通心絡(luò)對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷中肥大細(xì)胞脫顆粒誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)的作用機(jī)制*

黃 婷 李紹旦 李 涵 張俊修 劉 毅 楊明會(huì)△

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029；2.中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院，北京 100853）

通心絡(luò)對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷中肥大細(xì)胞脫顆粒誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)的作用機(jī)制*

黃 婷1，2李紹旦2李 涵2張俊修2劉 毅2楊明會(huì)2△

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029；2.中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院，北京 100853）

目的 觀察通心絡(luò)對(duì)肥大細(xì)胞干預(yù)的缺血再灌注模型大鼠心肌損傷的保護(hù)作用并探討其機(jī)制。方法

將36只健康成年雄性SD大鼠隨機(jī)分成假手術(shù)組、模型組、通心絡(luò)組。通過(guò)可逆性左冠狀動(dòng)脈前降支結(jié)扎法建立心肌缺血再灌注模型，大鼠心肌缺血1 h，再灌注2 h；假手術(shù)組僅穿線不結(jié)扎。通心絡(luò)組大鼠予通心絡(luò)灌胃，假手術(shù)組和模型組給予等量的0.9%氯化鈉注射液灌胃。1周后采用HE染色方法觀察心肌組織病理改變，取腹主動(dòng)脈血檢測(cè)血常規(guī)、生化、血清脾酪氨酸激酶（Syk）、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）的磷酸化水平以及5-羥色胺（5-HT）等指標(biāo)。結(jié)果 通心絡(luò)組大鼠5-HT的表達(dá)及Syk的磷酸化水平較模型組均明顯降低，ERK的磷酸化水平較模型組明顯升高（P＜0.01）。結(jié)論 通心絡(luò)通過(guò)降低5-HT及Syk的磷酸化水平，升高ERK的磷酸化水平，抑制肥大細(xì)胞脫顆粒誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，減輕心肌損傷，進(jìn)而保護(hù)心肌組織。

通心絡(luò) 心肌缺血再灌注 肥大細(xì)胞脫顆粒 炎癥反應(yīng)

在冠脈缺血基礎(chǔ)上恢復(fù)血流時(shí)，組織細(xì)胞損傷反而加重，甚至發(fā)生不可逆性損傷，此現(xiàn)象稱為心肌缺血再灌注損傷（MIRI），對(duì)于挽救缺血心肌，減輕心肌組織微血管的損傷，降低病死率是一大難題［1］。根據(jù)其病位和臨床表現(xiàn)，應(yīng)屬于中醫(yī)學(xué)“胸痹”“真心痛”“心悸”范疇，基本病機(jī)為本虛標(biāo)實(shí)；標(biāo)實(shí)為氣滯、血瘀、痰飲、寒凝、熱結(jié)等，本虛包括氣血陰陽(yáng)的虛損。中藥復(fù)方通心絡(luò)以吳以嶺院士“由絡(luò)以通、交會(huì)生化”的絡(luò)病理論為指導(dǎo)，以全蝎、蜈蚣、蟬蛻搜積通絡(luò)，水蛭、土鱉蟲(chóng)剔除絡(luò)瘀，桂枝、薤白、降香疏絡(luò)暢氣，人參、黃芪補(bǔ)氣通絡(luò)，全方滲灌氣血、濡養(yǎng)代謝［2］。本研究從模型大鼠心肌凋亡程度以及肥大細(xì)胞脫顆粒誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)等方面，探討通心絡(luò)對(duì)受損心肌的保護(hù)作用及機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 1）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。SPF級(jí)SD雄性大鼠36只，購(gòu)自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物中心，許可證號(hào)SCXK-（軍）2012-0004）；體質(zhì)量（240±20） g，每籠 5 只飼養(yǎng)于獨(dú)立通氣籠具系統(tǒng)內(nèi)。溫度（22±1） ℃，濕度（50±5） %，每天光照與黑夜時(shí)間各12 h。實(shí)驗(yàn)期間造模、取材等操作均在超凈工作臺(tái)內(nèi)進(jìn)行，添加飼料、換水、灌藥等由專人負(fù)責(zé)管理。2）藥物及試劑。通心絡(luò)超微粉（石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)SY1605001）；烏拉坦（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)T2011110）；4%多聚甲醛（盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司，批號(hào)AR-0211）；蘇木素染液、伊紅染液（北京雪邦科技有限公司）；5-羥色胺（5-HT）ELISA檢測(cè)試劑盒（上海喬羽生物科技有限公司，批號(hào)YM-R30326）；脾酪氨酸激酶（Syk）ELISA檢測(cè)試劑盒（上海喬羽生物科技有限公司，批號(hào)YMR10956）；細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）ELISA檢測(cè)試劑盒（上海喬羽生物科技有限公司，批號(hào)YM-R51811）。3）主要儀器。超凈工作臺(tái)（北京長(zhǎng)城空氣凈化工程公司）；電子秤（長(zhǎng)沙湘平科技發(fā)展有限公司，EPS2001）；小動(dòng)物心電圖機(jī) （北京福田電子醫(yī)療儀器有限公司，F(xiàn)X211）；動(dòng)物呼吸機(jī)（上海奧爾科特生物科技有限公司，ALC-V9）； 高速離心機(jī) （Perkin Elmer VICTOR X5）；Multiskan MK3 酶標(biāo)儀 （Thermo Fisher Scientific公司）；恒溫箱（天津泰斯特儀器有限公司，DH3600）；顯微鏡（日本尼康，Nikon Ci-S）

1.2 分組及給藥 選取心電圖正常大鼠36只，采用隨機(jī)數(shù)字表法分成假手術(shù)組、模型組、通心絡(luò)組，每組12只。通心絡(luò)組大鼠予通心絡(luò)超微粉以1.0 g/（kg·d）并溶于0.9%氯化鈉注射液2 mL灌胃，假手術(shù)組和模型組給予等量的0.9%氯化鈉注射液灌胃，分別連續(xù)灌胃1周。

1.3 模型制備 心肌缺血再灌注模型參考文獻(xiàn)［3］。給藥1周后。大鼠以5 mL/kg腹腔注射20%烏拉坦麻醉后，采用面罩覆蓋口鼻連接呼吸機(jī)，設(shè)定呼吸頻率80 次/min、潮氣量 15 mL/kg、呼吸比 1∶1。 胸部備皮、碘伏消毒。于大鼠左側(cè)胸壁3～4肋間縱向切開(kāi)皮膚約2 cm，止血鉗鈍性分離，開(kāi)胸，暴露心臟，剝離心包膜，在肺動(dòng)脈圓錐與左心耳之間，左心耳下緣約2～3 mm處結(jié)扎，冠脈與結(jié)扎線之間使用5號(hào)白線隔開(kāi)，假手術(shù)組只穿線，不接扎。進(jìn)針深度約1～1.5 mm，寬約2.0 mm，用彎止血鉗將胸部皮膚和肌肉夾緊關(guān)閉胸腔，呼吸機(jī)維持10～15 min，待大鼠自主呼吸恢復(fù)觀察心電圖改變。造模成功標(biāo)志：室壁運(yùn)動(dòng)減弱，結(jié)扎下部心肌組織顏色變白，心電圖可見(jiàn)胸前各個(gè)導(dǎo)聯(lián)的ST段抬高、T波高聳為。冠脈結(jié)扎1 h后，連接呼吸機(jī)，逐層打開(kāi)胸腔，松開(kāi)結(jié)扎線，完成再灌注。

1.4 標(biāo)本采集與檢測(cè) 大鼠再灌注2 h后，采集心電圖，腹主動(dòng)脈取血5 mL，摘取心臟，予4%多聚甲醛保存。HE染色：將心肌組織樣本脫水、包埋切成4 μm的薄片，常規(guī)染色，光鏡觀察。取1 mL血標(biāo)本檢測(cè)血常規(guī)，高速離心機(jī)分離血清，檢測(cè)生化指標(biāo)；予ELISA試劑盒分別檢測(cè)血清Syk、ERK的磷酸化水平、5-HT水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS20．0統(tǒng)計(jì)軟件。所有數(shù)據(jù)均進(jìn)行正態(tài)性和方差齊性檢驗(yàn)。多組間比較采用單因素方差分析，方差齊時(shí)釆用LSD法、Dunnett法進(jìn)行兩兩比較；方差不齊時(shí)，進(jìn)行Welch近似方差分析，采用Tamhane’s T2法進(jìn)行兩兩比較。若不服從正態(tài)分布，則進(jìn)行非參數(shù)檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠心電圖改變比較 假手術(shù)組再灌2 h后與造模后比較，部分大鼠心電圖肢體導(dǎo)聯(lián)Ⅱ、Ⅲ、ST段輕度的抬高，Ⅱ?qū)?lián)出現(xiàn)病理性Q波。模型組大鼠心電圖肢體導(dǎo)聯(lián)Ⅱ、ST段有不同程度的抬高，肢體導(dǎo)聯(lián)Ⅲ、T波倒置，部分大鼠再灌注后出現(xiàn)心律失常。通心絡(luò)組大鼠再灌2 h后，部分心電圖T波抬高回落約0.06 s，QRS波群寬大畸形的概率低于模型組，模型組大鼠再灌注后T波回落較少，部分甚至上抬。

2.2 各組大鼠心肌標(biāo)本組織HE染色比較 假手術(shù)組大鼠心肌纖維大致排列規(guī)則，部分肌纖維可見(jiàn)嗜酸性變及心肌斷裂現(xiàn)象，肌核居中卵圓形或梭形，其形態(tài)及結(jié)構(gòu)正常，部分心肌間質(zhì)水腫及出血改變。模型組大鼠心肌纖維凝固型壞死、核碎裂、消失，胞質(zhì)均質(zhì)紅染或規(guī)則粗顆粒狀，間質(zhì)水腫，不同程度的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，心肌細(xì)胞核呈卵圓形或梭形，其形態(tài)及結(jié)構(gòu)未見(jiàn)明顯異常改變，部分心肌梗死灶外圍出現(xiàn)充血出血帶。通心絡(luò)組大鼠部分心肌纖維凝固型壞死，胞漿嗜酸性變，可見(jiàn)橫紋不清，甚至消失，呈紅染均質(zhì)狀，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度較模型組減輕。見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠心肌標(biāo)本HE染色形態(tài)學(xué)改變（HE染色，20倍）

2.3 各組大鼠血常規(guī)檢測(cè)結(jié)果比較 見(jiàn)表1。與模型組相較，通心絡(luò)組大鼠白細(xì)胞（WBC）數(shù)量顯著降低（P＜0.01）；假手術(shù)組大鼠 WBC 數(shù)量顯著降低（P＜0.01）。通心絡(luò)組大鼠血小板（PLT）水平與假手術(shù)組、模型組相比均降低（P＜0.05或 P＜0.01）。

2.4 各組大鼠血生化Ca2+、CK、LDH水平比較 見(jiàn)表2。與假手術(shù)組相比，模型組大鼠血清Ca2+、CK、LDH水平升高（P＜0.05或P＜0.01）；與模型組相比，通心絡(luò)組血清Ca2+、CK、LDH水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或 P＜0.01）。

表1 各組大鼠血常規(guī)結(jié)果比較（109/L

表1 各組大鼠血常規(guī)結(jié)果比較（109/L

與假手術(shù)組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同。

組 別 n WBC PLT假手術(shù)組 12 7.22±1.41△△ 1102.17±124.52模型組 12 14.45±1.01* 1252.40±239.27通心絡(luò)組 12 6.26±1.36△△ 915.00±136.44**△△

表 2 各組大鼠血清 Ca2+、CK、LDH 水平比較（

表 2 各組大鼠血清 Ca2+、CK、LDH 水平比較（

組 別 n LDH（IU/L）Ca2+（mmol/L） CK（IU/L）假手術(shù)組 12 983.84±178.09△△模型組 12 1948.04±597.83**2.38±0.03△ 5330.98±223.99△2.51±0.10* 8326.95±1236.06*通心絡(luò)組 12 1235.40±271.44△2.27±0.02**△△ 4401.38±980.91△

2.5 各組血清Syk、ERK、5-HT水平比較 見(jiàn)表3。與假手術(shù)組相比，模型組與通心絡(luò)組大鼠的血清Syk、5-HT水平均降低，且大鼠血清ERK水平均升高（P＜0.05或P＜0.01）；通心絡(luò)組與模型組相比，大鼠血清Syk、5-HT水平顯著降低，ERK水平顯著升高（P＜0.01）。

表 3 各組大鼠血清Syk、ERK、5-HT 水平比較（pg/mL

表 3 各組大鼠血清Syk、ERK、5-HT 水平比較（pg/mL

組 別 n Syk ERK 5-HT假手術(shù)組 12 690.81±15.76△△模型組 12 857.80±83.80**1207.22±143.95△△ 2169.65±141.13△△1559.87±107.71** 1956.40±90.51**通心絡(luò)組 12 608.78±26.59**△△1100.53±127.87*△△ 2676.06±170.63**△△

3 討 論

隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)技術(shù)的發(fā)展，一些動(dòng)脈搭橋術(shù)、溶栓療法、經(jīng)皮腔內(nèi)冠脈血管成形術(shù)等應(yīng)用于心肌缺血的治療，隨之帶來(lái)心肌缺血再灌注損傷（MIRI）的發(fā)生率逐年升高，成為臨床治療的一大難題。心肌缺血再灌注的炎癥反應(yīng)進(jìn)一步加重心肌損傷［3］，其中肥大細(xì)胞脫顆粒介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)較為突出。

肥大細(xì)胞（Mast Cell）［4］廣泛分布在皮膚及內(nèi)臟黏膜下的微血管周圍，存在血液中的MC，含有肝素、組織胺、5-羥色胺等，抗原刺激時(shí)，膜表面受體活化，使Syk和Fyn蛋白酪氨酸激酶活化，形成肥大細(xì)胞脫顆粒的初始信號(hào)［5］。TPS、c-Fos是主要由 MC 分泌的炎癥介質(zhì)［6］，經(jīng)肥大細(xì)胞脫顆粒釋放到細(xì)胞外，因其在MC的貯存和表達(dá)中具有高度選擇性，故可作為MC激活及其脫顆粒的標(biāo)志［7］。肥大細(xì)胞脫顆粒反應(yīng)依賴于Ca2+濃度［8］，釋放組胺、5-羥色胺等介質(zhì)，激活炎癥反應(yīng)，破壞胞膜線粒體等微觀結(jié)構(gòu)，加重心肌損傷［9］。肥大細(xì)胞脫顆粒上游的Syk、ERK水平的變化與心肌Ca2+損傷嚴(yán)重程度相關(guān)，Syk磷酸化水平升高，MC激活脫顆?；?，加重炎癥反應(yīng)［10］；研究發(fā)現(xiàn)抑制MC的激活，血清中ERK磷酸化水平升高，可保護(hù)受損心肌［11］。

中藥復(fù)方通心絡(luò)以“絡(luò)以通為用”的治療原則［12］，運(yùn)用搜剔疏通類藥物，改善微循環(huán)；既往課題組研究發(fā)現(xiàn)通心絡(luò)超微粉滲灌氣血，濡養(yǎng)臟腑［13］，可保護(hù)血管內(nèi)皮損傷，減少心梗無(wú)再流面積，減輕心肌再灌注損傷［14］；通過(guò)多途徑、多環(huán)節(jié)、多靶點(diǎn)影響疾病的進(jìn)程，改善心肌受損嚴(yán)重程度和預(yù)后［15］。

本研究結(jié)果顯示，通心絡(luò)組大鼠心肌組織的凋亡指數(shù)，較模型組顯著降低；表明通心絡(luò)超微粉可減輕心肌細(xì)胞的凋亡； 血清中TPS、c-Fos、Syk、5-HT水平在模型組顯著升高，在通心絡(luò)組顯著降低，表明通心絡(luò)可減輕心肌損傷中的炎癥反應(yīng)；血清中ERK水平在通心絡(luò)組升高，表明通心絡(luò)超微粉可促進(jìn)細(xì)胞自我修復(fù)功能，綜上述通心絡(luò)超微粉可減輕心肌缺血再灌注過(guò)程中肥大細(xì)胞脫顆粒介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，保護(hù)受損心肌。為臨床疾病的防治和治療有指導(dǎo)意義。

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Effects of Tongxinluo Decoction on Inflammatory Response Induced by Degranulation of Mast Cells in Rats with Myocardial Ischemia Reperfusion Injury

HUANG Ting，LI Shaodan，LI Han，et al. Beijing Uni-versity of Chinese Medicine，Beijing 100029，China.

Objective： To discuss the protective effect and mechanism of Tongxinluo Decoction on myocardial injury induced by mast cells in rats with ischemia reperfusion injury，and explore its mechanism.Methods： 36 healthy adult male SD rats were randomly divided into the sham operation group，the model group，and Tongxinluo Decoction group.Myocardial ischemia reperfusion model was established by ligation of the left anterior descending coronary artery，myocardial ischemia for 1 H，and reperfusion for 2 H；while the sham group was punctured without ligation.The rats in Tongxinluo Decoction group

intragastric administration with Tongxinluo Decoction，and the model group and the sham group were intragastric administration with saline.After 1 weeks，changes of pathological in myocardium were observed by HE staining；routine blood test，blood biochemical examination，serum Phosphorylation level of Syk and ERK and 5-HT were detected.Results：The expression of 5-HT and Syk phosphorylation levels of Tongxinluo Decoction group were significantly lower than those in the model group，and the phosphorylation level of ERK increased significantly，compared with the model group（P<0.01）.Conclusion：Tongxinluo Decoction can inhibit the inflammatory reaction induced by mast cell degranulation by reducing the phosphorylation level of 5-HT and Syk and increasing the phosphorylation level of ERK，reduce myocardial injury and then protect myocardial tissue.

Tongxinluo Decoction；Myocardial ischemia reperfusion；Mast cell degranulation；Inflammatory reaction

R285.5

A

1004-745X（2017）09-1514-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2017.09.003

2017-05-09）

國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃（973計(jì)劃）（2012CB518601）

△通信作者（電子郵箱：ymh9651@sina.com）