“益氣調(diào)血、扶本培元”藥線灸對多發(fā)梗死性癡呆大鼠海馬乙酰膽堿、乙酰膽堿酯酶、膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶含量的影響

羅本華 羅梅桂 張亞飛 王 燕

(廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530001)

“益氣調(diào)血、扶本培元”藥線灸對多發(fā)梗死性癡呆大鼠海馬乙酰膽堿、乙酰膽堿酯酶、膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶含量的影響

羅本華 羅梅桂1張亞飛2王 燕2

(廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530001)

目的觀察“益氣調(diào)血、扶本培元”藥線灸對多發(fā)梗死性癡呆(MID)大鼠海馬乙酰膽堿(ACh)、乙酰膽堿酯酶(AChE)、膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(ChAT)含量的影響。方法100只雄性大鼠經(jīng)MID造模、癡呆篩選后，隨機(jī)分為正常組、模型組、假手術(shù)組、藥線灸組、藥物組和藥線非穴組6組，各組10只；藥線灸組予壯醫(yī)藥線點(diǎn)灸治療，藥物組給予多奈哌齊口服治療，藥線非穴組給予針刺兩肋下非穴點(diǎn)治療，余3組未給予特別治療。經(jīng)4 w干預(yù)后處死動物，分離海馬，勻漿、分離上清，檢測ACh、AChE與ChAT含量。結(jié)果模型組ACh、ChAT含量較正常組顯著降低，AChE含量顯著升高(P<0.05)；藥線穴組與模型組ACh、AChE無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，藥線灸組能顯著升高ACh、ChAT和降低AChE含量，而藥物組只顯著升高ACh和降低AChE含量(P<0.05)；藥物組與藥線灸組比較無差異(P>0.05)。結(jié)論“益氣調(diào)血、扶本培元”藥線灸可以全面改善MID大鼠海馬ACh代謝障礙，且較多奈哌齊有療效優(yōu)勢。

藥線灸；血管性癡呆(VD)；乙酰膽堿(ACh)；乙酰膽堿酯酶(AChE)；鹽酸多奈哌齊

血管性癡呆(VD)以大腦認(rèn)知功能損害為核心癥狀的一種慢性進(jìn)行性疾病〔1〕，是癡呆的第二大原因〔2〕，也有報道是亞洲國家癡呆的首發(fā)原因〔3〕。研究表明針灸治療VD具有療效確切、安全、無毒副作用等優(yōu)點(diǎn)〔4〕。本實(shí)驗(yàn)觀察“益氣調(diào)血、扶本培元”藥線灸對多發(fā)梗死性癡呆(MID)大鼠海馬乙酰膽堿(ACh)、乙酰膽堿酯酶(AChE)及膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(ChAT)含量的影響。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 健康SPF級Wistar雄性大鼠100只，體重(280±20)g，由廣西醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供；室溫18～22℃，相對濕度45%，室內(nèi)采光按照白晝循環(huán)模式，標(biāo)準(zhǔn)粒飼料定時喂養(yǎng)，自由飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)15 d。大鼠AChE、ACh、ChAT酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)試劑盒96T(武漢基因美生物科技有限公司)；水合氯醛AR250G(No.SHLQ-250)；鹽酸多奈哌齊〔5 mg/片，衛(wèi)材(中國)藥業(yè)有限公司制造，國藥準(zhǔn)字H20050978〕，由廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑室協(xié)助配成濃度為10%的藥液。高速冷凍離心機(jī)(TGL-16M)，酶標(biāo)儀(芬蘭LabsystemsMultiskan MS公司)，洗板機(jī)(芬蘭ThermoLabsystems公司)，微量高速離心機(jī)(國產(chǎn))，HH.CP-01W隔水式恒溫培養(yǎng)箱(國產(chǎn))，PR0200電動玻璃勻漿儀(No.FLUKO)，Morris水迷宮(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所)。

1.2動物分組 采用隨機(jī)數(shù)字表法將100只大鼠隨機(jī)分為正常組10只、假手術(shù)組10只和預(yù)用栓子造模組80只；栓子造模組在經(jīng)過Morris水迷宮篩選出癡呆鼠40只，隨機(jī)分為模型組、藥線灸組、藥物組和藥線非穴組，各組10只。

1.3MID造模方法〔5〕取同種大鼠股動脈采血，無菌條件下于37℃溫箱內(nèi)自然干燥24 h，用100目篩子過篩，制備200 μm以下的血凝塊備用。應(yīng)用時每10 mg血栓加0.3 ml生理鹽水制成混懸液。3.5%水合氯醛按35 mg/100 g體重腹腔麻醉。頸正中切開皮膚(約1 cm)，剝離胸骨舌骨肌、肩胛舌骨肌與胸骨乳突肌，暴露頸外動脈，分離頸外動脈上兩分支，避開兩分支，分別在頸外動脈上備2根手術(shù)縫合線，結(jié)扎遠(yuǎn)心端，近心端先套一活結(jié)。用兒科4號頭皮針針頭逆行穿刺右頸外動脈至右頸內(nèi)動脈起始處，隨即用1 ml注射器緩慢(60～90 s)注入栓子鹽水懸液0.3 ml，使栓子通過頸內(nèi)動脈進(jìn)入顱內(nèi)至大腦各動脈，造成MID，然后結(jié)扎頸外動脈，縫合皮膚。切口處滴注慶大霉素抗感染。假手術(shù)組手術(shù)方法同模型制作，只是注射時以生理鹽水0.3 ml代替栓子溶液。

1.4模型篩選 栓子造模組于造模后7 d進(jìn)行Morris水迷宮隱蔽平臺試驗(yàn)〔6〕，連續(xù)訓(xùn)練5 d，1次/d。取第5天正常組大鼠逃避潛伏期的均值為參考值，同時計算栓子造模組大鼠第5天的平均逃避潛伏期與參考值之差占該鼠的平均逃避潛伏期時間的比值，>20%定義為癡呆鼠。只有符合癡呆條件的動物才用于本課題MID模型。

1.5針刺干預(yù)方法及療程 ①藥線灸組：治則：益氣調(diào)血，扶本培源。取穴：按“益氣調(diào)血、扶本培元”針法取穴，即按照華興邦動物穴位圖譜，取膻中、中脘、氣海及雙側(cè)血海、足三里。藥線灸操作方法：按《壯醫(yī)藥線灸療法》〔7〕采用2號藥線(直徑0.5 mm)，輕刺激手法點(diǎn)灸，按先上后下、先軀干再四肢、先陽后陰：次序點(diǎn)灸以上相應(yīng)腧穴各1壯。②模型組：給予藥線灸組相同時間、相同程度的捉抓刺激。③藥線非穴組：選取雙側(cè)肋下2個固定非穴點(diǎn)，針刺雙側(cè)肋下各兩個固定非穴點(diǎn)〔8〕，約相當(dāng)于乳正中線外開2.5 mm肋弓下1 mm平行肋弓方向向外下斜刺3 mm；作為對照刺激點(diǎn)，輕刺激手法藥線灸左3右4壯，或左4右3壯，交替。④假手術(shù)組：給予藥線灸組相同時間、相同程度的捉抓刺激。⑤正常組：給予藥線灸組相同時間、相同程度的捉抓刺激。⑥藥物組：于造模并癡呆篩選后將1 mg·kg-1·d-1鹽酸多奈哌齊溶于2 ml生理鹽水中灌胃，于每日早晨8∶00灌胃。以上各組于模型篩選后開始按相應(yīng)干預(yù)方法治療，每日治療1次，每周6次，共治4 w。

1.6大鼠海馬取材方法 實(shí)驗(yàn)干預(yù)方案完成后，即斷頭處死動物，開顱迅速取出整個腦組織，在冰上分離各組大鼠海馬組織，在冰冷生理鹽水中洗去血液，在電子天平上稱重后置于-80℃冰凍保存?zhèn)溆?，行相關(guān)檢測。

1.7ACh、AChE與ChAT含量測定 標(biāo)本融化后保持6℃的溫度備用，以0.1 g加0.9 ml磷酸鹽緩沖液(PBS)(pH7.4)比例加入PBS液，用超聲勻漿器冰上將標(biāo)本勻漿充分，離心5 min(3 000 r/min)，仔細(xì)收集上清，分裝后待檢測。采用雙抗體夾心法檢測ACh、AChE與ChAT含量；按ACh、AChE與ChAT相應(yīng)試劑盒步驟進(jìn)行檢測。

1.8統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS16.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

模型組與正常組、假手術(shù)組比較，ACh含量顯著降低，AChE顯著增高(P<0.01)，而正常組與假手術(shù)組比較無差異(P>0.05)；藥線非穴組與模型組ACh、AChE無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)；藥物組、藥線非穴組與模型組ChAT無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。藥物組、藥線灸組分別與模型組、藥線非穴組比較，ACh含量顯著升高，AChE顯著降低(P<0.05)；藥物組與藥線灸組比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。藥線灸組分別與模型組、藥線非穴組比較ChAT含量均有顯著升高(P<0.05)，并具有穴位特異性，但與正常組比較無差異(P>0.05)，已接近正常組水平；藥物組與藥線灸組比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。見表1。

表1 各組大鼠海馬ACh、AChE與ChAT含量比較

與模型組比較:1)P<0.05，2)P<0.01；與藥線非穴組比較：3)P<0.05，4)P<0.01；與正常組比較:5)P<0.05

3 討 論

膽堿能傳導(dǎo)通路受損可引起膽堿能缺陷和學(xué)習(xí)記憶功能障礙〔9，10〕。而ACh是膽堿能傳導(dǎo)通路的重要神經(jīng)遞質(zhì)，腦內(nèi)Ach存在于膽堿能神經(jīng)元囊泡中；由ChAT合成，AChE分解，通過ACh受體發(fā)揮生物效應(yīng)，在記憶、思維和智力中起著不可替代的作用。VD的膽堿能系統(tǒng)受損機(jī)制可能是由于缺血缺氧影響葡萄糖氧化代謝，使丙酮酸生成減少，從而使乙酰輔酶A生成減少，而后者為ACh的合成原料，最終導(dǎo)致ACh合成不足〔11〕，因而ACh是進(jìn)行及維持高級神經(jīng)功能的一種重要神經(jīng)遞質(zhì)，ACh濃度升高有利于學(xué)習(xí)記憶的恢復(fù)，有利于改善癡呆癥狀〔12〕，是直接反映學(xué)習(xí)記憶能力的指標(biāo)。AChE是ACh的水解酶，為觀察膽堿能神經(jīng)元的一個重要指標(biāo)；ChAT是細(xì)胞內(nèi)催化ACh合成的關(guān)鍵酶，在膽堿能神經(jīng)元胞體內(nèi)合成，與ACh分布幾乎平行，常作為研究膽堿能神經(jīng)元的標(biāo)志或評估ACh含量的間接指標(biāo)〔13〕；此二者相輔相成共同維持腦內(nèi)ACh含量的動態(tài)平衡。腦缺血時AChE釋放過多，分解ACh增強(qiáng)，導(dǎo)致ACh濃度降低，促進(jìn)癡呆的發(fā)生〔14〕，因此通過抑制AChE活性，有利于改善VD癥狀。研究發(fā)現(xiàn)，VD 患者海馬區(qū)和顳葉AChE有不同程度活性升高〔15〕。免疫組化染色發(fā)現(xiàn)，VD大鼠模型海馬各區(qū)ChAT陽性神經(jīng)元和纖維數(shù)量明顯減少，且與大鼠的學(xué)習(xí)記憶障礙程度呈正相關(guān)〔16〕。MID模型是國內(nèi)外認(rèn)可的VD動物模型之一，具備VD最核心的認(rèn)知行為學(xué)障礙，是進(jìn)行VD基礎(chǔ)研究和療效評價的理想模型〔17,18〕。本實(shí)驗(yàn)證明：MID模型組大鼠海馬ACh含量及ChAT活性較正常組大鼠明顯降低，AChE活性顯著性升高，是模擬VD的認(rèn)知功能障礙和中樞膽堿能系統(tǒng)受損機(jī)制的理想模型，是本實(shí)驗(yàn)研究可行的保證。

“益氣調(diào)血、扶本培元”該治則是基于“VD是與老年相關(guān)的、涉及三焦多個臟腑多臟器相關(guān)并夾雜諸多病理產(chǎn)物的疾病”、“三焦氣化失常與衰老相關(guān)論”〔19〕提出的，并隨筆者三焦與腦神經(jīng)病變的理論及“三焦與癡呆的發(fā)病觀、病機(jī)觀及取穴優(yōu)選”而相對完善〔20〕。“益氣調(diào)血、扶本培元”藥線灸又基于“益氣調(diào)血、扶本培元”針法的成熟，該針法經(jīng)歷幾十年臨床及臨床研究肯定療效，動物實(shí)驗(yàn)肯定了取穴優(yōu)選、改善VD認(rèn)知功能和改善VD發(fā)病的中樞ACh代謝障礙機(jī)制。而在此基礎(chǔ)上，數(shù)年來筆者發(fā)展為壯醫(yī)藥線灸方法的有效方法，在VD治療上，臨床已取得改善VD患者認(rèn)知功能的證據(jù)〔21,22〕，實(shí)驗(yàn)提示該療法的有效性。壯醫(yī)藥線灸療法操作較麥粒灸等著膚灸簡便，而不失著膚灸之功，保持了歷代灸法尤其直接灸養(yǎng)生保健、抗老防衰的功用，是臨床卓越的抗衰防老和防治VD的方法；此藥線灸法防治VD具有從“三焦氣化”論治VD的發(fā)病觀、病機(jī)觀、防治觀與“益氣調(diào)血，扶本培元”治則、組穴優(yōu)選、臨床療效和實(shí)驗(yàn)機(jī)理的基礎(chǔ)；本藥線灸法顯示的多途徑、多靶點(diǎn)和多層次作用于VD的中樞ACh代謝障礙機(jī)制，是本實(shí)驗(yàn)取得更佳療效的關(guān)鍵。

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〔2016-08-25修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)

R749

A

1005-9202(2017)18-4467-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2017.18.015

廣西壯族自治區(qū)衛(wèi)生廳中醫(yī)藥科技專項(xiàng)任務(wù)書(No.GZZY13-06)；廣西中醫(yī)藥大學(xué)重大課題(No.ZD12005)

1 2013級針灸碩士研究生 2 2014級針灸碩士研究生

羅本華(1968-)，男，醫(yī)學(xué)博士，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，主要從事中醫(yī)及壯醫(yī)針灸防治神經(jīng)系統(tǒng)疾病基礎(chǔ)與臨床研究。