六株不同地區(qū)分離的H7N9流感病毒假病毒制備與生物學(xué)特性研究

黃保英 李善琴 齊香榮 任皎 宋敬東 譚文杰 田厚文 阮力

102206 北京，中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所 衛(wèi)生部醫(yī)學(xué)病毒和病毒病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

·論著·

六株不同地區(qū)分離的H7N9流感病毒假病毒制備與生物學(xué)特性研究

黃保英 李善琴 齊香榮 任皎 宋敬東 譚文杰 田厚文 阮力

102206 北京，中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所 衛(wèi)生部醫(yī)學(xué)病毒和病毒病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

目的選擇不同地區(qū)分離的H7N9亞型流感病毒代表株，制備各代表株的假病毒，為H7N9疫苗對(duì)不同地區(qū)毒株的免疫保護(hù)效果評(píng)價(jià)奠定基礎(chǔ)。方法通過(guò)對(duì)29株H7N9流感病毒血凝素(Hemagglutinin，HA)的氨基酸序列分析，獲得6株不同地區(qū)H7N9亞型流感病毒代表株病毒；采用基于慢病毒載體的假病毒包裝系統(tǒng)，以HA與神經(jīng)氨酸酶(Neuraminidase，NA)作為包膜質(zhì)粒，包裝獲得6株帶有熒光素酶報(bào)告基因的假病毒；通過(guò)電鏡負(fù)染、Western blot檢測(cè)、感染MDCK后的熒光素酶讀值和血凝試驗(yàn)等了解6株假病毒的生物學(xué)特性，通過(guò)血清交叉中和試驗(yàn)了解其在中和抗體檢測(cè)中的應(yīng)用情況。結(jié)果篩選獲得6株不同地區(qū)分離的H7N9流感病毒代表株并制備了相應(yīng)的假病毒顆粒，電鏡下可觀察到典型的流感病毒形態(tài)，Western blot可檢測(cè)到HA、NA和P24的表達(dá)；滴度測(cè)定結(jié)果顯示6株假病毒對(duì)MDCK細(xì)胞的感染力為104～105TCID50/50 μl，血凝活性可達(dá)64～512；SH1上海株H7N9 HA疫苗免疫血清針對(duì)6株流感假病毒100TCID50劑量的中和效力不同，提示6株假病毒可用于疫苗的交叉免疫效果評(píng)價(jià)。結(jié)論成功獲得6株H7N9不同地區(qū)代表株流感假病毒，為疫苗的免疫效果評(píng)價(jià)奠定了基礎(chǔ)。

自2013年3月中國(guó)首次報(bào)道人感染H7N9禽流感以來(lái)[1]，我國(guó)已出現(xiàn)五波H7N9疫情，尤其是2016年9月至今的這一波流行具有開(kāi)始較早、感染人數(shù)大幅增加以及家禽感染程度高等特點(diǎn)，引起全球公共衛(wèi)生領(lǐng)域的高度關(guān)注[2-3]。H7N9流感病毒血凝素(Hemagglutinin，HA)和神經(jīng)氨酸酶(Neuraminidase，NA)可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性中和抗體[4]，但HA抗原決定簇的氨基酸變異會(huì)導(dǎo)致HA抗原特性的改變并影響疫苗的保護(hù)效果。為了更好的評(píng)價(jià)H7N9疫苗的免疫保護(hù)效果，需要使用具有不同HA抗原特性的不同地區(qū)H7N9流感病毒代表株進(jìn)行血清交叉中和抗體的評(píng)估。

A/Shanghai/1/2013(H7N9)是最早分離獲得的H7N9流感病毒之一，通過(guò)對(duì)HA抗原決定簇的氨基酸突變分析，有可能獲得具有不同HA抗原特性的病毒株信息。但是，H7N9流感病毒的分離和經(jīng)典的中和試驗(yàn)因涉及活病毒的操作而存在一定的生物安全隱患[5]。而假病毒顆粒由于缺乏病毒復(fù)制能力而具有良好的安全性，熒光素酶報(bào)告基因還能實(shí)現(xiàn)高通量快速檢測(cè)，在高致病性病原微生物的研究中具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)[6]。因此，通過(guò)對(duì)HA蛋白序列比對(duì)獲得抗原決定簇關(guān)鍵位點(diǎn)氨基酸變異的病毒株，并在此基礎(chǔ)上制備多株流感假病毒并建立操作安全的體外中和試驗(yàn)技術(shù)平臺(tái)，可用于研發(fā)中H7N9疫苗免疫效果評(píng)估，將對(duì)H7N9流感的防控具有重要意義。

基于上述分析，本研究以A/Shanghai/1/2013(H7N9)為參考株，對(duì)來(lái)自全球禽流感共享數(shù)據(jù)庫(kù)[7](Global Initiative on Sharing Avian Influenza Data，GISAID)的29株H7N9流感病毒HA蛋白序列及其抗原決定簇的關(guān)鍵位點(diǎn)氨基酸的分析，篩選獲得6株H7N9流感病毒株，在此基礎(chǔ)上制備了6株表達(dá)相應(yīng)毒株的HA和NA蛋白的流感假病毒，并對(duì)其生物學(xué)活性和在血清交叉中和抗體檢測(cè)中的應(yīng)用進(jìn)行了初步研究，為H7N9流感疫苗的免疫效果評(píng)價(jià)奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料293FT細(xì)胞與MDCK細(xì)胞為本科室保存，X-treme GENE HP用于質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，購(gòu)自美國(guó)Roche公司； TPCK-胰酶用于處理假病毒，購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；A/Shanghai/1/2013(H7N9)流感病毒的抗HA、抗NA和抗p24鼠單克隆抗體分別購(gòu)自北京義翹神州生物技術(shù)有限公司和溯本源和生物技術(shù)公司；Bright-Glo熒光素酶系統(tǒng)檢測(cè)試劑購(gòu)自美國(guó)Promega公司；DyLight 800山羊抗小鼠紅外二抗IgG購(gòu)自美國(guó)LiCOR公司。火雞血球購(gòu)自北京芳元緣養(yǎng)殖場(chǎng)。表達(dá)A/Shanghai/1/2013(H7N9)HA蛋白的DNA和痘苗病毒疫苗聯(lián)合免疫獲得的小鼠陰性和陽(yáng)性血清各5份由本室保存[8-9]，陰性血清的抗體幾何平均滴度(Geometic Mean Titer，GMT)小于1∶40；陽(yáng)性血清的GMT為1∶1.6×105～1∶6.4×105。

1.2序列與質(zhì)粒29株H7N9流感HA蛋白序列均來(lái)自GISAID數(shù)據(jù)庫(kù)，使用分子進(jìn)化分析軟件(Molecular Evolutionary Genetics Analysis，MEGA)MEGA 5.0版本，采用鄰接法構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，結(jié)合HA蛋白抗原位點(diǎn)的分析獲得6株代表株。表達(dá)6株H7N9流感病毒優(yōu)化型HA和NA的重組質(zhì)粒pVRC-HA和pVRC-NA以及攜帶熒光素酶報(bào)告基因的質(zhì)粒pNL4-3-Luc.R-E-均為本科室保存，分別用于假病毒制備的包膜質(zhì)粒和骨架質(zhì)粒[8-9]。

1.3假病毒的包裝按照優(yōu)化條件進(jìn)行假病毒顆粒的制備[8-9]。將293FT細(xì)胞于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)16～18 h至細(xì)胞融合度為80%左右。先按質(zhì)量比例3∶1將骨架質(zhì)粒和包膜質(zhì)?；旌现苽銬NA，再按質(zhì)量-體積比例1∶2將DNA與HP混合，室溫避光反應(yīng)15 min后即為轉(zhuǎn)染復(fù)合物，最后加入293FT細(xì)胞時(shí)需逐滴加入并輕輕混勻。轉(zhuǎn)染后10 h換含2% FBS的DMEM維持培養(yǎng)，收集48 h、72 h及96 h的培養(yǎng)上清液，分別于4 ℃條件下經(jīng)2 200×g離心5 min和20%蔗糖進(jìn)行16 000×g超速離心2 h，依次去除細(xì)胞碎片和墊層純化，最后按1∶25用PBS重懸，溶解過(guò)夜后分裝于-80 ℃凍存。6株假病毒分別命名為SH1op、AH1op、NJ1op、WX2op、GD2op及EN1op。

1.4假病毒的電鏡形態(tài)學(xué)觀察通過(guò)電子顯微鏡觀察負(fù)染的假病毒顆粒形態(tài)。

1.5假病毒的Westernblot分析使用SDS-PAGE上樣緩沖液處理假病毒，100 ℃煮沸10 min。根據(jù)P24定量結(jié)果取100 ng P24假病毒進(jìn)行SDS-PAGE電泳和電轉(zhuǎn)移，硝酸纖維素膜使用5%脫脂奶封閉1 h；分別加入抗p24鼠單抗和抗流感病毒H7N9的HA及NA鼠單抗，37 ℃反應(yīng)1 h；PBST洗滌3次，加入DyLight 800山羊抗小鼠紅外二抗，37 ℃反應(yīng)1 h；PBST洗滌3次，最后使用Odyssey紅外熒光掃描成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。

表1 6株H7N9流感病毒HA蛋白的氨基酸替換

1.6假病毒的滴度測(cè)定將MDCK細(xì)胞接種96孔板，37 ℃，5% CO2孵箱培養(yǎng)至細(xì)胞融合度達(dá)到80%左右。假病毒于37 ℃使用TPCK-胰酶2 μg/ml 處理1 h后進(jìn)行5倍連續(xù)稀釋，按照50 μl/孔感染MDCK細(xì)胞，4個(gè)復(fù)孔/稀釋度。感染后10 h換DMEM維持培養(yǎng)，48 h后使用Bright-Glo熒光素酶系統(tǒng)檢測(cè)試劑裂解細(xì)胞，使用GLOMAX 96 微孔板發(fā)光檢測(cè)儀檢測(cè)相對(duì)熒光單位(Relative luciferase unit, RLU)，假病毒半數(shù)組織感染劑量(50% Tissue Culture Infection Dose,TCID50)使用Reed-Muench公式計(jì)算。

1.7假病毒的血凝滴度測(cè)定將96孔V孔板加入生理鹽水50 μl/孔，樣品倍比稀釋方案如下：第1列加入50 μl假病毒，混勻后從第1列吸出50 μl樣品至第2列，以此類推至最后一列；最后加入等體積的1%火雞血球，室溫反應(yīng)30 min，觀察記錄血凝結(jié)果。

1.8假病毒的中和試驗(yàn)將MDCK細(xì)胞接種96孔板，于37 ℃，5% CO2孵箱培養(yǎng)至細(xì)胞融合度達(dá)到80%左右。假病毒顆粒經(jīng)TPCK-胰酶處理，小鼠血清56 ℃滅活30 min后倍比稀釋；分別將100TCID50劑量假病毒與各稀釋度血清等體積混合，37 ℃反應(yīng)1 h，將血清-病毒復(fù)合物100 μl/孔感染MDCK細(xì)胞，感染后10 h換DMEM維持培養(yǎng)，48 h后裂解細(xì)胞檢測(cè)RLU?？贵w中和百率(%)=(假病毒對(duì)照RLU-檢測(cè)血清RLU)/(假病毒對(duì)照RLU-細(xì)胞對(duì)照RLU)×100%。IC90判定為90%假病毒顆粒熒光讀值被抑制的最高血清稀釋度的倒數(shù)。

1.9繪圖及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析使用GraphPad Prism 6.0軟件繪圖，統(tǒng)計(jì)學(xué)比較采用方差分析，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的判定標(biāo)準(zhǔn)為P<0.05。

2 結(jié)果

2.16株H7N9流感病毒代表株的篩選為了獲得不同抗原特性的H7N9流感病毒代表株，本研究對(duì)GISAID數(shù)據(jù)庫(kù)中2013年度的29株H7N9流感病毒HA的氨基酸序列比對(duì)，獲得抗原決定簇氨基酸位點(diǎn)存在差異的6株代表株，分別為A/Shanghai/1/2013(H7N9)、A/Anhui/1/2013(H7N9)、A/Nanjing/1/2013(H7N9)、A/Wuxi/2/2013(H7N9)、A/Guangdong/1/2013(H7N9)和A/Environment/Wuxi/1/2013(H7N9)(表1)，分別簡(jiǎn)稱為SH1、AH1、NJ1、WX2、GD1及EN1。6株病毒對(duì)應(yīng)的HA基因GenBank序列號(hào)分別EPI439486、EPI439507、EPI453604、EPI467313、EPI446746和EPI467345，對(duì)應(yīng)的NA基因GenBank序列號(hào)分別：EPI138737、EPI138739、EPI142305、EPI145652、EPI145654和EPI148417，各株病毒HA和NA氨基酸的相似性分別大于98%和99%，AH1、WX2和GD1的NA氨基酸序列完全一致。

2.26株H7N9流感假病毒的電鏡形態(tài)和蛋白表達(dá)情況按照優(yōu)化條件制備6株H7N9流感假病毒，分別簡(jiǎn)稱為SH1op、AH1op、NJ1op、WX2op、GD1op及EN1op，電鏡下可觀察到具有致密電子核心和包膜的顆粒，顆粒形狀包括桿狀、圓形或不規(guī)則形等，直徑為80～120 nm(圖1A)；使用流感病毒H7N9抗HA、抗NA與抗p24單抗進(jìn)行Western blot鑒定，可同時(shí)檢測(cè)到相對(duì)分子質(zhì)量75×103、75×103和24×103三條帶，分別與HA蛋白、糖基化的NA蛋白、P24蛋白相對(duì)分子質(zhì)量一致(圖1B)。上述結(jié)果表明，6株H7N9流感假病毒均具有典型的流感病毒形態(tài)，假病毒顆粒中均有HA和NA蛋白的嵌入。

圖2 6株H7N9流感假病毒的感染滴度(A)和血凝滴度(B)Fig.2 Infectivity (A) and HAU titer (B) of six H7N9 pseudoviruses

圖1 6株H7N9流感假病毒的電鏡形態(tài)(A)和Western blot鑒定(B)Fig.1 Electron microscopic morphology (A) and Western blot analysis (B) of six H7N9 pseudoviruses

2.36株H7N9流感假病毒均具有較高的感染活性和血凝活性通過(guò)假病毒顆粒中的熒光素酶讀值計(jì)算其感染活性，TCID50檢測(cè)結(jié)果顯示6株假病毒在MDCK細(xì)胞中的感染滴度均在104TCID50/50 μl～105TCID50之間，SH1op、AH1op和GD1op的感染滴度相當(dāng)(4×104TCID50/50 μl)，WX2op和EN1op的感染滴度(105TCID50/50 μl)顯著高于NJ1op(104TCID50/50 μl)(圖2A)。血凝活性測(cè)定結(jié)果與TCID50結(jié)果趨勢(shì)一致，6株假病毒的血凝滴度在64～512之間，其中，WX2op和EN1op的血凝滴度明顯優(yōu)于NJ1op(圖2B)。上述結(jié)果表明，6株H7N9流感假病毒均具有較高的感染活性和血凝活性。

2.46株不同H7N9流感假病毒可用于血清交叉免疫效果評(píng)價(jià)為了解6株假病毒在血清交叉中和抗體檢測(cè)中的應(yīng)用情況，使用針對(duì)SH1 HA的小鼠血清分別與6株假病毒進(jìn)行了中和試驗(yàn)。結(jié)果顯示，SH1陽(yáng)性血清對(duì)6株假病毒的中和活性隨稀釋度的增加而降低，中和效價(jià)由高到低依次為SH1op、NJ1op、AH1op、GD1op、EN1op及WX2op(圖3A)。其中，針對(duì)株特異性的SH1op的中和效價(jià)最高，與WX2op、GD1op和EN1op的中和效價(jià)具有顯著差異；針對(duì)WX2op的中和效價(jià)最低，還與針對(duì)GD1和EN1的中和效價(jià)具有顯著差異(圖3B)。這些結(jié)果表明，6株H7N9流感假病毒的HA抗原性在統(tǒng)計(jì)學(xué)上存在差異，可以模擬流行株病毒用于血清交叉中和抗體的檢測(cè)。

3 討論

圖3 針對(duì)6株H7N9流感假病毒的血清中和曲線(A)和IC90 (B)Fig.3 Serum neutralization curve (A) and IC90 titer (B) against six H7N9 pseudoviruses

WHO于2013年9月首次推薦了A/Anhui/1/2013(H7N9)和A/Shanghai/2/2013(H7N9)為H7N9候選疫苗株[10]，本研究早期選擇的29株H7N9流感病毒均為2013年度的流行株，其在GISAID數(shù)據(jù)庫(kù)中具有完整的HA和NA序列，可進(jìn)一步獲得相應(yīng)的氨基酸序列進(jìn)行假病毒的制備。值得注意的是，隨著疫情的持續(xù)存在，流感病毒不斷發(fā)生抗原性改變[11-12]，WHO于2017年3月2日更新A/Hunan/2650/2016-like virus或A/Guangdong/17SF003/2016-like或A/Hong Kong/125/2017 (A/Hunan/2650/2016-like)作為新的疫苗株病毒[13]，為了更好的評(píng)估疫苗的保護(hù)效果，后期還應(yīng)根據(jù)病毒分子檢測(cè)結(jié)果及時(shí)補(bǔ)充更新H7N9流行株病毒的信息，構(gòu)建具有新的抗原特性的流感假病毒，不斷擴(kuò)充流感假病毒材料庫(kù)，更全面評(píng)估H7N9疫苗效果。

HA的抗原決定簇主要位于其球部區(qū)域的1～327位氨基酸，關(guān)鍵位點(diǎn)的突變有可能導(dǎo)致HA抗原特性改變[14]。本研究分析的29株H7N9流感病毒的HA氨基酸序列中，SH1與其它各株在進(jìn)化樹(shù)上距離最遠(yuǎn)，AH1、NJ1、WX2、GD1和EN1等病毒株呈現(xiàn)出一定的區(qū)域性特點(diǎn)?？乖瓫Q定簇氨基酸位點(diǎn)的變異分析顯示，除SH1病毒株以外，其它各種病毒均出現(xiàn)了Q226 L、G186V和S138A的突變，與病毒和人類受體的結(jié)合能力增強(qiáng)有關(guān)；與早期推薦的AH1疫苗株病毒相比，NJ1、WX2、GD1和EN1還分別在65位、140位、143、208、285位氨基酸出現(xiàn)不同變異，有可能會(huì)影響HA的抗原特性，基于上述分析，本研究選擇了SH1、AH1、NJ1、WX2、GD1及EN1病毒作為代表株。

獲得具有高靈敏度和高感染滴度的H7N9流感假病毒是中和試驗(yàn)技術(shù)平臺(tái)建立的重要環(huán)節(jié)。本研究按照前期優(yōu)化的假病毒包裝參數(shù)，選用帶有熒光素酶報(bào)告基因的假病毒包裝系統(tǒng)以實(shí)現(xiàn)檢測(cè)的高靈敏度，在此基礎(chǔ)上以密碼子優(yōu)化HA和NA作為包膜質(zhì)粒，制備了6株H7N9流感假病毒并研究了其生物學(xué)活性。在電鏡下可以觀察到典型的流感病毒形態(tài)，Western blot可檢測(cè)到HA、NA和P24的表達(dá)，病毒滴度測(cè)定結(jié)果也顯示6株流感假病毒均具有較高的感染活性和良好的血凝活性。上述結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了流感假病毒制備條件的可重復(fù)性，該參數(shù)可進(jìn)一步推廣應(yīng)用于H7N9其它流行株的假病毒的制備中。值得一提的是，TCID50和HAU結(jié)果提示，在同樣的制備條件下，WX2op和EN1op假病毒的包裝效率較NJ1op高，可能與HA和NA的重配特性有關(guān)[15]，但尚需進(jìn)一步深入驗(yàn)證。

中和試驗(yàn)是確定病毒感染及評(píng)價(jià)疫苗保護(hù)效果的重要指標(biāo)，中和抗體效價(jià)的高低可以反應(yīng)疫苗針對(duì)特定病毒株免疫保護(hù)效果的強(qiáng)弱[16]。WHO最近公布的HA抗原特性分析結(jié)果表明，H7N9已分化成珠江三角洲和長(zhǎng)江三角洲兩個(gè)譜系，并且最近分離出的長(zhǎng)三角分支病毒抗原性與目前疫苗株的雪貂感染血清交叉反應(yīng)性降低，提示H7N9流感病毒抗原性發(fā)生變異，可能會(huì)逃逸現(xiàn)有疫苗株的免疫保護(hù)。本研究中SH1 HA的疫苗免疫小鼠血清針對(duì)不同地區(qū)H7N9流行株的中和效價(jià)存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，再次驗(yàn)證了使用不同地區(qū)分離的H7N9亞型流感病毒代表株用于疫苗效果評(píng)價(jià)的重要性。

綜上所述，本研究成功篩選和制備了6株H7N9不同地區(qū)代表株流感假病毒，可同時(shí)表達(dá)相應(yīng)毒株的HA和NA蛋白，具有典型流感病毒形態(tài)、高感染力和良好的血凝活性，可用于H7N9交叉中和抗體檢測(cè)，為H7N9流感疫苗的免疫效果評(píng)價(jià)奠定了基礎(chǔ)。

[1] Gao R, Cao B, Hu Y, et al. Human infection with a novel avian-origin influenza A (H7N9) virus[J]. N Engl J Med, 2013, 368(20):1888-1897. doi: 10.1056/NEJMoa1304459.

[2] Iuliano AD, Jang Y, Jones J, et al. Increase in human infections with avian influenza A(H7N9) virus during the fifth epidemic-China, October 2016-February 2017[J]. MMWR Morb Mortal Wkly Rep, 2017, 66(9):254-255. doi: 10.15585/mmwr.mm6609e2.

[3] Shen Y, Lu H. Global concern regarding the fifth epidemic of human infection with avian influenzaA (H7N9) virusin China[J]. Biosci Trends,2017,11 (1):120-121.

[4] Gaymard A, Le Briand N, Frobert E, et al. Functional balance between neuraminidase and haemagglutinin in influenza viruses[J]. Clin Microbiol Infect, 2016,22(12):975-983.doi: 10.1016/j.cmi.2016.07.007.

[5] Nakamura K, Shirakura M, Suzuki Y, et al.Development of a high-yield reassortant influenza vaccine virus derived from the A/Anhui/1/2013 (H7N9) strain[J]. Vaccine, 2016,34(3):328-333. doi: 10.1016/j.vaccine.2015.11.050.

[6] Qiu C, Huang Y, Zhang A, et al.Safe pseudovirus-based assay for neutralization antibodies against influenza A(H7N9) virus[J]. Emerg Infect Dis,2013,19(10):1685-1687. doi: 10.3201/eid1910.130728.

[7] Elbe S, Buckland-Merrett G. Data, disease and diplomacy: GISAID’s innovative contribution to global health[J]. Global Challenges, 2017,1:33-46. doi:10.1002/gch2.1018

[8] 李善琴，黃保英，齊香榮，等.H7N9流感假病毒制備條件的優(yōu)化及其在中和抗體檢測(cè)中的初步應(yīng)用[J]. 生物技術(shù)通訊, 2016, 27 (3): 348-353.

[9] 李善琴. 基于假病毒的H7N9流感病毒中和抗體檢測(cè)方法的建立與初步應(yīng)用[D]. 北京:中國(guó)疾病預(yù)防控制中心, 2016.

[10] World Health Organization.WHO recommendation on influenza A(H7N9) vaccine virus[EB/OL].Geneva, Switzerland: World Health Organization. [2013-09-26]http://www.who.int/influenza/human_animal_interface/influenza_h7n9/201309_h7n9_recommendation.pdf.

[11] World Health Organization. Antigenic and genetic characteristics of zoonotic influenza viruses and development of candidate vaccine viruses for pandemic preparedness, March 2017[EB/OL]. Geneva, Switzerland: World Health Organization. [2017-03-02].http://www.who.int/influenza/vaccines/virus/201703_zoonotic_vaccinevirusupdate.pdf?ua=1.

[12] Yan JR, Liu MT. Human infection caused by an avian influenza A (H7N9) virus with a polybasic cleavage site in Taiwan, 2017[J]. J Formos Med Assoc, 2017, 116 (3): 210-212. doi: 10.1016/j.jfma.2017.02.011.

[13] World Health Organization. Influenza at the human-animal interface Summary and assessment, 14 February to 16 March 2017[EB/OL]. Geneva, Switzerland: World Health Organization. [2017-03-16].http://www.who.int/influenza/human_animal_interface/HAI_Risk_Assessment/en/

[14] Krystal M, Elliott RM, Benz EW J, et al. Evolution of influenza A and B viruses: conservation of structural features in the hemagglutinin genes[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1982;79(15): 4800-4. pmid:6956892.

[15] Gaymard A, Le Briand N, Frobert E, et al. Functional balance between neuraminidase and haemagglutinin ininfluenza viruses[J]. Clin Microbiol Infect, 2016,22 (12):975-983. doi: 10.1016/j.cmi.2016.07.007.

[16] NdifonW, Wingreen NS, Levin SA. Differential neutralization efficiency of hemagglutinin epitopes, antibody interference, and the design of influenza vaccines[J]. Proc Natl Acad Sci USA，2009, 106:8701-8706.doi: 10.1073/pnas.0903427106.

PreparationandcharacteristicanalysisofsixinfluenzaA(H7N9)pseudovirusderivedfromdifferentdistrictsofChina

HuangBaoying,LiShanqin,QiXiangrong,RenJiao,SongJingdong,TanWenjie,TianHouwen,RuanLi

KeyLaboratoryforMedicalVirology,MinistryofHealth.NationalInstituteforViralDiseaseControlandPrevention,ChineseCenterforDiseaseControlandPrevention,Beijing102206,China

s:TianHouwen，Email：houwent@126.com；RuanLi，Email：ruanlicdc@163.com

ObjectiveTo prepare strains of influenza A (H7N9) pseudovirus derived from different districts of China for vaccine efficacy evaluation.MethodsPhylogenetic tree was built based on hemagglutinin (HA) amino acid sequence analyses from 29 influenza A (H7N9) virus strains and 6 influenza A (H7N9) virus strains with HA determinants variation were selected. 293FT cells were co-transfected with plasmid pNL4-3-Luc.R-E-, pVRC-HA and pVRC-NA with codon-optimized hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) derived from the six influenza A (H7N9) virus strains, respectively. Transmission electron microscopy assay and Western blot analysis were performed to demonstrate morphology and specificity of these particles, luciferase activity assay and hemagglutinin titers detection were used to determine their infectivity and hemagglutinin activity. And finally, pseudovirus-based neutralization assays were evaluated with HA immunized mice serum.ResultsSix influenza A (H7N9) peseudovirus particles derived from different districts of China were selected and prepared. All of the particles bearing HA and NA were characterized with classic influenza virus morphology, with TCID50titer ranged from 104TCID50/50 μl to 105TCID50/50 μl and with hemagglutinin activity ranged from 64 to 512. Neutralization efficacies on influenza A/Shanghai/1/2013(H7N9) HA vaccine serum against 100TCID50dose of these pseudovirus particles indicated their potential application in the vaccine cross-protective evaluation in future.ConclusionsSix influenza A (H7N9) pseudovirus derived from different districts of China with potential antigenic variation on HA were constructed successfully, established foundation for their further application in vaccine cross-reactive efficacy evaluation.

Influenza A (H7N9) virus; Pseudovirus; Hemagglutinin; Antigenic variation; Neutralization

H7N9流感病毒； 假病毒；血凝素；抗原特性；中和試驗(yàn)

2017-04-12)

(本文編輯：呂新軍)

田厚文，Email：houwent@126.com； 阮力，Email：ruanlicdc@163.com

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2017.04.001

國(guó)家傳染病科技重大專項(xiàng)(2014ZX10004002)；國(guó)家863計(jì)劃(2006AA02A203)；國(guó)家自然科學(xué)基金(31200127)；國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃(2016YFD0500300、2016YFC1200200)

Fundprograms: Megaproject for Infectious Disease Research of China (2014ZX10004002)；National High Technology Research and Development Program of China (863 Program) (2006AA02A203)；National Natural Science Foundation (31200127)；National Key Plan for Scientific Research and Development of China (2016YFD0500300, 2016YFC1200200)