕大鼠腦損傷的程度。

創(chuàng)傷性腦損傷 針刺 GFAP S-100B蛋白 mNSS評分

創(chuàng)傷性腦損傷（TBI）是指因外力導(dǎo)致的腦部損傷。據(jù)統(tǒng)計，TBI發(fā)生率居外傷首位，也是外傷患者殘疾甚至死亡的主要原因之一［1］。全球范圍內(nèi)每年有1千萬以上的人因為TBI入院治療甚至死亡［2］。TBI還是40歲以下人群殘疾的首要原因［3］。TBI會導(dǎo)致運動、感覺、認(rèn)知、精神障礙等問題，其中很多損害是終身性的［4］。TBI還有可能引起種種退行性疾病，如慢性創(chuàng)傷性腦病、阿爾茲海默病、帕金森?。?］。Hyder等預(yù)測到2020年TBI將成為全球第3大疾病負(fù)擔(dān)［6］。目前缺乏對TBI安全而有效的藥物治療［7］，尋求探索可治療TBI的治療措施具有重大意義。有相當(dāng)數(shù)量的臨床研究顯示單獨針灸治療或配合其他療法對于TBI急性期或恢復(fù)期意識、肢體運動、認(rèn)知、精神等障礙有確切療效［8］。血清膠質(zhì)纖維酸性蛋白 （GFAP）和S-100B蛋白對TBI有高度敏感性和特異性，TBI發(fā)生后，血液中的GFAP和S-100B蛋白水平可反映腦組織的損傷程度。本課題組觀察了針刺對TBI大鼠行為學(xué)和血清中 GFAP、S-100B蛋白水平的影響?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級Sprague-Dawley雄性大鼠120只，體質(zhì)量200～300 g，由首都醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供、飼養(yǎng)，室溫溫度（23±2） ℃，12/12 h 光照周期模擬晝夜交替，標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，自由飲水，將大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后再進(jìn)行試驗。實驗過程中對動物的處置符合《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》中的規(guī)定。

1.2 試劑和儀器 腦立體定位儀（68025，深圳市瑞沃德生命科技有限公司），全自動多功能酶標(biāo)儀（MULTISKAN MK3，Thermo，USA），電熱恒溫培養(yǎng)箱（DH4000A，天津泰斯特），MINI shaker （MH-1，kylin-Bell Lab Instruments QILINBEIER），Rat GFAP ELISA KIT（上海藍(lán)基生物科技有限公司），Rat S100B ELISA KIT（上海藍(lán)基生物科技有限公司），水合氯醛（F20080911，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司批號），一次性無菌針灸針（直徑0.30 mm，長 25 mm，華佗牌）。

1.3 分組與造模 按隨機(jī)數(shù)字表法，將120只大鼠隨機(jī)分成3組，每組40只：假手術(shù)組、模型組、針刺組，每組根據(jù)傷后不同時間點再隨機(jī)平均分成4個亞組：6 h組、1 d組、3 d組和5 d組。以10%水合氯醛（0.4 mL/100 g體質(zhì)量）腹腔注射麻醉大鼠，將大鼠以俯臥位固定于腦立體定位儀，頭部備皮消毒后，在其眼睛后方沿頭部正中線做長約1.5 cm的縱行切口，暴露前囟。并以大鼠左側(cè)腦半球，前囟旁開2.5 mm，向后1.5 mm處為圓心，用牙科鉆鉆出直徑4 mm的圓形骨窗，避免大鼠硬腦膜受損。參考Feeney法［9］自制自由落體打擊器進(jìn)行撞擊造模：將40 g的砝碼自40 cm高處自由落體撞擊打擊大鼠硬腦膜。打擊后清理創(chuàng)口，并在切口內(nèi)滴注4萬U硫酸慶大霉素0.2 mL以抗感染，將骨瓣還納于骨窗中，并用骨蠟封閉?？p合頭皮后將大鼠單籠飼養(yǎng)。假手術(shù)組：假手術(shù)組只開骨窗，不進(jìn)行TBI模型制備?？垢腥竟前赀€納封閉同針刺組。

1.4 干預(yù)方法 針刺組于TBI造模后即針刺大鼠雙側(cè)風(fēng)池穴、水溝穴、雙側(cè)內(nèi)關(guān)穴1次，直刺進(jìn)針約2～3 mm，穴位依照《大鼠穴位圖譜的研制》［10］進(jìn)行定位。風(fēng)池、內(nèi)關(guān)連接電針儀，電針參數(shù)采用疏密波波形，頻率為2～10 Hz，電流強(qiáng)度0.1～0.3 mA，治療每日1次，每次15 min。針刺組4個亞組（術(shù)后6 h組、1 d組、3 d組、5 d 組）各接受針刺治療 1、1、3、5 次。

1.5 標(biāo)本采集與檢測 術(shù)后6 h、1 d、3 d、5 d 3個時間點每組均隨機(jī)選出10只大鼠進(jìn)行下列指標(biāo)的觀察與檢測。1）血清GFAP、S-100B蛋白水平。mNSS評分后，腹腔注射水合氯醛麻醉大鼠，每只大鼠均進(jìn)行腹主動脈采血5 mL取血清，以ELISA法，按試劑盒說明檢測大鼠血清中GFAP、S-100B蛋白水平。2）改良的神經(jīng)功能缺損評分（mNSS）。mNSS評分包含運動、感覺（視覺、觸覺、本體感覺）、反射和平衡測試［11］。 滿分為18分，分?jǐn)?shù)越高代表神經(jīng)損傷功能越嚴(yán)重。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS20.0統(tǒng)計軟件。計量資料以±s）表示，同期組間數(shù)據(jù)采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組血清GFAP水平比較 見表1。根據(jù)模型組數(shù)據(jù)，傷后6 h即發(fā)現(xiàn)血清GFAP水平升高，隨后其水平下降，但傷后1 d仍顯著高于同期假手術(shù)組。傷后6 h、1 d檢測發(fā)現(xiàn)針刺組GFAP水平比同期模型組減低（P＜0.05），和假手術(shù)組無明顯差異（P＞0.05）。傷后 3 d和5 d時，各組同期數(shù)據(jù)相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 各組GFAP、S-100B蛋白水平及mNSS評分比較（

表1 各組GFAP、S-100B蛋白水平及mNSS評分比較（

與假手術(shù)組同期比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組同期比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。

組 別 時 間 mNSS評分假手術(shù)組 6 h 1.30±0.95（n＝10） 1 d 1.10±0.57 3 d 0.30±0.68 GFAP（ng/mL）S-100B 蛋白 （ng/mL）0.89±0.12 0.73±0.30 0.83±0.18 0.73±0.30 0.80±0.19 0.71±0.24 0.79±0.25 0.55±0.14模型組 6 h 1.21±0.18** 1.21±0.14** 11.40±1.65**5 d 0.10±0.32（n＝40） 1 d 1.17±0.19** 1.37±0.19** 9.20±1.69**3 d 0.87±0.22 1.47±0.18** 7.20±1.99**5 d 0.85±0.25 1.02±0.30** 5.60±2.37**針刺組 6 h 0.96±0.18△ 0.91±0.26△△ 9.65±1.65**△△（n＝40） 1 d 0.85±0.23△ 0.78±0.36△△ 6.50±0.85**△△3 d 0.82±0.17 0.75±0.28△△ 3.10±1.20**△△5 d 0.83±0.19 0.71±0.27 3.30±1.16**△

2.2 各組S-100B蛋白水平比較 見表1。根據(jù)模型組數(shù)據(jù)，大鼠傷后6 h即檢測到血清S-100B蛋白水平升高，數(shù)值最高峰出現(xiàn)在3 d，到5 d仍維持在較高水平。傷后6 h、1 d、3 d檢測發(fā)現(xiàn)針刺組S-100B蛋白水平比同期模型組顯著減低（P＜0.01），和假手術(shù)組無明顯差異（P＞0.05）。傷后5 d時，針刺組和其余兩組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），但數(shù)值明顯低于模型組。2.3 各組mNSS評分比較 見表1。經(jīng)統(tǒng)計分析后發(fā)現(xiàn)，傷后 6 h、1 d、3 d、5 d 模型組 mNSS 評分均顯著高于假手術(shù)組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。而針刺組mNSS評分雖然高于同期假手術(shù)組（P＜0.01），但顯著低于同期模型組（P＜0.05或P＜0.01），從數(shù)值上看針刺組數(shù)值顯著低于同期的模型組。

3 討 論

TBI可對人體產(chǎn)生諸多損害，根據(jù)損傷發(fā)生的時間，TBI可分為原發(fā)性腦損傷和繼發(fā)性腦損傷。原發(fā)性腦損傷是指外力對神經(jīng)、血管等組織造成的直接損傷，發(fā)生于損傷當(dāng)時，立刻產(chǎn)生臨床效應(yīng)，往往是不可逆轉(zhuǎn)的。繼發(fā)性腦損傷是隨后發(fā)生的，主要是指顱內(nèi)血腫和腦水腫，興奮性谷氨酸毒性、炎性反應(yīng)、氧自由基、Ca2+超載、缺血再灌注等病理性損害會導(dǎo)致一系列繼發(fā)性損傷。諸多動物、臨床研究已證實針灸對本病的療效。

血清中可作為TBI標(biāo)志物的幾種蛋白一直受到廣泛的關(guān)注，它們可以早期、高效地判斷評估TBI病情、治療效果和預(yù)后，其中GFAP和S-100B蛋白就是研究熱度高的兩種蛋白［12］。 夏小輝等［12］研究發(fā)現(xiàn) TBI患者血清中GFAP、S-100B蛋白水平均在第2天達(dá)峰值，第4～6天進(jìn)入平臺期，S-100B蛋白和GFAP水平均與其病情嚴(yán)重程度和Marshall CT分類呈正相關(guān)，與腦組織損傷的嚴(yán)重程度關(guān)系密切，聯(lián)合動態(tài)監(jiān)測這2個指標(biāo)對TBI患者的診斷及病情評估具有重要的臨床參考價值。

GFAP是單節(jié)顯性的中間絲狀蛋白，特定地表達(dá)在星形膠質(zhì)細(xì)胞中，是細(xì)胞骨架的主要組成部分［13］。它和反應(yīng)性星形細(xì)胞增生密切相關(guān)，反應(yīng)型星型細(xì)胞增生的典型表現(xiàn)是星形膠質(zhì)細(xì)胞增生或肥大，是許多中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的主要病理現(xiàn)象。眾多研究顯示受損組織局部GFAP免疫反應(yīng)活性的增強(qiáng)是神經(jīng)元損傷的靈敏指標(biāo)，也是星形膠質(zhì)細(xì)胞增生活躍的敏感指標(biāo)之一。在創(chuàng)傷或疾病導(dǎo)致的腦組織或脊髓細(xì)胞受損情況下血清 GFAP水平出現(xiàn)上升［14］，GFAP是 TBI損傷早期的可靠診斷依據(jù)之一，也和TBI嚴(yán)重程度和死亡率的有密切關(guān)系。Missler等通過對重型腦外傷患者的血清GFAP研究后發(fā)現(xiàn)，傷后3 h內(nèi)，其血清中的GFAP水平即明顯升高，損傷發(fā)生6 h后GFAP水平顯著下降［15］。Cikriklar等研究發(fā)現(xiàn)腦外傷大鼠造模后2 h血清GFAP的升高和創(chuàng)傷的嚴(yán)重程度成正比［16］。Huang等采集了TBI大鼠傷后3 h、6 h、24 h后的血清，發(fā)現(xiàn)在傷后第3小時和6 h兩個時間點上，血清中的GFAP含量均顯著上升，但傷后24 h時GFAP和正常時無差異［17］。方永軍等發(fā)現(xiàn)TBI大鼠血清GFAP含量在術(shù)后均有升高，術(shù)后第1天開始明顯升高，至第7天達(dá)峰值，后逐漸下降，至第14天仍明顯高于假手術(shù)組［18］。黃培贊等檢測了大鼠TBI造模后1 h、6 h、24 h時的血清GFAP的含量，發(fā)現(xiàn)隨著時間推移，其表達(dá)越來越高［19］。

S-100B蛋白也是一種TBI的特定的生物學(xué)標(biāo)記［20］，也是近年來TBI標(biāo)志物研究的熱點之一［21］。S-100B蛋白屬于鈣結(jié)合蛋白家族，主要分布于星形膠質(zhì)細(xì)胞和施旺細(xì)胞［22］，它參與調(diào)節(jié)復(fù)雜的神經(jīng)元-神經(jīng)膠質(zhì)反應(yīng)［13］，在TBI后通過破壞的血腦屏障進(jìn)入血液。郭新榮等研究發(fā)現(xiàn)大鼠腦損傷發(fā)生后血清S-100B含量顯著上升，表現(xiàn)為傷后第1天、第2天、第3天其含量逐步上升［23］。還有研究發(fā)現(xiàn)TBI大鼠血清S-100B蛋白水平在傷后6 h開始升高，24 h達(dá)高峰，72 h基本回復(fù)正常水平［24］。大鼠血清S-100B蛋白濃度在腦外傷后立即升高，并在第24小時達(dá)到高峰，此后雖有緩慢下降但直至傷后第7天仍保持在較高水平［25］。

本研究發(fā)現(xiàn)，TBI傷后6 h即檢測到血清GFAP和S-100B蛋白水平升高，GFAP峰值出現(xiàn)在傷后6 h，S-100B蛋白出現(xiàn)在第3天。第3天和第5天TBI大鼠GFAP和假手術(shù)組大鼠無異，但TBI大鼠S-100B蛋白水平直到第5天仍保持在較高水平。驗證了相關(guān)研究所說的TBI早期可應(yīng)用GFAP和S-100B蛋白評估TBI病情、治療效果和預(yù)后。傷后6 h、1 d檢測發(fā)現(xiàn)針刺組GFAP水平比同期模型組降低，傷后6 h、1 d、3 d檢測發(fā)現(xiàn)針刺組S-100B蛋白水平比同期模型組顯著減低，說明早期針刺可減輕TBI大鼠的腦損傷。再結(jié)合mNSS 評分， 傷后 6 h、1 d、3 d、5 d 模型組 mNSS 評分均顯著高于假手術(shù)組，說明TBI造模后，大鼠有顯著的神經(jīng)功能受損。而針刺組mNSS評分雖然高于同期假手術(shù)組，但顯著低于同期模型組，從數(shù)值上看針刺組數(shù)值顯著低于同期的模型組，說明針刺能改善TBI后神經(jīng)功能損傷。以上數(shù)據(jù)從mNSS評分、GFAP和S-100B蛋白水平血清角度證實TBI早期采用針刺干預(yù)可取得不錯的療效治療，可明顯減輕大鼠腦損傷的程度。本研究雖證實針刺對TBI早期起效，但最佳干預(yù)時機(jī)及其具體起效機(jī)制仍待進(jìn)一步研究。

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Effects of Early Acupuncture on Serum GFAP and S-100B Protein in Rats with Traumatic Brain Injury

DU Ruosang，YUAN Hongwen，ZHENG Shumei，et al.Capital Medical University，Beijing 100069，China.

Objective： To observe the effect of acupuncture on serum glial fibrillary acidic protein （GFAP） and S-100B protein in rats with traumatic brain injury （TBI），and to evaluate the therapeutic effect of acupuncture on traumatic brain injury.Methods： 120 male SD rats were randomly divided into 4 groups，40 rats in each group：the sham operation group，the model group and the acupuncture group.In the sham operation group，only the bone window was opened and the model was not prepared；the TBI model was prepared in the model group and the acupuncture group；the acupuncture group

acupuncture treatment once a day after molding.6 h，1 d，3 d and 5 d after operation were taken as four time points.10 rats were randomly selected from each group at one time point.The contents of serum GFAP，S-100B protein and mNSS were observed and detected.Results： Compared with the sham operation group，the serum GFAP and S-100B protein levels increased in the model group only after 6 h（P<0.01）.At 6h and 1d after injury，it was showed that the GFAP level in the acupuncture group was lower than that in the model group（P<0.05）.Data of 6 h，1 d and 3 d showed that the level of S-100B protein in the acupuncture group was significantly lower than that in the model group （P<0.01）.The mNSS scores of the model group were higher than those of the sham operation group （P<0.01） and the score of the acupuncture group was significantly lower than that of the model group （P<0.01 or P<0.05）.Conclusion： Early intervention with acupuncture can obviously relieve the brain damage in rats with TBI.

Traumatic brain injury；Acupuncture；GFAP；S-100B protein；mNSS score

R245.3

A

1004-745X（2017）09-1589-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2017.09.026

2017-05-26）

首都醫(yī)科大學(xué)科研基金項目（自然科學(xué)類）（17ZR26）

△通信作者（電子郵箱：drcuihai@163.com）