馴鹿EGFR基因克隆及序列分析1)

王強輝 翟健程 夏彥玲 劉偉石 李和平

(東北林業(yè)大學，哈爾濱，150040)

馴鹿EGFR基因克隆及序列分析1)

王強輝 翟健程 夏彥玲 劉偉石 李和平

(東北林業(yè)大學，哈爾濱，150040)

以快速生長期雄性馴鹿(Rangifertarandus)鹿茸頂端表皮組織為研究材料，提取其頂端表皮組織總RNA，參考GenBank數(shù)據(jù)庫中牛、羊的表皮生長因子受體(EGFR)基因序列設計同源引物；采用RT-PCR技術(shù)、分子克隆技術(shù)首次成功獲得雄性馴鹿茸頂端表皮組織EGFR基因編碼區(qū)部分cDNA序列，片段大小為910 bp；Blast比對發(fā)現(xiàn)馴鹿EGFR基因與牛、羊、馬、人、鯨、野豬的同源性分別是97%、96%、88%、86%、92%、89%，同源性均在85%以上，表明馴鹿EGFR基因在進化上比較保守；構(gòu)建系統(tǒng)進化樹發(fā)現(xiàn)馴鹿EGFR基因與牛親緣關(guān)系最近，與人的親緣關(guān)系最遠；最后通過在線分析軟件預測獲得EGFR基因序列對應mRNA最小自由能二級結(jié)構(gòu)。

馴鹿；EGFR基因；RT-PCR；分子克?。簧镄畔W

表皮生長因子受體(EGFR)是細胞表面具有配體介導的受體酪氨酸激酶活性的跨膜蛋白，是重要的ErbB受體蛋白家族成員，又名ErbB-1[1]。EGFR分子具有3個結(jié)構(gòu)域，分別是與配體結(jié)合區(qū)、跨膜區(qū)以及羧基端具有受體酪氨酸激酶活性的區(qū)域[2]。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的ErbB家族成員有EGFR/ErbB-1、ErbB-2、ErbB-3、ErbB-4[3]，其中對EGFR研究最為廣泛。研究發(fā)現(xiàn)，EGFR存在6種配體類型，分別是表皮生長因子(EGF)、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)、安非調(diào)節(jié)素、Bcta-celluin、肝素結(jié)合樣EGF、表皮調(diào)節(jié)素(EPR)，其中EGF、TGF、Qmhiregulin只能和EGFR結(jié)合，其余的和其他ErbB家族配體共同結(jié)合發(fā)揮作用[4]。大量研究表明，EGFR基因的過量表達或者變化與人類腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移、浸潤有著密切的關(guān)系[5]，其作用機理是EGFR與配體結(jié)合進而激活本身固有的酪氨酸激酶的活性，酪氨酸殘基進行自身磷酸化活化EGFR，活化后的EGFR可以通過一系列信號轉(zhuǎn)導通路激活下游的生長因子活性，從而刺激細胞增殖、分化、抗凋亡等[6]。EGFR基因的表達直接影響到生命活動，它是一個多效基因，其突變和過量表達都會使得正常生命活動的改變，例如已有研究表明在癌癥細胞中EGFR基因總存在過表達的現(xiàn)象[7]，這就使得EGFR基因研究為癌癥治療提供了新的方向，孫夢梅的研究表明，人源性EGFR抗體能夠抑制腫瘤細胞增殖和擴散[8]。鹿茸作為一種能夠完全再生的骨質(zhì)性器官，且快速生長期細胞分裂速度遠遠超過腫瘤細胞分裂速度(約為癌細胞分裂速度的30多倍)的正常細胞[9]，對其EGFR基因的探索對于人類疾病治療以及鹿茸生長研究有著巨大的價值。

馴鹿(Rangifertarandus)是唯一雌雄都具角的鹿科動物，在我國僅分布在大興安嶺地區(qū)，在敖魯古雅河畔形成了特有的鄂溫克馴鹿文化[10]。馴鹿因其獨特的生理和文化特征聞名世界，也吸引著廣大學者的關(guān)注。鹿茸研究一直是鹿科動物研究的熱點，尤其鹿茸再生機理和神奇的細胞分裂速度一直被認為是再生生物學領域[11]和生物醫(yī)學領域[12]重要的生物模型。鹿茸細胞的快速增殖和生長因子以及生長因子受體的作用息息相關(guān)。馮海華等研究表明，IGF-1對鹿茸中心細胞增殖有著重要作用，并且不同生長時期影響不同[13]。楊曉光在馬鹿鹿茸頂端茸皮和軟骨組織轉(zhuǎn)錄組研究中發(fā)現(xiàn)，EGFR基因是茸皮組織中高表達的生長因子受體基因之一[14]，但GenBank中沒有鹿源性EGFR基因的任何記錄，因此筆者參考近緣物種牛、羊等的EGFR基因序列設計同源引物，應用RT-PCR技術(shù)、T-A克隆技術(shù)展開對EGFR基因的探索，首次成功克隆獲得EGFR基因編碼區(qū)的部分cDNA序列，并對此序列進行生物信息學分析，為馴鹿EGFR基因的后續(xù)研究提供可參考的試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品的采集與保存

選用遼陽千山呈龍科技有限公司養(yǎng)鹿場引自根河市敖魯古雅鄉(xiāng)的成年健康雄性馴鹿作為試驗對象，于2016年鹿茸快速生長期切取雄性馴鹿茸頂端大約5 cm，參考Li et al.[15]對馬鹿鹿茸頂端組織分層的方法，先將樣品表面迅速消毒，縱向剖開，取其頂端表皮組織，采集完后迅速放入液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2馴鹿茸頂端表皮組織總RNA提取及cDNA的合成

總RNA提取和純化：運用Trizol法[16]提取總RNA，根據(jù)Trizol試劑盒說明步驟提取總RNA，完成總RNA提取后進行純化，再用1%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，最后使用紫外分光光度計測定總RNA的濃度和純度。

模板cDNA的合成：根據(jù)M-MLV3逆轉(zhuǎn)錄酶的要求按照20 μL體系合成第一鏈cDNA，其體系組分為，總RNA2.0 μL、RT-buffer 4.0 μL、dNTPs 2.0 μL、RNase inhibitor 1.0 μL、Oligo-dT 1.0 μL、逆轉(zhuǎn)錄酶 1.0 μL、DEPC處理水9.0 μL，反應條件為，42 ℃ 20 min、 99 ℃ 5 min、4 ℃ 5 min，完成后瞬間離心，放于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 馴鹿EGFR基因的擴增及克隆

引物合成：參考GenBank數(shù)據(jù)庫中牛、羊、印度水牛、犀牛等同源物種EGFR基因mRNA序列，利用Primer Premier 5.0設計引物，由哈爾濱新海生物公司合成。上游引物EGFRF：5′GCACTTTTGAAGACCACT 3′；下游引物EGFRR：5′AACTCACCGATTCCTATT 3′。

EGFR基因擴增與回收：以cDNA為模板、EGFRF為上游引物、EGFRR為下游引物進行PCR反應獲取目的基因。PCR反應條件為，94 ℃預變性5 min，然后94 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，36個循環(huán)，循環(huán)結(jié)束后72 ℃延伸10 min，最后4 ℃保存。將擴增產(chǎn)物按照凝膠回收試劑盒說明進行回收并純化，通過以上兩步成功獲得目的基因。

EGFR基因克?。喝∩鲜霾襟E中回收產(chǎn)物3.5 μL參照連接體系說明書進行連接，將目的基因成功連入PMD18-T載體中，然后將連有目的基因的載體與大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞完成轉(zhuǎn)化，將成功轉(zhuǎn)化的細胞在超凈工作臺用涂布棒均勻涂在事先準備好的LB固體培養(yǎng)基上，在37 ℃恒溫生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12～14 h，最后經(jīng)過藍白斑篩選得到帶有目的基因的15個白色菌落，將菌落挑至加有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，在恒溫搖床培養(yǎng)6～8 h，進行陽性檢測。

1.4 馴鹿EGFR基因序列測定

克隆成功的菌液送往吉林庫美生物公司進行雙向測序，測序結(jié)果經(jīng)過Chromas峰圖查看，DNAstar分析，確認測序結(jié)果可靠性。

1.5 馴鹿EGFR基因生物學信息分析

測序結(jié)果運用DNAstar中SeqMan進行檢測校準，對準確的目的序列通過Blast進行初步分析，比對馴鹿EGFR基因與其他物種EGFR基因的同源性，下載同源序列，運用Mega5.0構(gòu)建系統(tǒng)進化樹、DNAman分析對比物種間差異堿基的個數(shù)以及位點，運用ViennaRNA Web Services對得到序列所對應的mRNA二級結(jié)構(gòu)進行預測，綜合分析馴鹿EGFR基因所攜帶的生物信息。

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA提取與目的片段擴增

總RNA在1%的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示5.8S、18S、28S條帶清晰無拖帶，且28S亮度約為18S亮度的二倍(圖1)，提取質(zhì)量濃度為1 760.4 mg·L-1，OD260/OD280為2.0，表明其質(zhì)量濃度以及純度均達到后續(xù)試驗的要求。

M.DL2000 Marker；A.總RNA。

2.2 馴鹿EGFR基因部分cDNA的克隆及陽性檢測

馴鹿EGFR基因擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測發(fā)現(xiàn)1條900 bp左右的特異性條帶(圖2)，將該條帶純化回收克隆，通過對15個克隆菌落的陽性檢測，確認克隆成功后(圖3)進行雙向測序，測序結(jié)果經(jīng)DNAstar拼接獲得大小為910 bp基因序列，完全與預期的目的基因大小一致。進一步Blast比對分析，確認此序列是馴鹿EGFR基因編碼區(qū)的部分cDNA序列。測序結(jié)果如下：GCACTTTTGAAGACCACTTTCTGAGCCTCCAGAGGATGTTCAACAACTGTGAGGTGGTCCTTGGGAATTTGGAAATTACCTACATGCAGAGTAGTTACAACCTTTCTTTTCTCAAGACCATCCAGGAGGTTGCTGGCTATGTACTCATTGCCCTCAACACAGTGGAGAAGATTCCGCTGGAAAACCTGCAGATCATCCGAGGAAATGTGCTTTATGAAAACACCCATGCCTTAGCGGTCTTATCCAACTATGGAGCAAACAAAACCGGACTGAGGGAGCTGCCCTTGAGAAACTTACAGGAAATTCTGCAAGGTGCCGTGCGATTCAGCAACAACCCTGTCCTCTGCAACGTGGAGACCATCCAGTGGCGGGACATCGTCAACCCTGACTTTCTAAGCAACATGACAGGGGACTTTCAGAACCAGCTGAGCAACTGCCCGAAGTGTGATCCAGTCTGTCTCAATGGAAGCTGCTGGGGTGCTGGGAAGGAGAACTGCCAGAAATTGACCAAAATCATCTGTGCCCAGCAGTGTTCCGGGCGCTGCCGTGGCAGGTCCCCCAGCGACTGCTGTCACAACCAGTGCGCCGCTGGCTGCACGGGGCCACGGGAGAGTGACTGCCTGGTCTGCCGCAGGTTCCGTGATGAAGCCACTTGCAAGGACACGTGTCCGCCACTCATGCTCTATGACCCTACCACCTACGAGATGAAGGTCAACCCGCTGGGGAAGTACAGCTTTGGTGCCACCTGTGTCAAGAAGTGTCCCCGTAACTATGTGGTGACAGACCACGGCTCATGCGTCCGCGCCTGCAGTTCTGACAGCCAGGAGGTAGAAGAGGATGGTGTCCGCAAGTGTAAAAAGTGTGACGGGCCTTGTGGCAAAGTTTGTAACGGAATAGGAATCGGTGAGTT.

M．DL2000 DNA marker；1-3為馴鹿EGFR基因部分cDNA擴增片段。

圖2馴鹿EGFR基因RT-PCR擴增結(jié)果

M．DL2000 DNA Marker；1-15為EGFR基因部分cDNA克隆片段。

2.3 馴鹿EGFR基因序列同源性比較

為進一步了解馴鹿與其他哺乳動物EGFR基因的同源性，將獲得的馴鹿EGFR基因序列在GenBank中經(jīng)Blast對比，并下載與其他哺乳動物同源區(qū)段，結(jié)合DNAman綜合對比分析，馴鹿EGFR部分cDNA序列與其他物種序列的綜合對比見圖4，結(jié)果顯示其與?？苿游镏杏《人！⒁芭?、家牛同源性最高，為97%，其次為羊96%、小須鯨92%、野豬89%、馬88%、人86%。這就說明馴鹿EGFR基因在進化上是相對保守且和偶蹄目動物具有高度相似性。

圖4 馴鹿EGFR基因與其他哺乳動物基因系統(tǒng)進化樹

2.4 馴鹿EGFR基因系統(tǒng)進化樹構(gòu)建

根據(jù)馴鹿EGFR基因部分cDNA序列，經(jīng)Blast對比后從GenBank數(shù)據(jù)庫中下載與馴鹿此段序列同源的人、牛、羊、馬、野豬、小須鯨的序列經(jīng)分析整理，運用Mega5.0構(gòu)建系統(tǒng)進化樹(圖4)。由圖4可見，馴鹿EGFR基因與牛、羊親緣關(guān)系最近，與人和馬親緣關(guān)系最遠，與小須鯨的親緣關(guān)系較近、野豬次之，這一結(jié)論符合經(jīng)典分類學規(guī)律。

2.5 馴鹿EGFR基因mRNA二級結(jié)構(gòu)預測

根據(jù)測序獲得的馴鹿EGFR基因部分cDNA序列，運用在線分析軟件ViennaRNA Web Services對EGFR基因的cDNA相應的mRNA進行最小自由能二級結(jié)構(gòu)預測，預測結(jié)果見圖5。

圖5 MFE二級結(jié)構(gòu)預測

3 討論

鹿茸周期性生長和神奇的增殖速度使得其一直成為生命研究領域較為熱門的話題，隨著研究的不斷深入(從早期鹿茸表形態(tài)研究到現(xiàn)在分子作用機理以及基因表達層面的研究)，使得研究成果不斷向?qū)嵺`轉(zhuǎn)化，為攻克目前生物醫(yī)學難題奠定基礎。EGFR基因作為生命活動的重要受體基因之一，對于生命活動的正常運行起著至關(guān)重要的作用。馴鹿作為唯一雌雄都長角的鹿科動物，對于某些功能基因在雌雄之間的探索區(qū)別其他單一性別長角的鹿科動物，這就使得本研究具有特殊的生物學意義。

在本研究中成功克隆獲得馴鹿EGFR基因的部分cDNA序列，其片段大小為910 bp，通過Blast、DNAman、DNAstar、MEGA5.0分析得到EGFR基因在物種進化中比較保守，與其他動物如牛、羊、豬、馬等的同源性均在85%以上，是重要的功能基因。2015年楊曉光在馬鹿鹿茸頂端茸皮和軟骨組織轉(zhuǎn)錄組研究中發(fā)現(xiàn)，EGFR基因在茸皮組織中表達，且表達量相對較高；通過KEGG信號通路分析，EGFR基因與鹿茸生長有著重要的聯(lián)系[14]。本研究運用DNAman的多序列對比功能將獲得的馴鹿EGFR基因的部分序列與牛、羊、馬、鯨、豬、人對比，發(fā)現(xiàn)7個物種EGFR基因部分cDNA序列僅在211、235、253、453、481、604、604、652、664、709、841 bp十個基因位點有明顯差異，其他位點堿基同源性極高；在MEGA5.0系統(tǒng)進化樹構(gòu)建中發(fā)現(xiàn)馴鹿EGFR基因與牛的親緣關(guān)系最近，與人親緣關(guān)系最遠，其中羊、小須鯨、野豬、馬與馴鹿的親緣關(guān)系介于牛和人之間，依據(jù)分類學特點理論上應該是牛、羊、野豬同屬偶蹄目其親緣關(guān)系應該較馬、鯨、人與馴鹿近，但實驗結(jié)果表明野豬EGFR基因在分子層面與馴鹿EGFR基因的親緣關(guān)系較遠；最后在用在線分析軟件ViennaRNA Web Services對馴鹿EGFR基因部分cDNA對應的mRNA進行最小自由能二級結(jié)構(gòu)預測(圖5)，從圖中可以看出，mRNA二級結(jié)構(gòu)莖區(qū)和環(huán)區(qū)分布比較合理，結(jié)構(gòu)相對比較穩(wěn)定，是快速生長期馴鹿茸表皮組織EGFR基因穩(wěn)定表達的結(jié)構(gòu)基礎。

基于前人對EGFR基因研究，筆者認為通過對馴鹿EGFR基因的探索，尤其對EGFR基因序列分析、調(diào)控作用原理以及信號通路的研究，對于鹿茸快速生長機理的深入了解和生物模型的構(gòu)建有著廣闊的前景，且能為后續(xù)鹿茸生長發(fā)育分子生物學研究提供可供參考的試驗依據(jù)。

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CloningandSequenceAnalysisofEGFRGeneinReindeer//

Wang Qianghui, Zhai Jiancheng, Xia Yanling, Liu Weishi, Li Heping
(Northeast Forestry University, Harbin 150040, P. R. China)//Journal of Northeast Forestry University，2017,45(9)：77-80.

Reindeer；EGFRgene； RT-PCR； Molecular cloning； Bioinformatics

Q781

1)國家林業(yè)局珍稀瀕危物種野外救護與繁育項目(2012)；中央高?；究蒲袠I(yè)務專項資金項目(2572016AA42)。

王強輝，男，1994年8月生，東北林業(yè)大學野生動物資源學院，碩士研究生。E-mail：wangqianghui@nefu.edu.cn。

李和平，東北林業(yè)大學野生動物資源學院，教授。E-mail：lihepinghrb2002@nefu.edu.cn。

2017年3月24日。

責任編輯：程 紅。

The epidermal tissue of antler-tip of male reindeer was used as the research materials, and total RNA was extracted from it. The homologous primers were designed according to the epidermal growth factor receptor (EGFR) gene sequence of cattle and sheep in GenBank database. Part cDNA sequences EGFR gene in coding region, which had 910 base pairs in length, was first obtained by RT-PCR and the molecular cloning technique. TheEGFRgene homology between reindeer and cattle, sheep, horse, human, whale, and wild boar respectively was 97%, 96%, 88%, 86%, 92% and 89% by the bioinformatics and Blast analysis. The homologies, all of them, were above 85%. The reindeerEGFRgene was more conserved in its evolution. In the construction of phylogenetic tree, the genetic relationship of reindeer EGFR gene with cattle was the closest, and with human was the furthest. The minimum free energy secondary structure of theEGFRgene sequence was predicted by the online analysis software.