骨化三醇對體外培養(yǎng)內(nèi)皮祖細胞的藥理作用

余 華，朱再勝，杜曉紅，張懷勤

骨化三醇對體外培養(yǎng)內(nèi)皮祖細胞的藥理作用

余 華a，朱再勝a，杜曉紅a，張懷勤b

目的觀察骨化三醇[1,25-(OH)2D3]干預培養(yǎng)對人外周血來源的內(nèi)皮祖細胞(Endothelial progenitor cells,EPCs)數(shù)量及功能的影響。方法采用密度梯度離心法和差速貼壁法，獲得EPCs細胞,用流式細胞儀和激光共聚焦顯微鏡進行鑒定；然后分別加入不同濃度的骨化三醇10、50、100 μmol/L干預培養(yǎng)72 h，觀察EPCs的數(shù)量變化、黏附、增殖和產(chǎn)生一氧化氮(NO)的能力。結(jié)果與對照組相比,10、50、100 μmol/L組的貼壁細胞個數(shù)分別為13.91±1.58、14.28±1.66、16.91±1.85，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；重貼壁細胞個數(shù)分別為9.55±1.11、10.25±1.15、10.88±1.02，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；增殖能力(OD值)分別為0.285±0.005、0.301±0.009、0.321±0.006，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；培養(yǎng)液中NO含量分別為5.687 9±0.392 5、5.954 7±0.243 2、7.682 2±0.353 4 μmol/L，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結(jié)論骨化三醇干預培養(yǎng)能提高人外周血來源EPCs的黏附能力，但對其增殖能力和產(chǎn)NO能力無明顯影響。

骨化三醇；內(nèi)皮祖細胞；一氧化氮；心血管疾病

0 引言

維生素D是一種人體內(nèi)維持鈣磷代謝平衡的重要激素，在體內(nèi)經(jīng)二次羥化作用后，以1,25-(OH)2D3，即骨化三醇形式發(fā)揮生物學作用[1]。由于維生素D受體同樣存在內(nèi)皮細胞，近年來研究發(fā)現(xiàn)，人體內(nèi)活性維生素D不足會導致血管內(nèi)皮功能障礙，且與心血管疾病的發(fā)生發(fā)展及死亡率等相關(guān)[2-3]。我們在前期臨床觀察發(fā)現(xiàn)，穩(wěn)定型心絞痛患者體內(nèi)維生素D濃度與外周血EPCs水平存在一定正相關(guān)性[4]。因此，我們通過本實驗，進一步觀察骨化三醇對體外培養(yǎng)EPCs數(shù)量及功能的影響,希望為維生素D防治心血管疾病的發(fā)生發(fā)展提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 骨化三醇標準品(純度>99.5%)購自STEM CELL公司,人纖維連接蛋白購自Roche公司,FITC-UEA-I lectin(FITC標記的荊豆凝集Ⅰ)購自Sigma公司，DiI-ac-LDL(DiI標記的乙酰化低密度脂蛋白)購自Molecular probe公司,PE-CD34單克隆抗體購自Caltag Laboratories公司，PE-VEGFR-2單克隆抗體、FITC-CD133單克隆抗體均購自R&D Systems。NO檢測試劑盒購自江蘇碧云天公司，CCK-8檢測試劑盒購自上海同仁化學研究所,血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)購自Pepro Tech EC公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 人外周血來源EPCs的培養(yǎng) 經(jīng)我院倫理委員會批準并簽署知情同意書后，從30歲健康男性志愿者的肘靜脈處抽取外周血30 mL,用Hank′s液等比稀釋后，小心加入在Ficoll液上面，采用密度梯度離心法分離外周血單個核細胞,按適當密度接種于24孔培養(yǎng)板(預先包被人纖維連接蛋白)中,每孔中加入預先混合有鏈霉素、青霉素、VEGF、20%胎牛血清的M199培養(yǎng)液，放入37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d,再用Hank′s液反復沖洗2次，洗去未貼壁細胞，然后更換培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)3 d。

1.2.2 EPCs的鑒定[5]培養(yǎng)第6天，在顯微鏡下觀察到貼壁的梭形細胞，用0.25%胰酶消化搜集貼壁的細胞,制成1×109/L的單細胞懸液,加入熒光標記的抗CD34、VEGFR-2及CD133單克隆抗體,用流式細胞儀分析細胞CD34、VEGFR-2及CD133表達情況。同樣取培養(yǎng)第6天的細胞,進行雙染色試驗，依次加入DiI-ac-LDL、FITC-UEA-Ilectin，共同避光孵育2 h,多聚甲醛固定10 min,PBS沖洗2次后，用激光共聚焦顯微鏡觀察鑒定細胞熒光表達情況。

1.2.3 分組 培養(yǎng)第6天,用0.25%胰酶將各孔細胞重新消化,制成單細胞混懸液,按1×104/cm2的密度分別接種到24孔板中,然后設(shè)立空白對照組和10、50、100 μmol/L濃度的骨化三醇干預培養(yǎng)組,每組設(shè)置6個復孔,繼續(xù)培養(yǎng)72 h,再進行細胞計數(shù)、黏附、增殖及產(chǎn)NO能力測定。

1.2.4 EPCs的計數(shù) 在倒置相差顯微鏡下(上、下、左、右、中10個高倍鏡視野×200)計數(shù)各組各孔具有典型梭形的貼壁細胞數(shù)。

1.2.5 EPCs的黏附能力測定 以0.25%胰酶重新消化各組各孔的貼壁細胞,制成單細胞懸液。重新接種到24孔培養(yǎng)板,繼續(xù)培養(yǎng)30 min,洗去各孔未貼壁細胞,倒置相差顯微鏡下(上、下、左、右、中10個高倍鏡視野×200)，再計數(shù)重貼壁的梭形細胞數(shù)量。

1.2.6 CCK-8法檢測EPCs的增殖能力 以0.25%胰酶將每組細胞重新消化,制成單細胞懸液。再將等量細胞數(shù)重新接種到96孔培養(yǎng)板中,按照廠商提供的CCK-8試劑盒檢測步驟，每孔加入CCK-8試劑10 μL,繼續(xù)培養(yǎng)4 h,再以600 nm為參照波長，在酶標儀上450 nm處測吸收度A值。

1.2.7 Griess法檢測EPCs分泌NO的能力 將空白組和骨化三醇干預組的細胞繼續(xù)培養(yǎng)72 h后,各組分別吸取50 μL上清液加入96孔培養(yǎng)板中,按照廠商提供的步驟操作，依次加入GriessReagentⅠ、GriessReagentⅡ各50 μL,混勻后在酶標儀上570 nm處測A值。按廠商提供的步驟獲取NO標準曲線(0～100 μmol/L)。

2 結(jié)果

2.1 EPCs的鑒定 根據(jù)我們實驗室前期建立的培養(yǎng)鑒定方法[5]：培養(yǎng)到第3天洗去未貼壁的細胞，可以見到典型的細胞集落(圖1)。培養(yǎng)到第6天，形成了梭形內(nèi)皮樣貼壁細胞。細胞表型標志檢測顯示其表達CD34陽性細胞比例為75.25%±7.95%、VEGFR-2陽性細胞比例為8.06%±1.28%、CD133陽性細胞比例為5.95%±1.96%。通過激光共聚焦顯微鏡鑒定,結(jié)合FITC-UEA-I lectin的細胞激發(fā)綠色熒光,吞噬DiI-ac-LDL的細胞激發(fā)紅色熒光,雙染色陽性的細胞為正在分化的EPCs(圖2)。

圖1 培養(yǎng)第3天的細胞集落(400×)

圖2 細胞熒光表達結(jié)果(200×)

注：結(jié)合FITC-UEA-I lectin的細胞激發(fā)綠色熒光,吞噬DiI-ac-LDL的細胞激發(fā)紅色熒光

2.2 骨化三醇對EPCs數(shù)量、黏附能力、增殖能力及產(chǎn)生NO能力的影響 與對照組相比，不同濃度骨化三醇組貼壁EPCs的數(shù)量均增加(P<0.01),其中100 μmol/L組與50 μmol/L、10 μmol/L組之間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；不同濃度的骨化三醇均可增強EPCs的黏附能力(P<0.01),但各干預組間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；不同濃度的骨化三醇組對EPCs的增殖能力、產(chǎn)生NO能力均無明顯影響(P>0.05)。見表1。

表1 骨化三醇對EPCs數(shù)量黏附增殖和產(chǎn)生NO能力的影響

注：*與10、50 μmol/L組比較，t=7.16、8.48，P<0.05；#與10、50 μmol/L組比較，t=2.02、1.85，P>0.05；△與10 μmol/L組比較，t=1.65，P>0.05

3 討論

維生素D是一種類固醇激素，在人體內(nèi)主要靠太陽光照產(chǎn)生和攝入吸收兩種途徑獲取。以往認為維生素D僅參與人體內(nèi)調(diào)節(jié)鈣磷平衡代謝，但近年來其越來越多的其他生物學作用被發(fā)現(xiàn)[6]。國外多項流行病學研究發(fā)現(xiàn)，高血壓、冠狀動脈粥樣硬化性心臟病患者的血清維生素D水平降低，這種維生素D缺乏與心血管急性事件乃至死亡率存在一定相關(guān)性[3]。多項研究已經(jīng)證實維生素D缺乏會導致內(nèi)皮功能障礙。Pittarella等[7]研究發(fā)現(xiàn)，1,25-(OH)2D3可以直接作用于臍靜脈內(nèi)皮細胞，并通過NO途徑對其遷移能力、增殖能力產(chǎn)生影響。Mrtínez-Miguel等[8]發(fā)現(xiàn)，骨化三醇可以同時上調(diào)內(nèi)皮細胞合成內(nèi)皮素-1和NO，二者對維持內(nèi)皮細胞的功能平衡具有重要作用。

人外周血中的EPCs是一類內(nèi)皮前體細胞，稱為循環(huán)EPCs[9]，由骨髓動員進入外周血，細胞表型主要以CD34陽性為主，可以歸巢到血管損傷部位，能夠分化為成熟血管內(nèi)皮細胞，具有促進損傷區(qū)域血管新生和修復損傷血管內(nèi)膜的作用，同時具有旁分泌功能，能分泌VEGF-A、成纖維細胞因子-2等，對內(nèi)皮功能具有重要的修復及保護作用，因此，在冠狀動脈粥樣硬化性心臟病、高血壓等心血管疾病的發(fā)生發(fā)展過程中具有重要的保護作用[10]。鑒于骨化三醇、EPCs在內(nèi)皮功能上存在交叉點，因此，有學者開始探索研究骨化三醇與EPCs之間的直接關(guān)聯(lián)性。

Cianciolo等[11]證實，維生素D受體同樣存在于外周血循環(huán)EPCs上，通過對入選透析患者做補充活性維生素D治療后，可以增加循環(huán)EPCs的數(shù)量。Brodowski等[12]對子癇前期的孕婦適當給予補充維生素D后，其體內(nèi)的內(nèi)皮祖細胞功能得到改善。本實驗也進一步證實，骨化三醇可以直接提高體外培養(yǎng)的人外周血來源的EPCs的黏附能力；雖然各濃度組EPCs的增殖能力略受影響，但與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義；本實驗未能進一步證實骨化三醇可以提高EPCs產(chǎn)NO的能力，提示骨化三醇在對EPCs的生物學功能影響不一定是通過NO實現(xiàn)的。

目前已經(jīng)證實，維生素D受體廣泛存在于各類組織細胞和上皮細胞上，分為細胞核受體和細胞膜受體兩大類，是骨化三醇發(fā)揮生物學作用的主要受體[13]。維生素D受體存在于人體各類組織細胞和內(nèi)皮細胞[14]。在Cianciolo等[11]的研究基礎(chǔ)上，我們推測骨化三醇通過作用于EPCs的維生素D受體后，激活某種細胞信號轉(zhuǎn)導通路，并對EPCs的增殖、分化及旁分泌等功能產(chǎn)生影響。我們的后期實驗也將進一步探討該機制。綜合本實驗結(jié)果，由于人體內(nèi)的活性維生素D的濃度遠小于100 μmol/L[15]，因此，我們推測骨化三醇對體內(nèi)EPCs的作用有限，可能只是促進外周循環(huán)EPCs的歸巢作用，而本身對EPCs的功能影響較小，這仍需要更多的實驗數(shù)據(jù)來進一步證實。我們期望通過本實驗研究，使補充維生素D成為防治心血管疾病的有益補充。

[1] Christakos S,Dhawan P,Verstuyf A,et al.Vitamin D:metabolism,molecular mechanism of action,and pleiotropic effects[J].Physiol Rev,2016,96(1):365-408.

[2] Skaaby T.The relationship of vitamin D status to risk of cardiovascular disease and mortality[J].Dan Med J,2015,62(2):B5008.

[3] Beveridge LA,Struthers AD,Khan F,et al.Effect of vitamin D supplementation on blood pressure:a systematic review and meta-analysis incorporating individual patient data[J].JAMA Intern Med,2015,175(5):745-754.

[4] 余華,肖方毅,張懷勤,等.穩(wěn)定型心絞痛患者的血維生素D濃度和循環(huán)內(nèi)皮祖細胞的關(guān)系[J].醫(yī)學研究雜志,2012,41(11):154-158.

[5] 賈紅梅,張懷勤,夏雪,等.非對稱性二甲基精氨酸通過Caspase-3信號轉(zhuǎn)導通路誘導晚期內(nèi)皮祖細胞凋亡[J].中國動脈硬化雜志,2010,18(6):369-372.

[6] Berridge MJ.Vitamin D:a custodian of cell signalling stability in health and disease[J].Biochem Soc Trans,2015,43(3):349-358.

[7] Pittarella P,Squarzanti DF,Molinari C,et al.NO-dependent proliferation and migration induced by Vitamin D in HUVEC[J].J Steroid Biochem Mol Biol,2015,149:35-42.

[8] Martínez-Miguel P,Valdivielso JM,Medrano-Andrés D,et al.The active form of vitamin D,calcitriol,induces a complex dual upregulation of endothelin and nitric oxide in cultured endothelial cells[J].Am J Physiol Endocrinol Metab,2014,307(12):E1085-E1096.

[9] Madonna R,De Caterina R.Circulating endothelial progenitor cells:do they live up to their name[J].Vascul Pharmacol,2015,67-69:2-5.

[10]King TF,McDermott JH.Endothelial progenitor cells and cardiovascular disease[J].J Stem Cells,2014,9(2):93-106.

[11]Cianciolo G,La Manna G,Cappuccilli ML,et al.VDR expression on circulating endothelial progenitor cells in dialysis patients is modulated by 25(OH)D serum levels and calcitriol therapy[J].Blood Purif,2011,32(3):161-173.

[12]Brodowski L,Burlakov J,Myerski AC,et al.Vitamin D prevents endothelial progenitor cell dysfunction induced by sera from women with preeclampsia or conditioned media from hypoxic placenta[J].PLoS One,2014,9(6):e98527.

[13]Carlberg C,Molnár F.Vitamin dreceptor signaling and its therapeutic implications:genome-wide and structural view[J].Can J Physiol Pharmacol,2015,93(5):311-318.

[14]Lucock M,Jones P,Martin C,et al.Vitamin D:beyond metabolism[J].J Evid Based Complementary Altern Med,2015,20(4):310-322.

[15]Muscogiuri G,Altieri B,Penna-Martinez M,et al.Focus on vitamin D and the adrenal gland[J].Horm Metab Res,2015,47(4):239-246.

Pharmacologicaleffectsofcalcitriolonendothelialprogenitorcellsinvitro

YU Huaa,ZHU Zai-shenga,DU Xiao-honga,ZHANG Huai-qinb

(a.Department of Geriatric Medicine,b.Department of Cardiovascular Medicine,First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University,Wenzhou 325000,China)

ObjectiveTo observe the effect of calcitriol [1,25-(OH)2D3] on the number and function of endothelial progenitor cells (EPCs) in human peripheral blood.MethodsEPCs were obtained by Ficoll density gradient centrifugation and differential adherence method,and identified by flow cytometry and confocal laser scanning microscopy.Then,the attached cells were stimulated with calciriol (10,50 and 100 μmol/L) for 72 h.The number of EPCs,adhesion,proliferation,and production of nitric oxide (NO) were observed.ResultsCompared with control group,the number of attached cells in 10,50 and 100 μmol/L groups were 13.91±1.58,14.28±1.66,and 16.91±1.85,respectively,the difference being statistically significant (P<0.01);the number of reattached cells were 9.55±1.11,10.25±1.15 and 10.88±1.02,respectively,the difference being statistically significant (P<0.01);proliferation (OD value) were 0.285±0.005,0.301±0.009 and 0.321±0.006,respectively,and there was no statistically significant difference (P>0.05);the NO content in culture medium was 5.687 9±0.392 5,5.954 7±0.243 2 and 7.682 2±0.353 4 μmol/L,respectively,there being no statistically significant difference (P>0.05).ConclusionCalcitriol can improve adhesive ability of EPCs,but has no effect on either proliferation or secretion of NO in EPCsinvitro.

Calcitriol;Endothelial progenitor cells;Nitric oxide;Cardiovascular disease

2016-03-22

溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院a.干部保健科，b.心內(nèi)科，溫州 325000

溫州市科技局基金項目(Y20120141)

10.14053/j.cnki.ppcr.201709002