依賴HIV-1 Tat的毒素蛋白MazF表達(dá)系統(tǒng)的建立

萬振洲 姚瑾 胡軼紅 張馳宇

225300 泰州市第四人民醫(yī)院檢驗(yàn)科(萬振洲)；200031上海，中國科學(xué)院上海巴斯德研究所病原診斷中心(姚瑾、胡軼紅、張馳宇)

·技術(shù)方法·

依賴HIV-1 Tat的毒素蛋白MazF表達(dá)系統(tǒng)的建立

萬振洲 姚瑾 胡軼紅 張馳宇

225300 泰州市第四人民醫(yī)院檢驗(yàn)科(萬振洲)；200031上海，中國科學(xué)院上海巴斯德研究所病原診斷中心(姚瑾、胡軼紅、張馳宇)

目的建立HIV-1 Tat依賴的MazF表達(dá)載體pcDNA3.1-GFP-HA-MazF-U3TAR系統(tǒng)。方法分別擴(kuò)增HIV-1 U3TAR和MazF基因片段，通過重疊PCR將U3TAR和MazF連接起來，并TA克隆到pMD18T載體中。通過PCR為MazF引入HA標(biāo)簽，獲得U3TAR-MazF-HA。經(jīng)過雙酶切和連接反應(yīng)，將U3TAR-MazF-HA反向插入到pcDNA3.1，獲得pcDNA3.1-HA-MazF-U3TAR。將GFP基因正向插入到MazF基因之后，為該載體引入了熒光報(bào)道基因，獲得pcDNA3.1-GFP-HA-MazF-U3TAR。結(jié)果與pcDNA3.1-tat-flag的共轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)證明，構(gòu)建的MazF表達(dá)載體pcDNA3.1-GFP-HA-MazF-U3TAR是Tat依賴的。對(duì)比pcDNA3.1-GFP-HA-MazF-U3TAR單轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞具有更少的綠色熒光信號(hào)，表明表達(dá)的MazF可以下調(diào)報(bào)道基因GFP的表達(dá)。結(jié)論pcDNA3.1-GFP-HA-MazF-U3TAR的構(gòu)建，為探索基于MazF的艾滋病基因治療方案提供了載體工具。

自1981年首次發(fā)現(xiàn)艾滋病以來，全球累計(jì)已經(jīng)感染7 000多萬人，其中3 000多萬人已死于艾滋病相關(guān)的疾病。截至2014年末，全球估計(jì)有3 690萬人攜帶艾滋病病毒(HIV)。雖然抗病毒聯(lián)合療法(雞尾酒療法)在艾滋病的預(yù)防控制方面發(fā)揮了極大的作用，但是目前依然沒有可以有效治愈艾滋病的治療方案和預(yù)防控制艾滋病進(jìn)一步傳播的疫苗[1]。尋找新的治療艾滋病的策略是該領(lǐng)域的重要課題。

毒素蛋白MazF是從大腸埃希菌中分離出來的一種核糖核酸內(nèi)切酶，可以特異性地切割mRNA上的ACA序列，破壞mRNA，從而下調(diào)或阻止相關(guān)蛋白的表達(dá)[2-3]。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中過表達(dá)的MazF可以優(yōu)先切割mRNA而不是rRNA[2,4]，提示其可以作為一種毒素蛋白用于腫瘤或者艾滋病的基因治療。HIV-1是導(dǎo)致全球艾滋病流行的主要病原體，其基因組是2條正鏈的RNA。不同亞型的HIV-1基因組中包含約240個(gè)ACA序列(未發(fā)表數(shù)據(jù))，這些ACA可以作為MazF的靶點(diǎn)，被MazF切割，從而破壞HIV-1的RNA基因組以及mRNA，抑制病毒的復(fù)制。這為MazF用于艾滋病的基因治療提供理論依據(jù)。HIV-1的Tat蛋白是HIV-1 編碼的反式轉(zhuǎn)錄激活因子(Trans-activator of transcription,Tat)[5]，通過與HIV-1 RNA基因組上的反式激活效應(yīng)區(qū)(Trans-activator responseregion,TAR)相互作用，反式激活HIV-1基因組的轉(zhuǎn)錄起始和延伸，增強(qiáng)病毒復(fù)制[6-7]。本研究利用Tat和TAR的轉(zhuǎn)錄激活元件，構(gòu)建Tat依賴的MazF真核表達(dá)系統(tǒng)，并驗(yàn)證該表達(dá)系統(tǒng)的可行性，為下一步構(gòu)建基于MazF的AIDS基因治療方案奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1菌種、質(zhì)粒和細(xì)胞pcDNA3.1真核表達(dá)載體、DH5a菌株及HEK293T細(xì)胞系由中國科學(xué)院上海巴斯德研究所病原診斷中心保存。pMDl8T載體購自TaKaRa寶生物工程(大連)公司。質(zhì)粒pET28a-MazF和pCR2.1-U3TAR由病原診斷中心構(gòu)建(未發(fā)表)。

1.2主要試劑和試劑盒Taq PCR MasterMix和質(zhì)粒提取試劑盒為TIANGEN公司的產(chǎn)品；膠回收試劑盒、多聚A加尾試劑盒、T4連接酶、T4核苷酸激酶、限制性內(nèi)切酶、DNA分子量Marker均購自TaKaRa寶生物工程(大連)公司；氨芐抗生素購自Sigma公司；酵母提取物、蛋白胨、瓊脂粉為OXOID公司產(chǎn)品；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(Fetal Bovine Serum，F(xiàn)BS)、青霉素(10 000 U/ml)、鏈霉素(10 000I-tg/ml)均購自GIBCO公司。預(yù)染蛋白分子量Marker購自mmo公司；硝酸纖維素膜(0.22 prn)為Millipore公司產(chǎn)品；HA標(biāo)簽抗體為Santa Cruz公司產(chǎn)品；辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠抗體購自Promega公司。引物由鉑尚生物技術(shù)(上海)有限公司合成。

1.3U3TAR-MazF片段的擴(kuò)增依據(jù)HIV-1 U3-TAR和大腸埃希菌MazF序列，分別設(shè)計(jì)擴(kuò)增U3-TAR和MazF的特異性引物。為了便于將U3-TAR和MazF擴(kuò)增產(chǎn)物連接起來，并且克隆到pcDNA3.1中，形成依賴U3-TAR啟動(dòng)子(Tat依賴)的MazF表達(dá)體系，本研究將U3-TAR的下游引物和MazF的上游引物設(shè)計(jì)為重疊引物，并在U3-TAR的上游引物和MazF的下游引物的5’端分別添加了EcoRⅠ和HindⅢ的限制性酶切位點(diǎn)。擴(kuò)增U3-TAR的引物為：U3TAR(F): 5’CCGGAATTCTGGAAGGGCTAATTTAC3’(EcoRⅠ)和U3TAR(R):5’TATCGGCTTACCATTGGGTTCCCTAGTT3’。擴(kuò)增MazF的引物為mazF(F): 5’AACTAGGGAACCCAATGGTAAGCCGATA-3’和mazF(R): 5’-CCCAAGCTTCTACCCAATCAGTACG-3’(HindⅢ)。分別以質(zhì)粒pCR2.1-U3TAR和pET28a-MazF為模板，用U3-TAR和MazF引物擴(kuò)增獲得相應(yīng)的產(chǎn)物，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，膠回收擴(kuò)增產(chǎn)物。以純化的U3-TAR和MazF產(chǎn)物為模板，用引物U3TAR(F)和MazF(R)進(jìn)行重疊PCR擴(kuò)增。

1.4pMD18-U3TAR-MazF的構(gòu)建構(gòu)建10 μl的連接反應(yīng)體系，將膠回收的U3TAR-MazF產(chǎn)物TA克隆到pMDl8T中，構(gòu)建pMDl8-U3TAR-MazF。取5 μl連接產(chǎn)物加入到100 μl的DH5α感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化。鋪平板過夜培養(yǎng)，用菌液PCR篩選陽性克隆，擴(kuò)大培養(yǎng)后，提取質(zhì)粒。

1.5pcDNA3.1-HA-MazF-U3TAR表達(dá)載體的構(gòu)建為了便于后期表達(dá)MazF蛋白的檢測，本研究設(shè)計(jì)一套引物，為MazF添加HA標(biāo)簽。所用引物為：U3TAR-MazF-HA(F):5’-CCGCTCGAGTGGAAGGGCTAATTTACTCCCAAAG-3’(XhoI)，U3TAR-MazF-HA(R)5’-CCGGAATTCCTAAGCATAATCTGGAACATCATATGGATACCCAATCAGTACGTTAA-3’(EcoRⅠ)。為了便于U3TAR-MazF-HA反向插入pcDNA3.1，在U3TAR-MazF-HA的上游和下游的5’-端分別添加了XhoI和EcoRⅠ的限制性酶切位點(diǎn)。以pMD18-U3TAR-MazF為模板，用U3TAR-MazF-HA引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得U3TAR-MazF-HA。反應(yīng)程序如下：94 ℃預(yù)變性2 min；98 ℃變性10 s、46 ℃退火30 S、68 ℃延伸1 min，共5個(gè)循環(huán)；98 ℃變性10 s、59 ℃退火30 s、68 ℃延伸1 min，共25個(gè)循環(huán)；68 ℃延伸7 min。電泳鑒定后，膠回收擴(kuò)增產(chǎn)物。用XhoI和EcoRⅠ分別構(gòu)建50 μl的U3TAR-MazF-HA和pcDNA3.1的雙酶切反應(yīng)，置37 ℃水浴鍋中反應(yīng)1．5 h。為了防止酶切后的pcDNA3.1自身環(huán)化，加入10xSAP buffer 5 μl和SAP 1 μl置37 ℃水浴鍋中繼續(xù)反應(yīng)30 min。膠回收酶切產(chǎn)物后，構(gòu)建10 μl連接反應(yīng)，將pU3TAR-MazF鏈接到pcDNA3.1中。因?yàn)閁3TAR-MazF-HA是反向連接到pcDNA3.1中。將構(gòu)建的質(zhì)粒命名為pcDNA3.1-HA-MazF-U3TAR。轉(zhuǎn)化、搖菌、菌液PCR驗(yàn)證后，挑選陽性克隆送鉑尚生物技術(shù)(上海)有限公司測序驗(yàn)證。

1.6pcDNA3.1-GFP-HA-MazF-U3TAR的構(gòu)建設(shè)計(jì)GFP擴(kuò)增引物(GFP-F：5’-CCCAAGCTTATGGCCACAACCAA-3’(HindⅢ)，GFP-R：5’-CCCAAGCTTTTACTTAGTACAGCTCG-3’(HindⅢ))。以本實(shí)驗(yàn)室保存的PMDl9-GFP為模板擴(kuò)增GFP基因。電泳鑒定并膠回收擴(kuò)增產(chǎn)物后，用HindⅢ對(duì)GFP膠回收產(chǎn)物和pcDNA3.1-HA-MazF-U3TAR進(jìn)行單-酶切。膠回收酶切產(chǎn)物后，構(gòu)建連接反應(yīng)，將GFP連接到pcDNA3.1-HA-MazF-U3TAR中。轉(zhuǎn)化、搖菌、菌液PCR驗(yàn)證后，挑選陽性克隆送鉑尚生物技術(shù)(上海)有限公司測序驗(yàn)證，并挑選GFP正向插入的質(zhì)粒，命名為pcDNA3.1-GFP-HA-MazF-U3TAR。

1.7轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)、Westernblot和熒光顯微鏡檢測將生長狀態(tài)良好的HEK293T細(xì)胞接種于6孔板中，每孔約1.5～2×106個(gè)細(xì)胞，37 ℃ CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞密度達(dá)到50%～60%時(shí)進(jìn)行磷酸鈣法轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后，將細(xì)胞置于37 ℃ CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8 h后，換成新鮮的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)至48 h收樣。棄除培養(yǎng)基，用預(yù)冷的1 ml 1xPBS洗三次，然后再加入1 ml PBS輕輕地吹落貼壁貼壁細(xì)胞，置于1.5 ml離心管中，12 000轉(zhuǎn)/分離心1 min，棄上清，加入總體積為100 μl的2×蛋白上樣緩沖液和DTT(2x蛋白上樣緩沖液與DTT的體積比為9∶1)混合液重懸細(xì)胞，然后100 ℃煮樣10 min。選用15%的聚丙烯酰胺凝膠，取10 μl的蛋白預(yù)染Marker和15 μl處理的樣品進(jìn)行SDS-PAGE。之后用抗HA抗體進(jìn)行Western blotting檢測MazF的表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1pMD18-U3TAR-MazF的構(gòu)建分別以實(shí)驗(yàn)室保存的質(zhì)粒pCR2.1-U3TAR和pET28a-MazF為模板，用特異性引物擴(kuò)增出U3TAR和MazF的基因片段。電泳鑒定顯示U3TAR和MazF的擴(kuò)增產(chǎn)物在336 bp和513 bp處有特異性條帶，表明獲得了2個(gè)基因片段。膠回收2個(gè)擴(kuò)增產(chǎn)物后，以2 個(gè)擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，以U3TAR(F)和MazF(R)為引物，進(jìn)行重疊PCR擴(kuò)增。因?yàn)閁3-TAR的下游引物和MazF的上游引物是重疊引物， PCR變性后，U3TAR片段正鏈?zhǔn)?’端和MazF片段負(fù)鏈的3’端的28個(gè)堿基互補(bǔ)配對(duì)，互為模板延伸形成U3TAR-MazF。電泳顯示在867bp有特異性條帶，表明獲得U3TAR-MazF產(chǎn)物。膠回收后，將回收產(chǎn)物TA克隆到pMD18中，獲得pMD18-U3TAR-MazF。

2.2pcDNA3.1-HA-MazF-U3TAR的構(gòu)建以pMD18-U3TAR-MazF為模板，用引物U3TAR-MazF-HA(F)和U3TAR-MazF-HA(R)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。電泳顯示在894 bp處有一特異性帶，其大小與預(yù)期片段一致。膠回收擴(kuò)增產(chǎn)物后，將其與pcDNA3.1分別用XhoI和EcoRⅠ進(jìn)行雙酶切。去磷酸化后，膠回收U3TAR-MazF-HA和pcDNA3.1片段并進(jìn)行連接，獲得pcDNA3.1-HA-MazF-U3TAR。轉(zhuǎn)化、擴(kuò)增后，挑陽性克隆測序結(jié)果確認(rèn)U3TAR-MazF-HA片段反向插入到了pcDNA3.1中，表明pcDNA3.1-HA-MazF-U3TAR構(gòu)建成功。

2.3pcDNA3.1-GFP-HA-MazF-U3TAR的構(gòu)建以pMDl9-T-GFP為模板，用引物GFP(F)和GFP(R)擴(kuò)增出GFP基因。電泳顯示741bp處有特異性條帶。膠回收產(chǎn)物后，用HindⅢ對(duì)回收產(chǎn)物和pcDNA3．1-U3TAR-MazF-HA(-)進(jìn)行單酶切。對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行膠回收、連接、轉(zhuǎn)化及菌液PCR鑒定出陽性克隆。將陽性克隆送公司測序。測序結(jié)果顯示GFP為正向插入，從而獲得pcDNA3.1-GFP-HA-MazF-U3TAR。

2.4pcDNA3.1-GFP-HA-MazF-U3TAR與pcDNA3.1-tat-flag的共轉(zhuǎn)染為了驗(yàn)證構(gòu)建的pcDNA3.1-GFP-HA-MazF-U3TAR是否只能在Tat蛋白誘導(dǎo)下才能表達(dá)，我們用pcDNA3.1-GFP-HA-MazF-U3TAR單獨(dú)轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞。因?yàn)镚FP是正向插入到載體中，轉(zhuǎn)染細(xì)胞顯示出綠色熒光(圖1A和B)。因?yàn)闊oTat蛋白存在，MazF的表達(dá)不能被誘導(dǎo)，Western blot分析沒有檢測到MazF的特異性條帶(圖2)。當(dāng)用pcDNA3.1-GFP-HA-MazF-U3TAR與pcDNA3.1-tat-flag共轉(zhuǎn)HEK293T細(xì)胞后，熒光顯微鏡依然可以檢測到綠色熒光(圖1C和D)，Western blot分析顯示，與pcDNA3.1-MazF-HA單轉(zhuǎn)一樣，共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞有MazF的特異性表達(dá)(圖2)。這表明構(gòu)建的pcDNA3.1-GFP-HA-MazF-U3TAR的MazF表達(dá)是Tat蛋白依賴的。此外，相對(duì)于pcDNA3.1-GFP-HA-MazF-U3TAR單轉(zhuǎn)的細(xì)胞，雙轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞的狀態(tài)差，呈現(xiàn)綠色熒光的細(xì)胞也明顯更少(圖1)，這可能是因?yàn)楦弑磉_(dá)的MazF通過特異性切割A(yù)CA位點(diǎn)而破壞大量mRNA，殺死細(xì)胞，同時(shí)因?yàn)镚FP基因并未經(jīng)過ACA的改造，其mRNA被MazF降解，從而下調(diào)了GFP的表達(dá)。

A和C：普通光學(xué)顯微鏡 (40×)；B和D：熒光顯微鏡(40×)。A: pcDNA3.1-GFP-HA-MazF-U3TAR 單轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)的光學(xué)顯微鏡照片，B: pcDNA3.1-GFP-HA-MazF-U3TAR 單轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)的熒光顯微鏡照片C：pcDNA3.1-GFP-HA-MazF-U3TAR與pcDNA3.1-tat-flag共轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)的光學(xué)顯微鏡照片，D: pcDNA3.1-GFP-HA-MazF-U3TAR與pcDNA3.1-tat-flag共轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)的熒光顯微鏡照片圖1 pcDNA3.1-GFP-HA-MazF-U3TAR與pcDNA3.1-tat-flag共轉(zhuǎn)染的普通光學(xué)和熒光顯微鏡分析A and C: general optic microscope (40× magnifications);B and D: fluorescence microscope (40× magnifications). A: HEK293T transfected with pcDNA3.1-GFP-HA-MazF-U3TAR (optics microscope); B: HEK293T transfected with pcDNA3.1-GFP-HA-MazF-U3TAR (fluorescence microscope); C:HEK293T co-transfected with pcDNA3.1-GFP-HA-MazF-U3TAR and pcDNA3.1-tat-flag (Optics microscope); D: HEK293T co-transfected with pcDNA3.1-GFP-HA-MazF-U3TAR and pcDNA3.1-tat-flag (fluorescence microscope)Fig.1 Optics and fluorescent microscope analysis of GFP expression in HEK293T transfected with pcDNA3.1-GFP-HA-MazF-U3TAR and co-transfected with pcDNA3.1-GFP-HA-MazF-U3TAR and pcDNA3.1-tat-flag

M： 蛋白相對(duì)分子質(zhì)量Marker,泳道1, 2, 3分別為pcDNA3.1-GFP-HA-MazF-U3TAR單轉(zhuǎn)染， pcDNA3.1-mazF-HA單轉(zhuǎn)染和pcDNA3.1-GFP-HA-MazF-U3TAR與pcDNA3.1-tat-flag共轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn), 1∶500稀釋的鼠抗HA單抗用于MazF表達(dá)的檢測。圖2 Western blot檢測pcDNA3.1-GFP-HA-MazF-U3TAR與pcDNA3.1-tat-flag共轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中MazF的表達(dá)M：Protein Marker(DL2000)，Lanes 1, 2 and 3: HEK293T transfected with pcDNA3.1-GFP-HA-MazF-U3TAR, pcDNA3.1-mazF-HA and co-transfected with pcDNA3.1-GFP-HA-MazF-U3TAR and pcDNA3.1-tat-flag, respectively. Mouse anti-HA mAb (1∶500) was used to detect the HA-labeled MazF.Fig.2 Western blot detection of MazF expression in HEK293T transfected with pcDNA3.1-GFP-HA-MazF-U3TAR and co-transfected with pcDNA3.1-GFP-HA-MazF-U3TAR and pcDNA3.1-tat-flag

3 討論

HIV-1是高度變異的病毒，其高變異性使病毒更易產(chǎn)生耐藥突變，也增加了AIDS疫苗研發(fā)的難度[8]。隨著miRNA的發(fā)現(xiàn)以及基因組編輯技術(shù)的出現(xiàn)，艾滋病的基因治療成為新的發(fā)展方向[9]。AIDS基因治療的靶標(biāo)可以針對(duì)HIV-1病毒本身(如針對(duì)HIV-1 RNA基因組的miRNA)[10]、抑制病毒復(fù)制，或者針對(duì)與病毒感染相關(guān)的宿主基因(如HIV-1感染所需的輔助受體CCR5或者CXCR4)進(jìn)行基因組編輯，從而敲除這些基因[11-14]。另外一種艾滋病基因治療的思路是，通過載體將毒素蛋白基因(自殺基因)導(dǎo)入到細(xì)胞，利用毒素蛋白，殺死HIV-1感染的細(xì)胞。

MazF是大腸埃希菌中發(fā)現(xiàn)的一種毒素蛋白，其可以特異性地識(shí)別和切割mRNA上的ACA位點(diǎn)，降解mRNA，阻止相關(guān)蛋白的合成，導(dǎo)致細(xì)胞死亡[2]。本研究對(duì)各個(gè)HIV-1亞型基因組序列分析發(fā)現(xiàn)，不論何種HIV-1亞型，其基因組中都包含有約240個(gè)左右的ACA位點(diǎn)(未發(fā)表的數(shù)據(jù))。HIV-1的基因組是正鏈RNA，可以直接作為mRNA，啟動(dòng)病毒早期基因的表達(dá)翻譯。 因此，MazF是一種可以用于艾滋病基因治療的候選自殺基因。因?yàn)镸azF對(duì)ACA的識(shí)別和切割是無選擇性的，一旦MazF基因?qū)氲郊?xì)胞中，將殺死細(xì)胞。因此，如何設(shè)計(jì)和構(gòu)建一種MazF表達(dá)載體，使其可以特異性地殺死HIV-1感染細(xì)胞，將是建立基于MazF的艾滋病基因治療方案的關(guān)鍵。

Tat是HIV-1編碼的轉(zhuǎn)錄反式激活因子，在HIV-1的轉(zhuǎn)錄過程中起十分重要的調(diào)節(jié)作用[5]。在沒有Tat的情況下,HIV-1的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制維持在非常低的水平。當(dāng)Tat存在時(shí)，可以通過與TAR RNA相互作用激活轉(zhuǎn)錄,將HIV-1的轉(zhuǎn)錄效率提高幾百倍[6-7]。為了構(gòu)建可以特異性殺傷HIV-1感染細(xì)胞的MazF表達(dá)載體，本研究將HIV-1的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子U3TAR與MazF基因連接到一起，并且反向插入到pcDNA3.1表達(dá)載體中，構(gòu)建了pcDNA3.1-GFP-HA-MazF-U3TAR。HIV-1啟動(dòng)子U3TAR是Tat蛋白依賴的啟動(dòng)子，其與MazF基因一起被反向插入到pcDNA3.1表達(dá)載體中，在正常細(xì)胞中，因?yàn)槿狈at蛋白，不能啟動(dòng)MazF的表達(dá)，不會(huì)殺傷正常細(xì)胞。當(dāng)pcDNA3.1-GFP-HA-MazF-U3TAR被導(dǎo)入到HIV-1感染細(xì)胞，感染細(xì)胞中表達(dá)的Tat蛋白將與U3TAR結(jié)合，激活MazF的表達(dá)，表達(dá)的MazF殺死感染細(xì)胞。為了防止表達(dá)的MazF對(duì)自身mRNA的切割，本研究通過氨基酸同義替代的規(guī)則，將MazF基因中的ACA位點(diǎn)進(jìn)行了同義替換，即保證了MazF蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的一致，又避免了MazF下調(diào)自身的表達(dá)。

本研究證明，通過pcDNA3.1-GFP-HA-MazF-U3TAR與pcDNA3.1-tat-flag的共轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，構(gòu)建的MazF表達(dá)載體pcDNA3.1-GFP-HA-MazF-U3TAR是Tat依賴性的，只有在Tat存在時(shí)，才可以表達(dá)MazF。此外，共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞比pcDNA3.1-GFP-HA-MazF-U3TAR單轉(zhuǎn)染的細(xì)胞具有更少的綠色熒光信號(hào)，表明表達(dá)的MazF可以明顯下調(diào)報(bào)道基因GFP的表達(dá)。pcDNA3.1-GFP-HA-MazF-U3TAR的構(gòu)建，為探索基于MazF的艾滋病基因治療方案提供了載體工具。

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ConstructionofanHIV-1Tat-dependentMazFexpressionvector

WanZhenzhou,YaoJin,HuYihong,ZhangChiyu

MedicalLaboratoryofTaizhouFourthPeople’sHospital,Taizhou225300,China(WanZZ);PathogenDiagnosticCenter,InstitutePasteurofShanghai,ChineseAcademyofScience,Shanghai200031,China(YaoJ,HuYH,ZhangCY)

ZhangChiyu,Email:zhangcy1999@ips.ac.cn

ObjectiveTo construct a Tat-dependent MazF expression vector pcDNA3.1-GFP-HA-MazF-U3TAR.MethodsHIV-1 U3TAR and MazF gene were amplified from pCR2.1-U3TAR and pET28a-MazF, respectively. Two gene fragments were linked together to form U3TAR-MazF by an overlapping PCR, and then cloned into pMD18T. An N-terminal HA tag was added to MazF to form U3TAR-MazF-HA. After double enzyme digestion usingEcoR I andHindⅢ, U3TAR-MazF-HA was reversely inserted into pcDNA 3.1 to form pcDNA3.1-HA-MazF-U3TAR. Then, a fluorescent reporter gene GFP was inserted into the downstream of U3TAR to form pcDNA3.1-GFP-HA-MazF-U3TAR.ResultsThe co-transfection experiments with pcDNA3.1-tat-flag showed that pcDNA3.1-GFP-HA-MazF-U3TAR is Tat dependent. MazF was expressed only under the presence of Tat. In addition, compared with the cells transfected with pcDNA3.1-GFP-HA-MazF-U3TAR, less green fluorescent signal was observed in the cells co-transfected with pcDNA3.1-GFP-HA-MazF-U3TAR and pcDNA3.1-tat-flag, indicating that expressed MazF down-regulated the expression of GFP.ConclusionsThe expression vector pcDNA3.1-GFP-HA-MazF-U3TAR will provide an important tool for the development of MazF-based AIDS gene therapy strategies.

AIDS; Tat; Toxin protein MazF; Gene therapy

艾滋??；Tat；毒素蛋白MazF；基因治療

2016-03-07)

(本文編輯：唐瀏英)

張馳宇，Email:zhangcy1999@ips.ac.cn

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2017.04.019