不同方法誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞分化效果比較

彭卓穎，叢 喆，李 想，薛 婧，魏 強(qiáng)

(北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家中醫(yī)藥管理局人類疾病動(dòng)物模型三級(jí)實(shí)驗(yàn)室，新發(fā)再發(fā)傳染病動(dòng)物模型研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100021)

研究報(bào)告

不同方法誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞分化效果比較

彭卓穎，叢 喆，李 想，薛 婧*，魏 強(qiáng)*

(北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家中醫(yī)藥管理局人類疾病動(dòng)物模型三級(jí)實(shí)驗(yàn)室，新發(fā)再發(fā)傳染病動(dòng)物模型研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100021)

目的優(yōu)化不同方法刺激THP-1細(xì)胞定向分化為M1、M2巨噬細(xì)胞及DC細(xì)胞，為M1、M2和DC三種體外細(xì)胞模型研究奠定基礎(chǔ)。方法首先用PMA和GM-CSF/M-CSF兩種方法刺激誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞分化，再分別添加不同細(xì)胞因子誘導(dǎo)其分化為M1、M2和DC細(xì)胞，觀察細(xì)胞形態(tài)的變化，并用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面分子的表達(dá)情況。結(jié)果兩種方法刺激細(xì)胞CD分子表達(dá)的整體趨勢(shì)基本一致。THP-1-M1細(xì)胞表面CD80和CD86表達(dá)量顯著增加；THP-1-M2細(xì)胞高表達(dá)CD163和CD209；THP-1-DC細(xì)胞CD14表達(dá)量顯著降低，高表達(dá)CD80、CD86和CD11c。PMA刺激后，M1、M2和DC細(xì)胞均貼壁生長(zhǎng)；GM-CSF/M-CSF刺激后，只有DC細(xì)胞部分貼壁生長(zhǎng)，M1和M2細(xì)胞仍呈懸浮生長(zhǎng)。結(jié)論兩種方法均能成功地誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞向不同細(xì)胞亞型分化，但是誘導(dǎo)出來的細(xì)胞在形態(tài)上存在一定差異，可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求選擇刺激方法。

THP-1；佛波酯；粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞刺激因子/巨噬細(xì)胞集落刺激因子；M1巨噬細(xì)胞；M2巨噬細(xì)胞；樹突狀細(xì)胞；分化

單核細(xì)胞經(jīng)細(xì)胞因子刺激后，細(xì)胞的形態(tài)和功能會(huì)發(fā)生不同的變化，可向不同方向分化成若干亞型巨噬細(xì)胞(macrophage，Mφ)及樹突細(xì)胞(dendritic cell，DC)[1]。國(guó)際上多用佛波酯(phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA)、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF)和巨噬細(xì)胞集落刺激因子(macrophage colony-stimulating factor，M-CSF)協(xié)同其他細(xì)胞因子刺激人單核細(xì)胞系THP-1細(xì)胞定向分化，作為體外細(xì)胞模型對(duì)巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞開展相應(yīng)研究[1, 2]。本文分別用以上方法刺激THP-1定向分化為M1、M2和DC細(xì)胞，比較不同細(xì)胞因子組合刺激分化出的同種細(xì)胞在形態(tài)和細(xì)胞表面CD分子表達(dá)方面的差異，以期為開展巨噬細(xì)胞和樹突細(xì)胞的功能研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1材料

人單核細(xì)胞系THP-1購自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)所細(xì)胞中心；RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶均購自Gibco公司；細(xì)胞因子GM-CSF、IL-6購自R&D公司，IFN-γ、M-CSF、IL-13和IL-4購自Peprotech公司，LPS、PMA購自Sigma公司；流式抗體PE Mouse Anti-Human CD14、FITC Mouse Anti-Human CD163和PerCP-CyTM5.5 Mouse Anti-Human CD209購自BD公司，APC Mouse Anti-Human CD11c、FITC Mouse Anti-Human CD80和PE Mouse Anti-Human CD86購自BioLegend公司；同型對(duì)照抗體PE Mouse IgG2a、FITC Mouse IgG1、PerCP-CyTM5.5 Mouse IgG2b、APC Mouse IgG1和PE Mouse IgG2b分別購自BD和BioLegend公司；IC Fixation Buffer和10×Permeabilization Buffer購自eBioscience公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

THP-1為懸浮細(xì)胞，生長(zhǎng)速度較快，在含10%胎牛血清的RPMI-1640完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)，細(xì)胞濃度一般控制在5×105～ 1×106個(gè)/mL，置于37℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)。

1.2.2 PMA誘導(dǎo)THP-1 細(xì)胞定向分化為M1、M2和DC[1, 2]

取9×106個(gè)THP-1細(xì)胞接種于T25培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，定期向培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)加入不同細(xì)胞因子(表1)，PMA終濃度為50 ng/mL，其余細(xì)胞因子終濃度均為20 ng/mL，第6天收集細(xì)胞進(jìn)行流式檢測(cè)。

1.2.3 GM-CSF/M-CSF 誘導(dǎo)THP-1 細(xì)胞定向分化為M1、M2和DC[1]

取7×106個(gè)THP-1細(xì)胞接種于T25培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，定期向培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)加入不同細(xì)胞因子(表2)，其中刺激DC分化所使用的GM-CSF的終濃度為100 ng/mL，其余細(xì)胞因子終濃度均為20 ng/mL，第9天收集細(xì)胞進(jìn)行流式檢測(cè)。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面CD分子表達(dá)量的變化

培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后，用PBS洗滌2次后重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107個(gè)細(xì)胞/mL，輕輕混勻后加入流式管內(nèi)，每管100 μL細(xì)胞懸液。

(1)胞外染色：每管細(xì)胞中加入相應(yīng)抗體，4℃避光孵育30 min，PBS洗2次，細(xì)胞篩過濾后上機(jī)。

(2)胞內(nèi)染色[3]：向每個(gè)流式管內(nèi)加入200 μL IC fixation buffer，輕輕混勻后4℃避光孵育20 min，隨后加入2 mL 1× permeabilization buffer洗2次，100 μL 1× permeabilization buffer重懸細(xì)胞后加入相應(yīng)抗體，輕輕混勻后4℃避光孵育30 min，1× permeabilization buffer洗2次，PBS洗1次，細(xì)胞篩過濾后上機(jī)。

表1 PMA誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞定向分化方案

1.3流式分析與數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

應(yīng)用BD Accuri C6流式細(xì)胞儀進(jìn)行樣本檢測(cè)，F(xiàn)lowJo v10進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，Graphpad 5軟件作圖和統(tǒng)計(jì)分析，不同組數(shù)據(jù)間進(jìn)行方差分析，以P<0.05為差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1THP-1細(xì)胞經(jīng)不同細(xì)胞因子誘導(dǎo)分化后的形態(tài)學(xué)變化

正常THP-1細(xì)胞形態(tài)飽滿、折光性好，為單個(gè)細(xì)胞懸浮生長(zhǎng)(圖1A)。

當(dāng)THP-1被PMA刺激48 h后細(xì)胞全部貼壁，且發(fā)生明顯聚團(tuán)(圖1B)。隨后加入不同細(xì)胞因子誘導(dǎo)細(xì)胞定向分化，顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)THP-1-M1細(xì)胞形態(tài)具有多樣性，部分細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形(圖1D)；THP-1-M2細(xì)胞為多邊形，體積有所增加(圖1E)；THP-1-DC細(xì)胞貼壁較牢固，體積增大較明顯，大多具有細(xì)長(zhǎng)的樹突狀結(jié)構(gòu)，LPS和IL-6的加入未對(duì)細(xì)胞形態(tài)產(chǎn)生影響(圖1F)。

當(dāng)THP-1被GM-CSF/M-CSF刺激4 d后細(xì)胞仍呈懸浮生長(zhǎng)，部分發(fā)生聚團(tuán)，其中GM-CSF所刺激的細(xì)胞表面出現(xiàn)非常細(xì)小的突起(圖1C)，而M-CSF所刺激的細(xì)胞表面未發(fā)生變化。隨后加入不同細(xì)胞因子誘導(dǎo)細(xì)胞定向分化，顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)THP-1-M1細(xì)胞表面突起增多，胞膜出現(xiàn)褶皺(圖1G)；THP-1-M2細(xì)胞表面突起較THP-1-M1少，細(xì)胞多呈圓形(圖1H)；而THP-1-DC細(xì)胞大部分貼壁生長(zhǎng)，形狀不規(guī)則，伸出許多短小的樹突樣或偽足樣突起，第8天加入LPS和IL-6后細(xì)胞形態(tài)未發(fā)生明顯改變(圖1I)。

表2 GM-CSF/M-CSF誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞定向分化方案

注：A：正常THP-1； B：PMA刺激后的THP-1； C：GM-CSF刺激后的THP-1； D：THP-1-M1(PMA)；E：THP-1-M2(PMA)； F：THP-1-DC(PMA)； G:THP-1-M1(GM-CSF)； H: THP-1-M2(M-CSF)； I: THP-1-DC(GM-CSF)。圖1 不同細(xì)胞因子刺激后THP-1細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變(×40)Note.A: Normal THP-1 cells; B: THP-1 cells stimulated by PMA; C: THP-1 cells stimulated by GM-CSF; D: THP-1-M1 (PMA) cells; E: THP-1-M2 (PMA) cells; F: THP-1-DC (PMA) cells; G: THP-1-M1 (GM-CSF) cells; H: THP-1-M2 (M-CSF) cells; I: THP-1-DC (GM-CSF) cells.Fig.1 Morphological changes of THP-1 cells stimulated by different cytokines

2.2THP-1細(xì)胞經(jīng)不同細(xì)胞因子誘導(dǎo)分化后的細(xì)胞表面CD分子表達(dá)的差異

2.2.1 THP-1-M1細(xì)胞表面CD分子的表達(dá)

正常THP-1細(xì)胞表面低表達(dá)CD80[(11.27±2.73)%]。當(dāng)PMA或GM-CSF刺激THP-1為THP-1-M1后，細(xì)胞表面的CD80顯著升高，其表達(dá)量分別達(dá)到(77.05±7.28)%和(93.10±8.20)%，P值分別為0.0069和0.0055；兩種方法所誘導(dǎo)的CD80的表達(dá)差異無顯著性(P= 0.1744)。

正常THP-1細(xì)胞表面不表達(dá)CD86。而分化后的THP-1-M1細(xì)胞高表達(dá)CD86，其表達(dá)量分別高達(dá)(78.0±6.93)%和(49.65±6.72)%，P值分別為0.0043和0.0103；兩種方法所誘導(dǎo)的CD86的表達(dá)量差異無顯著性(P= 0.0534)(圖2)。

注：“……”同型對(duì)照；“ ”CD分子。與THP-1組相比，*P<0.05,**P<0.01。圖2 兩種方法刺激THP-1分化為THP-1-M1細(xì)胞后CD分子的表達(dá)情況Note. “……”Isotype control; “”CD molecules. Compared with THP-1 group,*P<0.05,**P<0.01.Fig.2 Expression of CD molecules on THP-1-M1 cells stimulated by different cytokines

2.2.2 THP-1-M2細(xì)胞表面CD分子的表達(dá)

正常THP-1細(xì)胞胞內(nèi)低表達(dá)CD163[(15.10±5.66)%]。當(dāng)分化為THP-1-M2后，CD163的表達(dá)量顯著升高，其表達(dá)量分別為(53.80±9.90)%和(67.15±4.60)%，P值分別為0.0408和0.0097；兩種方法所誘導(dǎo)的CD163的表達(dá)量差異無顯著性(P= 0.2258)。

CD209在正常THP-1細(xì)胞表面低表達(dá)[(25.30±7.07)%]。而THP-1-M2細(xì)胞則高表達(dá)CD209，其表達(dá)量分別達(dá)到(93.00±3.39)%和(72.70±11.88)%，P值為0.0066和0.0400；兩種方法所誘導(dǎo)的CD209的表達(dá)量差異無顯著性(P= 0.1458)(圖3)。

2.2.3 THP-1-DC細(xì)胞表面CD分子的表達(dá)

正常THP-1細(xì)胞高表達(dá)CD14 [(89.70±1.41)%]、CD11c [(78.15±11.95)%]、CD80和CD86表達(dá)呈陰性。當(dāng)PMA和GM-CSF刺激THP-1為THP-1-DC后，細(xì)胞表面的CD14顯著降低，其表達(dá)量分別為(17.3±2.40)%和(20.85±7.28)% (P值分別為0.0007和0.0058)。CD11c的表達(dá)無明顯變化，分別為(58.0±10.04)%和(74.95±6.01)%(P值分別為0.2094和0.7673)。CD80和CD86的表達(dá)量顯著升高，CD80的表達(dá)量分別達(dá)到(39.41±7.48)%和(20.56±4.59)%(P值分別為0.0195和0.0302)；CD86表達(dá)量分別為(78.35±4.88)%和(73.10±6.79)%(P值分別為0.0024和0.0049)。兩種方法所誘導(dǎo)的CD分子的表達(dá)差異無顯著性，P> 0.05(圖4)。

3 討論

一直以來，單核巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞都是固有免疫系統(tǒng)中研究的重點(diǎn)。然而由于其數(shù)量少、分離困難[4,5]，使得其研究工作受限。THP-1是來源于急性單核細(xì)胞性白血病患者的一種單核細(xì)胞系，高表達(dá)CD14分子[6]，目前多用來代替原代單核細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)研究。對(duì)于巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞，國(guó)際上較通用的方法為以GM-CSF/M-CSF為主，輔以IL-4、LPS等其他相關(guān)細(xì)胞因子刺激原代單核細(xì)胞進(jìn)行分化，單核細(xì)胞系的分化則多用PMA進(jìn)行誘導(dǎo)，然而GM-CSF/M-CSF刺激單核細(xì)胞系分化的研究比較欠缺。為了明確兩種刺激方法誘導(dǎo)單核細(xì)胞系分化的差異，本文利用THP-1為單核細(xì)胞系模型，并在GM-CSF/M-CSF和PMA兩種方法的基礎(chǔ)上做了進(jìn)一步優(yōu)化[1]，對(duì)其誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞的分化效果進(jìn)行對(duì)比。

注：“……”同型對(duì)照；“”CD分子。與THP-1組相比，*P<0.05,**P<0.01。圖3 兩種方法刺激THP-1分化為THP-1-M2細(xì)胞后CD分子的表達(dá)情況Note: “……”Isotype control; “”CD molecules. Compared with THP-1 group,*P<0.05,**P<0.01.Fig.3 Expression of CD molecules in THP-1-M2 cells stimulated by different cytokines

注：“…… ”同型對(duì)照；“”CD分子。與THP-1組相比，ns:差異無顯著性；*P<0.05,**P<0.01，***P<0.001。圖4 兩種方法刺激THP-1分化為THP-1-DC細(xì)胞后CD分子的表達(dá)情況 Note.“…… ”Isotype control; “ ”CD molecules.Cmpared with THP-1 group, ns:not significant,*P<0.05,**P<0.01，***P<0.001.Fig.4 Expression of CD molecules on THP-1-DC cells stimulated by different cytokines

M1巨噬細(xì)胞表面較典型的分子為CD80和CD86[1]。當(dāng)單核細(xì)胞分化為M1后，細(xì)胞表面的協(xié)同刺激因子CD80和CD86的表達(dá)量都會(huì)增加，此時(shí)細(xì)胞在免疫反應(yīng)中對(duì)抗原的提呈能力增強(qiáng)[7]。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，THP-1細(xì)胞經(jīng)PMA與GM-CSF刺激誘導(dǎo)出的THP-1-M1均可高表達(dá)這兩種CD分子，但是M1細(xì)胞的形態(tài)差異較大。PMA刺激后的細(xì)胞貼壁明顯，可清晰觀察到細(xì)胞表面的突起，形態(tài)上接近巨噬細(xì)胞，但是后期消化極度困難，易破碎，細(xì)胞不好再利用；GM-CSF刺激后的THP-1-M1細(xì)胞一直為懸浮生長(zhǎng)，表面突起不明顯，但細(xì)胞表面標(biāo)志性的CD分子表達(dá)量正常，與PMA刺激的THP-1-M1細(xì)胞沒有明顯差異。

M2巨噬細(xì)胞高表達(dá)CD163和DC-SIGN[8]。CD163分子為清道夫受體蛋白，可參與機(jī)體多種免疫活動(dòng)，對(duì)正常生理功能有非常重要的作用[9]；DC-SIGN又被稱作CD209，巨噬細(xì)胞表面的CD209可識(shí)別并結(jié)合病毒或細(xì)菌表面的病原相關(guān)分子模式受體[10]。本研究中PMA與M-CSF均可成功誘導(dǎo)出M2細(xì)胞，高表達(dá)CD163與CD209，但與M1細(xì)胞相同，兩種方法刺激分化出的THP-1-M2細(xì)胞在形態(tài)上同樣有很大差別。

DC細(xì)胞沒有特征性的標(biāo)志分子，一般會(huì)通過細(xì)胞表面CD14、CD80、CD86和CD11c等分子的表達(dá)來判斷細(xì)胞的分化情況。研究結(jié)果顯示，PMA與GM-CSF所刺激分化出的細(xì)胞表面分子的變化與文獻(xiàn)中報(bào)道一致[11, 12]，CD14明顯下降，高表達(dá)CD80、CD86和CD11c。細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，體積明顯增大，大多具有細(xì)長(zhǎng)的樹突狀結(jié)構(gòu)。PMA刺激出的DC細(xì)胞整體形態(tài)及樹突均偏細(xì)長(zhǎng)，而GM-CSF刺激出的DC細(xì)胞偏多邊形，樹突短粗。

綜上所述，GM-CSF/M-CSF和PMA兩種方法均可誘導(dǎo)單核細(xì)胞系THP-1向M1、M2型巨噬細(xì)胞和DC細(xì)胞方向分化，所誘導(dǎo)的細(xì)胞表面分子的變化趨勢(shì)較一致，但是在形態(tài)學(xué)方面差異較大。GM-CSF/M-CSF誘導(dǎo)出的M1和M2型巨噬細(xì)胞均為懸浮生長(zhǎng)，DC細(xì)胞處于半貼壁狀態(tài)，有利于細(xì)胞的獲取再利用方面的研究，如流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)；PMA所誘導(dǎo)出的M1、M2和DC細(xì)胞貼壁較牢固，消化困難，但其形態(tài)上更接近原代細(xì)胞，有利于細(xì)胞形態(tài)學(xué)方面的研究，如間接免疫熒光染色、激光共聚焦等。因此可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，針?duì)性選擇刺激方法，這將有助于我們更好地開展巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞的功能研究。

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ComparisonoftheeffectsofdifferenttreatmentsonTHP-1celldifferentiation

PENG Zhuo-ying, CONG Zhe, LI Xiang, XUE Jing*, WEI Qiang*

(Comparative Medicine Center, Peking Union Medical College (PUMC) & Institute of Laboratory Animal Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences (CAMS) Medical; Key Laboratory of Human Disease Comparative Medicine, Ministry of Health; Key Laboratory of Human Disease Animal Models, State Administration of Traditional Chinese Medicine, Beijing Key Laboratory for Animal Models of Emerging and Remerging Infectious Diseases, Beijing 100021, China)

ObjectiveTo stimulate a human monocytic cell line THP-1 cells to differentiate into M1, M2 macrophages and dendritic (DC) cells by optimization of different methods, and lay the foundation for the study of M1, M2 and DC cell modelsinvitro.MethodsTHP-1 cells were stimulated by PMA and GM-CSF/M-CSF, respectively. Then, they were induced to differentiate into M1, M2 macrophages and DC cells by adding different cytokines, such as LPS, IL-6 and IFN-γ for M1 macrophages, IL-4, IL-13 and IL-6 for M2 macrophages, and IL-4 for DCs. Subsequently, the morphology of cells was observed and the expression of cell surface (CD) molecules was detected by flow cytometry.ResultsAfter stimulation with the two methods, the trends of CD molecules expression were basically the same. The expression of CD80 and CD86 on the THP-1-M1 cells were increased significantly, and CD163 and CD209 were highly expressed on the THP-1-M2 cells. For THP-1-DC cells, the expression of CD14 was significantly decreased, while the expression of CD80, CD86 and CD11c increased. M1, M2 macrophages and DC cells were adherent after stimulation with PMA. However, DC cells were partially adherent after GM-CSF/M-CSF treatment. M1 and M2 macrophages were also growing in suspension.ConclusionsBoth methods used in this study can successfully induce THP-1 cells to differentiate into different subtypes, but there are some differences in the morphology of the induced cells. Appropriate stimulation method can be selected according to the experimental requirements.

THP-1 cell line; Phorbol 12-myristate 13-acetate, PMA; GM-CSF/M-CSF; M1 macrophage; M2 macrophage; Dendritic cell; Differentiation

R-33

A

1671-7856(2017)09-0001-06

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.09.001

2016-12-28

國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目(編號(hào)：81301437)；科技部重大專項(xiàng)(編號(hào)：2014ZX10001001-001-004， 2014ZX10001001-002-006)。

彭卓穎 (1992- )，女，碩士研究生，從事實(shí)驗(yàn)動(dòng)物病毒學(xué)研究工作。E-mail: 18810963239@163.com

薛婧 (1983- )，女，副研究員，碩士生導(dǎo)師，研究方向：病原生物學(xué)和免疫學(xué)，E-mail: xuejing@cnilas.org; 魏強(qiáng) (1964- )， 男，研究員，博士生導(dǎo)師，研究方向：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物病毒學(xué)， E-mail: weiqiang0430@cnilas.org *共同通訊