禽流感病毒H7N9神經(jīng)氨酸酶的優(yōu)勢線性B細胞抗原位點的預測及確定

高孟 謝琿 姜立民 高麗美 倪紅霞 羅永能

310013 杭州，浙江省醫(yī)學科學院病毒病研究所(高孟、謝琿、姜立民、高麗美、羅永能)；315010 寧波市疾病預防控制中心病毒研究所(倪紅霞)

·論著·

禽流感病毒H7N9神經(jīng)氨酸酶的優(yōu)勢線性B細胞抗原位點的預測及確定

高孟 謝琿 姜立民 高麗美 倪紅霞 羅永能

310013 杭州，浙江省醫(yī)學科學院病毒病研究所(高孟、謝琿、姜立民、高麗美、羅永能)；315010 寧波市疾病預防控制中心病毒研究所(倪紅霞)

目的確定禽流感病毒H7N9神經(jīng)氨酸酶的優(yōu)勢線性B細胞抗原位點。方法利用生物信息學軟件DNAStar中的Protean程序分析禽流感病毒H7N9神經(jīng)氨酸酶氨基酸序列的親水性、抗原性和表面可及性，計算不同區(qū)段上述指數(shù)的加權(quán)平均值，預測出潛在的優(yōu)勢線性B細胞抗原位點并進行人工合成。利用多肽-酶聯(lián)免疫吸附試驗(多肽-ELISA)檢測各預測片段與明確感染H7N9患者血清的反應性，同時以未感染H7N9的正常人血清作為陰性對照。結(jié)果根據(jù)抗原性、親水性和表面可及性指數(shù)均較高的特點，共預測出7個潛在的神經(jīng)氨酸酶線性B細胞抗原位點，分別為A、B、 C、D、 E、F和 G多肽-ELISA實驗結(jié)果證實各預測表位均與H7N9患者血清發(fā)生陽性反應。結(jié)論成功預測及確定了禽流感病毒H7N9神經(jīng)氨酸酶優(yōu)勢線性B細胞抗原位點，為抗原分子特異性研究和抗體制備奠定了基礎(chǔ)。

流行性感冒病毒(簡稱流感病毒)為RNA病毒的正粘病毒科流感病毒屬成員，根據(jù)病毒核蛋白和基質(zhì)蛋白抗原性的差異可將其分為甲(A)、乙(B)、丙(C)三型，其中A型流感病毒的感染范圍最廣、危害最大。禽流感病毒(Avian influenza virus, AIV)屬于A型流感病毒，可感染多種動物和人。根據(jù)流感病毒血凝素(Hemagglutinin, HA)和神經(jīng)氨酸酶(Neuraminidase, NA)的抗原性不同可將流感病毒分成不同亞型，其中HA有16種抗原型，NA有9種抗原型，不同的HA和NA組成不同的病毒亞型[1-3]。神經(jīng)氨酸酶NA是一種糖蛋白，構(gòu)成病毒囊膜纖突的重要成分，能夠水解糖末端的唾液酸殘基，使病毒顆粒從宿主細胞受體上釋放，有利于新生子代病毒離開細胞進行傳播[4-5]。新型H7N9是近年暴發(fā)的感染人的禽流感病毒亞型，神經(jīng)氨酸酶N9是該病毒第二個重要的表面抗原，探索其抗原分子特異性和免疫原性，對該流行病的預防和診斷具有重要意義。

抗原表位或抗原決定簇是決定抗原或免疫原分子特異性的特殊化學基團，根據(jù)免疫應答所識別淋巴細胞的不同可相應分為T細胞抗原表位和B細胞抗原表位，分別與T細胞和B細胞表面的抗原受體結(jié)合。其中B細胞抗原表位包括構(gòu)象性表位(序列上不相連、但在空間結(jié)構(gòu)上相互臨近)和線性表位(序列上相連)，由于構(gòu)象性表位相對復雜，目前表位預測主要針對線性表位，一般根據(jù)抗原性、親水性和表面可及性指數(shù)高的特點來進行預測。

本研究利用生物信息學軟件預測了H7N9神經(jīng)氨酸酶N9的線性B細胞抗原表位，人工合成多肽后利用多肽-ELISA檢測各預測片段與明確感染H7N9患者血清的反應性，確定陽性反應強烈的多肽片段為N9的優(yōu)勢線性B細胞抗原表位，可進一步用于抗原特異性研究和抗體制備。

1 材料與方法

1.1主要試劑與材料人工合成多肽由南京金斯瑞生物科技有限公司提供；明確感染H7N9患者血清(3份)和未感染正常人血清6份均由紹興市人民醫(yī)院臨床檢驗中心和寧波市疾病預防控制中心病毒室提供，確診依據(jù)為H7N9病毒核酸檢測陽性和臨床癥狀等；HRP標記的羊抗人IgG抗體和TMB顯色液均購自北京康為世紀；96孔酶標板購自Costar公司。

1.2H7N9神經(jīng)氨酸酶線性B細胞抗原位點預測從GenBank上下載H7N9禽流感病毒浙江株神經(jīng)氨酸酶N9氨基酸序列(GenBank: KC885956)，用生物信息學軟件DNAStar中的Protean程序分析該序列的抗原性、親水性和表面可及性，計算各指數(shù)的加權(quán)平均值，以3者數(shù)值均較高為原則預測出潛在的線性B細胞抗原表位，選取相應的多肽片段進行人工合成。

1.3多肽-酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測取人工合成多肽作為抗原，以明確感染H7N9的患者血清作為一抗、羊抗人IgG抗體作為二抗檢測人工合成的多肽與患者血清中抗體的反應性，同時以正常人血清作為陰性對照。用包被液稀釋多肽至10 μg/ml，100 μl/孔包被于96孔酶標板，4 ℃反應過夜后洗板3次；每孔加入200 μl含1%牛血清白蛋白(BSA)的磷酸鹽緩沖溶液(PBST)進行封閉，37 ℃孵育1 h后洗板3次；用封閉液將血清樣品稀釋100倍后加入各反應孔，100 μl/孔，同時利用封閉液和陰性血清設(shè)立空白對照和陰性對照，37 ℃孵育1 h后洗滌5次；將HRP標記的羊抗人IgG 進行1∶5 000稀釋后加入反應孔，100 μl/孔，37 ℃孵育30 min后洗滌5次；每孔加入100 μl TMB顯色液，37 ℃避光反應15 min后加入50 μl 2 mol/L硫酸終止反應，用酶標儀測定450 nm的吸光度值。按通用的判斷標準，以陰性對照孔的平均吸光度值的2.1倍為閾值判定陰陽性。

2 結(jié)果

2.1H7N9神經(jīng)氨酸酶線性B細胞抗原位點預測結(jié)果通過DNAStar中的Protean程序分析，禽流感病毒H7N9神經(jīng)氨酸酶氨基酸序列的抗原性、親水性和表面可及性結(jié)果見圖1。

A、B、C、D、E、F和G: 潛在的H7N9神經(jīng)氨酸酶(即N9)蛋白的線性B細胞抗原位點圖1 H7N9神經(jīng)氨酸酶(即N9)氨基酸序列的抗原性、親水性和表面可及性性分析結(jié)果A, B, C, D, E, F and G: Potential immunodominant linear B cell epitopes in neuraminidase of H7N9Fig.1 Antigenicity, hydrophilicity and surface probability analysis of amino acid sequences in neuraminidase of avian influenza virus H7N9

計算上述各片段的抗原性、親水性和表面可及性的加權(quán)平均值，依據(jù)從強原則，選取3者指數(shù)均較高的多肽區(qū)段判定為潛在的線性B細胞抗原表位，各預測位點的參數(shù)值見表1。

表1 H7N9神經(jīng)氨酸酶蛋白線性B細胞抗原位點的預測結(jié)果

2.2多肽-ELISA檢測各線性B細胞抗原位點的免疫顯性人工合成上述預測的7個多肽片段，用多肽-ELISA檢測各片段與明確感染H7N9患者血清的反應情況，同時以正常人血清作為陰性血清，結(jié)果如圖2所示。7個多肽片段均與患者陽性血清發(fā)生陽性反應，OD值均大于陰性對照的2.1倍，但各多肽與患者血清的反應程度存在差異。

圖2 H7N9神經(jīng)氨酸酶潛在的線性B細胞抗原表位與患者血清的peptide-ELISA結(jié)果Fig.2 Peptide-ELISA results of potential linear B cell epitopes in neuraminidase of H7N9 with human sera

通過與已測定的H7N9神經(jīng)氨酸酶的晶體三維結(jié)構(gòu)(PDB：4MWJ)[6]對比分析發(fā)現(xiàn)，上述抗原表位C的部分片段和表位D、E、F、G均位于N9的蛋白表面，與抗原表位位于蛋白表面的特點相符(圖3)。

注：partial C、D、E、F、G為預測的優(yōu)勢線性B細胞抗原決定簇位點圖3 預測的優(yōu)勢線性B細胞抗原表位在H7N9神經(jīng)氨酸酶蛋白中的分布情況(PDB：4MWJ)Fig.3 Distribution of predicted immunodominant linear B cell epitopes in neuraminidase of H7N9 (PDB: 4MWJ)partial C、D、E、F和G：潛在的優(yōu)勢線性B細胞抗原表位partial C, D, E, F and G: Potential immunodominant linear B cell epitopes in neuraminidase of H7N9

3 討論

H7N9禽流感病毒自2013年3月在我國暴發(fā)以來引起了全球的廣泛關(guān)注，這種在禽類身上呈現(xiàn)低致病性的亞型，可導致人類嚴重感染，甚至死亡[7-10]。H7N9禽流感病毒感染人類一般表現(xiàn)為流感樣癥狀，如發(fā)熱、咳嗽、頭痛和肌肉酸痛。重癥者病情發(fā)展迅速，多在3～5 d內(nèi)出現(xiàn)重癥肺炎，甚至伴有多器官功能衰竭等。禽流感病毒內(nèi)部基因的高突變率以及耐藥毒株的出現(xiàn)表明該病毒可能進一步擴散引起大流行，因此必須建立針對性的有的防控機制和診療手段[11-12]。神經(jīng)氨酸酶N9是H7N9第二個重要的表面抗原，對其線性抗原表位的預測有助于進一步分析H7N9的抗原分子特異性，為研制診斷試劑和疫苗奠定了基礎(chǔ)。

此前，劉雪婷等[13]預測了H7N9禽流感病毒HA、NA蛋白的抗原表位并分析其與HLA-II類等位基因的相關(guān)性，其中位于NA蛋白的B細胞表位12個，但未用實驗證明預測片段是否與自然感染的陽性血清發(fā)生陽性反應；李虎等[14]利用Protean、PORTER、MEGA等多種生物信息學軟件同時結(jié)合吳玉章的平均抗原指數(shù)方案綜合預測了H7N9禽流感病毒HA、NA蛋白潛在的B細胞表位，為表位疫苗的制備提供了實驗基礎(chǔ)，但其預測的多肽片段長度較短，并且未用實驗驗證各片段是否與陽性血清反應，其多肽位點的抗原性有待進一步確認。于悅洋等[15]利用傳統(tǒng)的雜交瘤技術(shù)制備獲得了3株抗H7N9禽流感病毒NA的小鼠單克隆抗體1G8、3C4和4E8，它們都能結(jié)合N9蛋白但識別的抗原表位不同，其中3C4和4E8能抑制神經(jīng)氨酸酶活性。

我們已經(jīng)利用生物學軟件成功預測并確定了腸道病毒71型與柯薩奇病毒A16型衣殼蛋白VP1～VP3、H7N9禽流感病毒血凝素和新型布尼亞病毒核衣殼蛋白的優(yōu)勢線性B細胞抗原決定簇[16-21]。本研究采用相同方法共獲得7個H7N9禽流感病毒神經(jīng)氨酸酶的優(yōu)勢線性B細胞抗原表位，多肽-ELISA方法證實各預測表位均能與H7N9患者血清發(fā)生陽性反應，但反應強度有差異，這可能與不同多肽表位的氨基酸序列、二級結(jié)構(gòu)及其在NA蛋白或病毒顆粒三維結(jié)構(gòu)中的空間構(gòu)象等諸多因素所導致的抗原性/免疫原性差異有關(guān)。另外，由于Wu等[6]測定了蛋白晶體三維結(jié)構(gòu)并保存于蛋白結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(PDB)中的H7N9神經(jīng)氨酸酶并非全長，其未包含N端的部分氨基酸序列，故而據(jù)此只能確定抗原表位C的部分片段和表位D、E、F、G均位于N9的蛋白表面。目前，對于禽流感病毒H7N9神經(jīng)氨酸酶的研究多集中在抗原表位預測和分子特異性方面，下一步我們將選取特異性最佳的優(yōu)勢抗原多肽進行抗體制備，進一步建立神經(jīng)氨酸酶N9的免疫學檢測方法。

[1] Webster RG, Bean WJ, Gorman OT, et al. Evolution and ecology of influenza A viruses[J]. Microbiol Rev, 1992, 56(1): 152-179.

[2] 殷震, 劉景華. 動物病毒學 [M]. 北京: 科學出版社, 1997.

[3] Fouchier RA, Munster V, Wallensten A, et al. Characterization of a novel influenza A virus hemagglutinin subtype (H16) obtained from black-headed gulls[J]. J Virol, 2005, 79(5):2814-2822. doi: 10.1128/JVI.79.5.2814-2822.2005.

[4] Colman PM. Influenza virus neuraminidase: structure, antibodies, and inhibitors[J]. Protein Sci, 1994, 3(10): 1687-1696. doi: 10.1002/pro.5560031007.

[5] Su B, Wurtzer S, Rameix-Welti MA, et al. Enhancement of the influenza A hemagglutinin (HA)-mediated cell-cell fusion and virus entry by the viral neuraminidase (NA)[J]. PloS One, 2009, 4(12): e8495. doi: 10.1371/journal.pone.0008495.

[6] Wu Y, Bi Y, Vavricka CJ, et al. Characterization of two distinct neuraminidases from avian-origin human-infecting H7N9 influenza viruses[J]. Cell Res, 2013, 23(12):1347-1355. doi: 10.1038/cr.2013.144.

[7] 姜慧芬, 羅永能, 姜立民. 人感染H7N9禽流感的流行特征[J]. 中華醫(yī)院感染學雜志, 2015, 25(3):629-631.

[8] Gao R, Cao B, Hu Y, et al. Human infection with a novel avian-origin influenza A (H7N9) virus[J]. N Engl J Med, 2013, 368(20):1888-1897. doi: 10.1056/NEJMoa1304459.

[9] Chen Y, Liang W, Yang S, et al. Human infections with emerging avian influenza A H7N9 virus from wet market poultry: clinical analysis and charactersation of viral genome[J]. Lancet, 2013, 381(9881):1916-1925. doi: 10.1016/S0140-6736(13)60903-4.

[10] 劉曦, 袁靜, 楊爭, 等. 深圳24例H7N9患者合并細菌感染危險因素分析[J]. 中華實驗和臨床病毒學雜志, 2016, 30(2):179-181.doi: 10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2016.02.017.

[11] 魏燕楠, 張超, 陳勍, 等. H7N9禽流感病毒野生或突變神經(jīng)氨酸酶對奧司他韋及扎那米韋敏感性的研究[J]. 病毒學報, 2014, 30(4):396-401. doi: 10.13242/j.cnki.bingduxuebao.002522.

[12] 董婕, 高榮保, 董麗波, 等. Peramivir體外抗禽流感H7N9病毒有效性研究[J]. 中華實驗和臨床病毒學雜志, 2015, 29(1):26-28. doi: 10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2015.01.009.

[13] 劉雪婷, 王珊, 張俊艷, 等. H7N9流感病毒HA、NA蛋白的抗原表位預測及其與HLA-Ⅱ類等位基因的相關(guān)性分析[J]. 中國免疫學雜志, 2015, 31(1):16-21. doi: 10.3969/j.issn.1000-484X.2015.01.003.

[14] 李虎, 胡鵬. 人感染H7N9禽流感病毒血凝素和神經(jīng)氨酸酶的B細胞表位預測[J]. 細胞與分子免疫學雜志, 2013, 29(12):1319-1321+1326. doi: 10.13423/j.cnki.cjcmi.006878.

[15] 于悅洋, 謝怡然, 陳迎珠, 等. 抗H7N9亞型流感病毒神經(jīng)氨酸酶單克隆抗體的制備及初步鑒定[J]. 中華實驗和臨床病毒學雜志, 2017,31(01):66-70. doi: 10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2017.01.014.

[16] 高麗美, 高孟, 王靜華, 等. 腸道病毒71型H3-TY株衣殼蛋白VP1～VP3的優(yōu)勢線性B細胞抗原決定簇預測與確定[J]. 中國衛(wèi)生檢驗雜志, 2014, 24 (22):3193-3195.

[17] 張鋒, 朱蓮, 陳軍, 等. 柯薩奇病毒A16型YY157株在Vero細胞中培養(yǎng)與增殖特性的研究[J]. 中華實驗和臨床病毒學雜志, 2014, 28(6):446-448. doi: 10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2014.06.015.

[18] 高孟, 倪紅霞, 朱蓮, 等. 柯薩奇病毒A16型衣殼蛋白VP1～VP3的B淋巴細胞線性抗原表位預測與確定[J]. 中華臨床感染病雜志, 2015, 80(6):543-548. doi: 10.3760/cma.j.issn.1674-2397.2015.06.007.

[19] 陶薇, 高孟, 姜立民, 等. 人感染H7N9禽流感病毒血凝素蛋白線性B淋巴細胞抗原表位的預測及鑒定等[J]. 中華臨床感染病雜志, 2016, 9(4):336-341, 348. doi: 10.3760/cma.j.issn.1674-2397.2016.04.010.

[20] 陳軍, 孫培蓓, 張鋒, 等. 發(fā)熱伴血小板減少綜合征布尼亞病毒核衣殼蛋白線性B細胞抗原決定簇的預測與確定[J]. 病毒學報, 2016, 32(5):597-602.doi: 10.13242/j.cnki.bingduxuebao.003007.

[21] 蔡靜, 羅永能. 腸道病毒71型衣殼蛋白的抗原表位及其單克隆抗體[J]. 國際流行病學傳染病學雜志, 2017, 44(2):126-130. doi: 10.3760/cma.j.issn.1673-4149.2017.02.012.

PredictionandidentificationofimmunodominantlinearBcellepitopesinN9ofavianinfluenzavirusH7N9

GaoMeng,XieHui,JiangLimin,GaoLimei,NiHongxia,LuoYongneng
InstituteofViralDiseases,ZhejiangAcademyofMedicalSciences,Hangzhou310013,China(GaoM,XieH,JiangLM，GaoLM,LuoYN);NingboCenterforDiseaseControlandPrevention，Ningbo310010，China(NiHX)Correspondingauthor:LuoYongneng,Email:ynl101@163.com

ObjectiveTo identify immunodominant linear B cell epitopes in neuraminidase of avian influenza virus H7N9.MethodsBy using protean algorithms of bioinformatic software DNAStar, antigenicity, hydrophilicity and surface probability of the H7N9 neuraminidase sequence was analyzed and their corresponding average indexes were calculated. Multiple regions containing potential linear B cell epitopes were predicted. Corresponding peptides were synthesized artificially and used in peptide-ELISA individually to check their reactivity to confirmed H7N9 positive human sera, and H7N9 negative human sera was used as control.ResultsSeven potential linear B cell epitopes, namely A to G, were predicted according to their relatively strong antigenicity, hydrophilicity and surface probability. All corresponding synthetic peptides reacted strongly with H7N9 positive sera.ConclusionsImmunodominant linear B cell epitopes in neuraminidase of H7N9 were successfully predicted and confirmed. It will facilitate to clarify molecular basis of the antigen specificity and to make respective antibodies.

Influenza A virus; Linear B cell epitope; Peptide enzyme-linked immunosorbent assay

流感病毒A型；線性B細胞抗原位點；多肽-酶聯(lián)免疫吸附測定

2016-02-01)

(本文編輯：陳培莉)

羅永能，Email：ynl101@163.com

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2017.04.002

浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技計劃(2014KYA039)；浙江省重點實驗室科技計劃(2008F3022)

Fundprograms: Medical and Health Research Programs of Zhejiang Province (2014KYA039);Scientific Projects for Zhejiang Provincial Key Laboratories (2008F3022)