不同無核葡萄品種花粉貯藏及其生活力的測定1)

張少偉 李桂榮 朱自果 孫振元

(中國林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所，北京，100091) (河南科技學(xué)院) (中國林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所)

不同無核葡萄品種花粉貯藏及其生活力的測定1)

張少偉 李桂榮 朱自果 孫振元

(中國林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所，北京，100091) (河南科技學(xué)院) (中國林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所)

以‘京豐無核’ ‘愛神玫瑰’ ‘楊格爾’ ‘奧迪亞無核’和‘奇妙無核’5個葡萄品種的花粉為試驗材料，撒播在10%蔗糖+10 mg·L-1硼酸+6 g·L-1瓊脂的培養(yǎng)基上進行離體培養(yǎng)，研究不同處理方法(液氮未處理、液氮處理)、不同溫度(25、0、-20、-40、-80 ℃)、不同貯藏時間(1、3、5 d)對5種葡萄花粉生活力的影響。結(jié)果表明：‘愛神玫瑰’的單花藥花粉量最多，達到(5 446±80)粒；‘京豐無核’的新鮮花粉生活力最高，為(68.19±2.98)%，‘奇妙無核’的新鮮花粉沒有萌發(fā)。液氮未處理和處理后觀察發(fā)現(xiàn)，液氮處理后花粉生活力遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于液氮未處理的，液氮未處理的同一品種不同處理花粉生活力對比發(fā)現(xiàn)，最適宜長期貯藏的溫度是-80 ℃，其次是-40 ℃，25、4、-20 ℃條件下貯藏花粉生活力降低較快。不同品種花粉貯藏后，‘京豐無核’花粉萌發(fā)率最高，為(55.87±1.14)%，較差的是‘楊格爾’，其花粉萌發(fā)率比‘京豐無核’花粉萌發(fā)率低17.84%，‘奇妙無核’沒有萌發(fā)，雜交授粉時，適宜的父本為‘京豐無核’‘愛神玫瑰’與‘奧迪亞無核’。

無核葡萄；花粉；貯藏；生活力；萌發(fā)率

雜交育種是無核葡萄選育新品種的主要方法之一[1]。生活力高的花粉是保證植物雜交育種成功的重要前提條件之一。因此，在進行無核葡萄雜交育種工作之前，要先掌握作為父本的特性，特別是花粉的生活力強弱，是選擇父本的條件之一[2-3]，花粉離體培養(yǎng)萌發(fā)法測定的花粉生活力數(shù)據(jù)科學(xué)可靠，測定結(jié)果與真實的花粉生活力接近，這已在許多植物花粉生活力研究中得到驗證，是目前雜交育種中花粉生活力測定的首選方法[4-7]。本試驗通過研究不同貯藏溫度和貯藏時間對不同無核葡萄品種花粉生活力的影響及液氮未處理和液氮處理條件貯藏下葡萄品種花粉生活力的對比，篩選出花粉生活力較高的葡萄品種，為無核葡萄雜交育種選擇生活力強的父本材料進行雜交、提高雜交授粉率提供一定的理論支持，對更好地利用這些無核葡萄資源進行生產(chǎn)具有指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

取自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹研究所葡萄種質(zhì)資源圃，分別為‘京豐無核’(Vitissp.‘Jingfeng Seedless’)、‘愛神玫瑰’(Vitissp.‘Eggplant’)、‘楊格爾’(Vitissp.‘Youngle’)、‘奧迪亞無核’(Vitissp.‘Otilia Seedless’)和‘奇妙無核’(Vitissp.‘Fantasy Seedless’)[3]。選擇生長健壯的植株，于10:00左右隨機采下10個發(fā)育正常的花序，分別放進自封袋中用冰袋保鮮直接帶回實驗室。之后用鑷子輕輕剝下花藥，放在墊有硫酸紙的培養(yǎng)皿中，及時剔除其中的雜質(zhì)和破裂的花藥壁，將培養(yǎng)皿放置在陰涼干燥處，花粉散出后，收集備用。

1.2 儀器設(shè)備和試驗工具

25 ℃的恒溫箱、移液槍、冰箱、電磁爐、電子天平、量缸、載玻片、自封袋、離心管、培養(yǎng)皿、冰袋、泡沫箱、凹玻片、玻璃棒、硫酸紙、鑷子、封口膜、標(biāo)簽等。Count star—自動細(xì)胞計數(shù)儀(上海睿鈺生物科技有限公司)；10×40 Nikon Ti-s熒光倒置顯微鏡(上海普赫光電科技有限公司)。

1.3 試驗方法

花粉量的測定：取每個品種新鮮花藥100粒，放入2 mL的離心管中，將離心管放進烘箱內(nèi)50 ℃進行散粉，待其散粉后滴入50 g·L-1的六偏磷酸鈉溶液至2 mL離心管，混合均勻。然后用1 μL的移液槍將花粉混合液滴入自動細(xì)胞計數(shù)儀上讀取花粉量，每個品種重復(fù)3次。

培養(yǎng)基的配置：按照10%蔗糖+10 mg·L-1硼酸+6 g·L-1瓊脂配制培養(yǎng)基，pH值為6.0，將配制好的培養(yǎng)基倒入干凈的凹玻片中，制作發(fā)芽床，待凝固后，用玻璃棒蘸取各葡萄品種的新鮮花粉，把花粉均勻地撒播到發(fā)芽床上，3個重復(fù)，將凹玻片放在墊有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中，使發(fā)芽床周圍濕度保持在90%以上，然后置于恒溫箱中25 ℃培養(yǎng)，4 h后觀察花粉萌發(fā)情況。

花粉處理：將干燥的不同葡萄品種花粉分別裝入2 mL離心管內(nèi)，用封口膜密封瓶口后放入裝有無水CaCl2的廣口瓶中。液氮未處理分別置于25、4、-20、-40、-80 ℃條件下貯藏；液氮處理分別用錫紙包裹著各葡萄品種花粉折疊嚴(yán)實后放入液氮中處理5 min，然后取出花粉分裝到2 mL的離心管中，分別置于4、-20、-40、-80 ℃條件下貯藏。各貯藏條件下的花粉分不同貯藏時間(1、3、5 d)取出，接種在發(fā)芽床(10%蔗糖+10 mg·L-1硼酸+6 g·L-1瓊脂)上進行離體培養(yǎng)，然后置于恒溫箱中25 ℃培養(yǎng)，4 h后觀察花粉的萌發(fā)情況。

1.4 數(shù)據(jù)分析

培養(yǎng)4 h后，在顯微鏡下觀察花粉萌發(fā)情況，以萌發(fā)花粉管長度超過花粉粒直徑的1/2為萌發(fā)花粉，觀察統(tǒng)計3個視野內(nèi)花粉萌發(fā)個數(shù)并拍照，花粉萌發(fā)率=(視野內(nèi)花粉萌發(fā)數(shù)/視野內(nèi)花粉總數(shù))×100%。采用Excel2003和DPS9.50進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同葡萄品種花粉量及新鮮花粉萌發(fā)率的比較

由表1可看出，不同葡萄品種花粉量不同，其中‘愛神玫瑰’花粉量最多，為(5 446±80)粒，其次為‘奧迪亞無核’，花粉量為(4 520±79)粒，‘奇妙無核’花粉量最少，僅為(2 895±33)粒，通過方差分析，‘愛神玫瑰’花粉量與‘奧迪亞無核’‘京豐無核’‘奇妙無核’‘楊格爾’的花粉量差異顯著(P<0.05)。

表1 不同葡萄品種花粉量及新鮮花粉萌發(fā)率的比較

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差；同列中不同小寫字母表示在0.05水平上差異顯著。

由表1還可以看出，不同葡萄品種新鮮花粉生活力差異明顯，測得‘京豐無核’的新鮮花粉生活力最高，為(68.19±2.98)%，其次為‘愛神玫瑰’，花粉生活力為(64.21±3.41)%，‘奇妙無核’花粉生活力最低，為0。‘京豐無核’與‘愛神玫瑰’花粉生活力差異不顯著(P>0.05)，與‘奧迪亞無核’‘楊格爾’和‘奇妙無核’差異顯著(P<0.05)。由圖1可以看出，‘京豐無核’花粉管伸長，花粉萌發(fā);‘奇妙無核’花粉未萌發(fā)。

2.2 同一品種不同處理方式花粉生活力的比較

由表2可以看出，同一品種不同貯藏方式處理后測定的花粉生活力差異顯著，液氮處理和未處理兩種方式同一溫度下貯藏1 d的花粉生活力差異明顯，液氮未處理的‘京豐無核’花粉在5個溫度處理下貯藏后，-80 ℃花粉生活力較高，達到(55.87±1.14)%，而液氮處理后花粉生活力最高的是貯藏在-40 ℃下，生活力為(29.11±0.45)%。其次是‘愛神玫瑰’，液氮未處理的‘愛神玫瑰’花粉在5個溫度處理下貯藏后，-80 ℃花粉生活力為(54.81±0.63)%，而液氮處理后花粉生活力最高的是貯藏在-20 ℃下，生活力為(28.35±1.43)%。液氮未處理的‘奧迪亞無核’花粉在5個溫度處理下貯藏后，-80 ℃花粉生活力為(53.94±1.25)%，而液氮處理后花粉生活力最高的是貯藏在-80 ℃下，生活力為(28.75±1.54)%。‘奇妙無核’花粉幾乎沒有萌發(fā)，最高的萌發(fā)率僅為(3.79±2.23)%。液氮處理后‘京豐無核’ ‘愛神玫瑰’ ‘奧迪亞無核’和‘楊格爾’花粉生活力均沒有液氮未處理的高，說明前期用液氮處理無核葡萄的花粉在一定程度上破壞了花粉的活力，液氮處理對于葡萄花粉貯藏是不利的。

a．萌發(fā)的‘京豐無核’花粉 b．未萌發(fā)的‘奇妙無核’花粉

圖1不同葡萄品種新鮮花粉的萌發(fā)

表2 同一品種不同處理方式花粉生活力的比較

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差；同列不同小寫字母表示在0.05水平上差異顯著。

對比液氮未處理的5個溫度發(fā)現(xiàn)(表2)，貯藏1 d后，測定葡萄花粉生活力，均在-80 ℃溫度下花粉生活力較高，‘京豐無核’-80 ℃花粉生活力與-40 ℃花粉生活力差異顯著(P<0.05)，和其他溫度處理相比差異也顯著(P<0.05)；‘愛神玫瑰’-80 ℃花粉生活力與-40 ℃花粉生活力差異不顯著(P>0.05)，和其他溫度處理相比差異顯著(P<0.05)；‘奧迪亞無核’-80 ℃花粉生活力與-40 ℃花粉生活力差異不顯著(P>0.05)，和其他溫度處理相比差異顯著(P<0.05)；‘楊格爾’-80 ℃花粉生活力與-40 ℃花粉生活力差異不顯著(P>0.05)，和其他溫度處理相比差異顯著(P<0.05)，因此，貯藏1 d測定無核葡萄的花粉生活力發(fā)現(xiàn)較適宜的貯藏溫度是-80 ℃，生活力較高，其次是-40 ℃。常溫貯藏花粉和冷藏處理花粉1 d后生活力均較低。

由表2可以看出，液氮處理和未處理兩種方式同一溫度下貯藏3 d的花粉生活力差異明顯，液氮未處理的‘京豐無核’花粉在5個溫度處理下貯藏后，-80 ℃花粉生活力較高，達到(43.94±1.87)%；而液氮處理后，貯藏在-20 ℃下的花粉生活力最高，為(28.78±1.62)%。其次是‘愛神玫瑰’，液氮未處理的‘愛神玫瑰’花粉在5個溫度處理下貯藏后，-80 ℃花粉生活力為(49.12±1.68)%；而液氮處理后貯藏在-80 ℃下的花粉生活力最高，為(26.75±2.12)%。液氮未處理的‘奧迪亞無核’花粉在5個溫度處理下貯藏后，-80 ℃花粉生活力為(45.51±2.81)%；而液氮處理后貯藏在-80 ℃下的花粉生活力最高，為(26.24±1.21)%?！婷顭o核’花粉幾乎沒有萌發(fā)，最高的萌發(fā)率僅為(2.95±1.12)%。液氮處理后‘京豐無核’ ‘愛神玫瑰’ ‘奧迪亞無核’和‘楊格爾’花粉生活力均沒有液氮未處理的高，貯藏3 d試驗結(jié)果也同樣說明，用液氮處理無核葡萄的花粉對于花粉貯藏是不利的。

對比液氮未處理的5個溫度發(fā)現(xiàn)，貯藏3 d后測定無核葡萄花粉生活力，均在-80 ℃溫度下花粉生活力較高，‘京豐無核’-80 ℃花粉生活力與-40 ℃花粉生活力差異不顯著(P>0.05)，和其他溫度處理相比差異顯著(P<0.05)；‘愛神玫瑰’-80 ℃花粉生活力與-40 ℃花粉生活力差異顯著(P<0.05)，和其他溫度處理相比差異也顯著(P<0.05)；‘奧迪亞無核’-80 ℃花粉生活力 與-40 ℃花粉生活力差異不顯著(P>0.05)，和其他溫度處理相比差異顯著(P<0.05)；‘楊格爾’-80 ℃花粉生活力與-40 ℃花粉生活力差異不顯著(P>0.05)，和其他溫度處理相比差異顯著(P<0.05)，因此，貯藏3 d測定花粉生活力結(jié)果同樣表明，無核葡萄較適宜的貯藏溫度是-80 ℃，其次是-40 ℃。

由表2可以看出，液氮處理和未處理兩種方式同一溫度下貯藏5 d的花粉生活力差異明顯，液氮未處理的‘京豐無核’花粉在貯藏-80 ℃下花粉生活力較高，達到(38.47±2.07)%，而液氮處理后在貯藏-40 ℃下的花粉生活力最高，為(20.52±0.94)%。其次是‘愛神玫瑰’，液氮未處理的‘愛神玫瑰’花粉在貯藏-80 ℃下的花粉生活力為(42.80±1.43)%，而液氮處理后貯藏在-80 ℃下的花粉生活力最高，為(22.35±2.75)%。液氮未處理的‘奧迪亞無核’花粉在貯藏-80 ℃下的花粉生活力為(43.05±2.02)%，而液氮處理后貯藏在-80 ℃下的花粉生活力最高，為(23.53±0.52)%?！婷顭o核’花粉幾乎沒有萌發(fā)，最高的萌發(fā)率僅為(2.01±1.30)%。液氮處理后‘京豐無核’ ‘愛神玫瑰’ ‘奧迪亞無核’和‘楊格爾’花粉生活力均沒有液氮未處理的高，貯藏5 d的試驗結(jié)果也同樣說明，用液氮處理無核葡萄的花粉對于花粉貯藏是不利的。

對比液氮未處理的5個溫度發(fā)現(xiàn)，貯藏5 d后測定無核葡萄花粉生活力，均在-80 ℃溫度下花粉生活力較高，‘京豐無核’-80 ℃花粉生活力與其他溫度處理相比差異均顯著(P<0.05)；‘愛神玫瑰’-80 ℃花粉生活力與其他溫度處理相比差異均顯著(P<0.05)；‘奧迪亞無核’-80 ℃花粉生活力與其他溫度處理相比差異均顯著(P<0.05)；‘楊格爾’-80 ℃花粉生活力與其他溫度處理相比差異均顯著(P<0.05)，因此，貯藏5 d測定花粉生活力結(jié)果表明，無核葡萄較適宜的貯藏溫度是-80 ℃。其他溫度貯藏花粉生活力隨著貯藏時間的延長，生活力逐漸下降，而-80 ℃下貯藏的花粉生活力3 d和5 d的差異不顯著，說明-80 ℃下貯藏葡萄花粉，可以保持其生活力，對于長時間貯藏葡萄花粉是個適宜的溫度，對于雜交授粉采集花粉貯存、異地授粉花粉的收集貯存、不同花期父母本雜交授粉花粉的長期貯藏利用及花粉的研究等方面具有一定的實用指導(dǎo)價值。

通過前面的對比研究，液氮未處理的花粉生活力普遍高于液氮處理的，因此，選擇液氮處理方式下花粉生活力，對比不同品種花粉生活力的強弱，選擇適宜的無核品種作為無核葡萄育種父本親本材料。

另外，通過表2還可以看出，不同溫度處理貯藏不同時間后，‘京豐無核’‘愛神玫瑰’‘奧迪亞無核’花粉生活力均較高，最高的是‘京豐無核’，花粉生活力達到了(55.87±1.14)%，‘楊格爾’生活力較差，同一處理下與‘京豐無核’相比，花粉萌發(fā)率相差最高的達到17.84%，生活力最差的是‘奇妙無核’，幾乎沒有萌發(fā)。因此，選擇無核葡萄作為父本親本時，優(yōu)先考慮‘京豐無核’‘愛神玫瑰’‘奧迪亞無核’。

3 結(jié)論與討論

無核葡萄新品種的獲得主要是通過雜交授粉育種技術(shù)獲得，選擇無核葡萄作為父本進行雜交授粉，可以提高無核后代獲得率，選擇適宜的親本和確定雜交組合，是雜交育種研究工作中非常重要的一環(huán)。作為父本親本的選擇，需要了解其花粉量和花粉生活力的強弱，花粉量大和花粉生活力強的父本是保證授粉的一個重要條件，研究不同無核葡萄花粉的特性，對于父本的選擇具有指導(dǎo)意義[4-5]。

很多人在花粉特性方面開展的研究側(cè)重于花粉形態(tài)的研究[8-10]，對于花粉活力有一定的參考價值，如顯微觀察的花粉形態(tài)干癟變形，說明生活力降低或者失活。楊曉平等[11]研究認(rèn)為，授粉品種花粉數(shù)量的多少和花粉質(zhì)量的好壞直接影響雜交的座果率和產(chǎn)量，采用血球計數(shù)板法測定了23個砂梨栽培品種的花粉量，發(fā)現(xiàn)有些品種花藥里就沒有花粉，直接判定其不能作為雜交授粉的父本，是雜交育種工作的前提，本試驗測得‘奇妙無核’花粉量最少，結(jié)合后期花粉生活力的測定發(fā)現(xiàn)其生活力也最差，因此，測定父本花粉量也可以作為了解其生活力的一個參考指標(biāo)。

而葡萄雜交授粉前，如果了解到雙親的花期早晚相差很遠(yuǎn)，可以貯藏花粉調(diào)節(jié)花期，而貯藏后的花粉必須保證其生活力，才能保證后期雜交授粉工作的成功，所以適宜的貯藏條件是保證花粉生活力強弱的首要保證，說明花粉生活力的強弱，一方面受到遺傳因素決定，另外一方面受到環(huán)境因素的影響，干燥、低溫可以較好地保持花粉生活力，適宜的條件才能保證長時間的貯藏花粉，以供不同雜交組合和不同時期的雜交育種[12-13]。杜克兵等[14]將貯藏的楊樹花粉應(yīng)用于隔年雜交授粉，結(jié)果表明，花粉貯藏可以打破雜交親本的時間和空間隔離，擴大雜交育種的范圍。本試驗主要研究了無核葡萄花粉不同貯藏條件后生活力的變化，選用的是離體萌發(fā)法測定其生活力，本試驗是在研究‘火焰無核’葡萄花粉萌發(fā)和花粉管生長的作用中，獲得適宜‘火焰無核’葡萄花粉離體萌發(fā)的培養(yǎng)基為蔗糖250 g·L-1+硼酸0.08 g·L-1+硝酸鈣0.05 g·L-1，萌發(fā)率為22.22%，萌發(fā)率偏低[15]，不斷通過預(yù)試驗獲得了無核葡萄離體培養(yǎng)效果較適宜的培養(yǎng)基(10%蔗糖+10 mg·L-1硼酸+6 g·L-1瓊脂)，培養(yǎng)獲得的葡萄新鮮花粉生活力最高的達到(68.19±2.98)%。劉佳等[16]在研究‘巨玫瑰’花粉生活力時，對花粉3個發(fā)育階段、2種干燥方式的生活力進行測定，側(cè)重于材料的選擇處理，而本試驗選擇的是不同品種成熟的花粉，不同的貯藏方式，研究其花粉生活力，在花粉發(fā)育的不同階段沒有開展相關(guān)研究，對其貯藏前采用液氮進行了處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，液氮未處理的效果較佳，液氮處理花粉對其生活力的影響原因還需進一步開展相關(guān)研究。本試驗研究發(fā)現(xiàn)，液氮未處理貯藏5個品種花粉生活力差異較大，較適宜做父本的材料為‘京豐無核’ ‘愛神玫瑰’‘奧迪亞無核’。Mustafa et al.[17]研究了‘burdur dimditi’等7個葡萄品種的花粉量、生活力及萌發(fā)率，獲得了花粉量最高的品種為‘burdur dimditi’，為9 000粒，離體培養(yǎng)花粉較適宜的培養(yǎng)基為15%蔗糖+10 mg·L-1硼酸+10 g·L-1瓊脂，不同品種花粉生活力不同(31.5%～68.8%)，無核葡萄育種工作中雜交授粉是一項長期而艱難的工作，開展大量的雜交授粉，獲得盡可能多的雜交果穗，工作量大，操作困難，一般雜交座果率低，葡萄育種因此受到限制。選擇合適的母本和父本，確定最佳雜交組合，可以提高無核葡萄雜交組合的座果率，也是獲得大量雜交后代的基礎(chǔ)，因此,利用離體培養(yǎng)花粉技術(shù)及田間相應(yīng)技術(shù)，如何應(yīng)用輔助提高花粉在柱頭上的萌發(fā)率，提高田間雜交授粉率有待于進一步研究[4-5，18-19]。

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PollenStorageConditionandViabilityofDifferentSeedlessGrapeCultivars//

Zhang Shaowei
(Research Institute of Forestry, CAF, Beijing 100091, P. R. China);
Li Guirong, Zhu Ziguo
(Henan Institute of Science and Technology);
Sun Zhenyuan
(Research Institute of Forestry, CAF)//Journal of Northeast Forestry University，2017,45(9)：49-53.

Seedless grapes; Pollen; Storage condition; Viability; Germination rate

S663.1；Q943.1

1)國家自然科學(xué)基金項目(U1404321)、河南省科技計劃項目(152300410094)、河南省高等學(xué)校重點科研項目計劃(16A210003)。

張少偉，男，1981年10月生，中國林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所，博士研究生；現(xiàn)工作于河南農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院園藝園林學(xué)院，講師。E-mail:hncazsw@126.com。

孫振元，中國林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所，研究員。E-mail:sunzy@263.net。

2017年6月14日。

責(zé)任編輯：任 俐。

With the pollen of five grapes of Jingfeng Seedless, Eggplant, Youngle, Otilia Seedless and Fantasy Seedless, and the medium of 10% sucrose+10 mg·L-1boric acid+6 g·L-1agar, we studied the effects of different treatment conditions (Liquid nitrogen treatment， or not), different temperature (25 ℃, 0 ℃, -20 ℃, -40 ℃, -80 ℃) and different storage time (1, 3, 5 d) on the pollen viability. The pollen amount of the single anther of Eggplant was 5 446±80, it was the largest number. The highest fresh pollen viability was Jingfeng Seedless of (68.19±2.98)%. The fresh pollen viability of Fantasy Seedless was the lowest, it could not germinate. Before all these pollens were storied, they were treated by liquid nitrogen or not, the effect of no liquid nitrogen was better. Under the condition of no liquid nitrogen, -80 ℃ was the most appropriate storage temperature. The better appropriate storage temperature was -40 ℃. A large difference was among different grape cultivars. Jingfeng Seedless pollen germination rate was the largest of (55.87±1.14)%, and Youngle pollen germination rate was the smallest. These suitable male parents were Jingfeng Seedless, Eggplant and Otilia Seedless.