改良穿刺法建立大鼠無血預(yù)充非停跳體外循環(huán)后認(rèn)知功能障礙模型

段銘杰，孫瑩杰，鄭 翔，李思沁，屈鵬霞

·基礎(chǔ)研究·

改良穿刺法建立大鼠無血預(yù)充非停跳體外循環(huán)后認(rèn)知功能障礙模型

段銘杰，孫瑩杰，鄭 翔，李思沁，屈鵬霞

目的尋找建立大鼠無血預(yù)充非停跳體外循環(huán)術(shù)后認(rèn)知功能障礙模型的簡便方法。方法SD大鼠 20只，0.2%戊巴比妥鈉溶液腹腔注射麻醉。經(jīng)由鎖骨上入路右上腔靜脈穿刺引流，尾動脈穿刺灌注，隱動脈穿刺監(jiān)測血壓。術(shù)中持續(xù)監(jiān)測心率、血氧飽和度及肛溫。轉(zhuǎn)流流量維持在100 ml/(min·kg)，轉(zhuǎn)流中根據(jù)血?dú)饨Y(jié)果適當(dāng)補(bǔ)充葡萄糖酸鈣、潘南金(門冬氨酸鉀鎂注射液)和碳酸氫鈉調(diào)整血?dú)庵笜?biāo)，體外循環(huán)轉(zhuǎn)流60 min。結(jié)果16只大鼠成功存活，存活大鼠術(shù)后一天均可完成水迷宮訓(xùn)練。結(jié)論此種改良穿刺方法建立的體外循環(huán)模型，創(chuàng)傷小、簡便易行，可用于術(shù)后行為學(xué)檢測。

靜脈穿刺；認(rèn)知功能障礙；體外循環(huán)；水迷宮

研究表明體外循環(huán)(cardiopulmonary bypass，CPB)是誘發(fā)術(shù)后認(rèn)知功能障礙(post operative cognitive dysfunction，POCD)的獨(dú)立危險因素，其發(fā)生率可高達(dá)40%～60%[1-2]。闡明CPB與POCD發(fā)生機(jī)制的首要任務(wù)是要建立合適的動物模型。本課題組前期建立的大鼠CPB模型需開胸、心臟停跳等復(fù)雜手術(shù)操作，創(chuàng)傷大、術(shù)后恢復(fù)時間長，術(shù)后實(shí)施行為學(xué)檢測較困難，無法判斷CPB后是否發(fā)生POCD[3]。而如豬、猴、羊等大型動物實(shí)驗成本高，實(shí)驗需要的器材昂貴，為尋求簡單易行的CPB模型，本實(shí)驗在以往經(jīng)驗的基礎(chǔ)上對模型進(jìn)行改進(jìn)，為CPB及其術(shù)后POCD等機(jī)制的研究提供可靠實(shí)驗平臺。

1 材料與方法

1.1動物與設(shè)備 選取雄性健康成年清潔級SD大鼠20只，體重400～500 g, 由原沈陽軍區(qū)總醫(yī)院動物實(shí)驗科提供。小動物呼吸機(jī)(江西省特力麻醉呼吸設(shè)備公司, TKR-200C型), 恒流蠕動泵(保定蘭格恒流泵有限公司, BT00 -300M型), 大鼠專用膜式氧合器(廣東科威醫(yī)療器械有限公司)，多功能監(jiān)測儀(日本光電公司)，一次性靜脈套管針(美國BD公司)，水迷宮(欣軟公司)，全自動溫血儀(美國BIGGER公司)。

1.2實(shí)驗方法 20只大鼠建立CPB模型，其中2只在建立CPB模型前進(jìn)行水迷宮訓(xùn)練。

1.2.1水迷宮訓(xùn)練 選取兩只大鼠標(biāo)號1、2，每日上午9點(diǎn)進(jìn)行水迷宮訓(xùn)練。首次訓(xùn)練將大鼠置于水迷宮中自由游泳2 min，使其充分探索環(huán)境，休息2 min后，大鼠面對池壁隨機(jī)放入水迷宮四個象限，限時1 min尋找平臺，找到平臺則在平臺上休息15 s后放入下個象限，未找到平臺則記潛伏期60 s，并置于平臺休息15 s后放入下一個訓(xùn)練象限。每天訓(xùn)練4次，共訓(xùn)練4天，記錄大鼠運(yùn)動軌跡和運(yùn)動數(shù)據(jù)。待大鼠休息1 d后，建立CPB模型。

1.2.2麻醉與穿刺置管 0.2%戊巴比妥鈉溶液50 mg/kg、阿托品30 μg/ kg腹腔注射，待大鼠翻正反射消失后固定、備皮，監(jiān)測血氧飽和度、心電及肛溫。 16 G套管針套管透光法行氣管插管, 控制呼吸潮氣量10 ml/kg ，頻率50次/min，維持呼氣末二氧化碳35～45 mm Hg。消毒，鋪無菌單。選取右鎖骨內(nèi)1/3向頭側(cè)0.5 cm為進(jìn)針點(diǎn)，1%利多卡因局麻，采用幼兒深靜脈穿刺針、進(jìn)針方向指向劍突，見到回血后導(dǎo)絲倒置置入，擴(kuò)皮后置入帶側(cè)孔18 G套管針。建立靜脈通路后給予舒芬太尼3 μg/kg、羅庫溴銨1.2 mg/kg。術(shù)中根據(jù)需要給予維持劑量的舒芬太尼1 μg/kg、羅庫溴銨0.4 mg/kg。根據(jù)需要微量泵輸注琥珀酰明膠(血定安)1 ml/h，備靜脈引流用。游離尾動脈遠(yuǎn)端結(jié)扎，向近端穿刺置22 G套管針備用灌注，左下肢游離隱動脈遠(yuǎn)端結(jié)扎，向近端穿刺置24 G套管針監(jiān)測有創(chuàng)血壓。

1.2.3CPB 預(yù)充液為20%甘露醇1 ml、5%碳酸氫鈉1 ml、肝素鈉100 U/kg，乳酸鈉林格注射液與血定安1∶1配置至15 ml。儲血槽為5 ml注射器并低于大鼠心臟平面30 cm。連接膜肺、滾動泵，預(yù)充轉(zhuǎn)機(jī)排氣，防止氣泡灌入大鼠體內(nèi)。靜脈注射肝素 400 U/kg，調(diào)整激活凝血時間(ACT)>480 s。膜肺動脈出血口連接尾動脈，儲血槽接收頸靜脈引流血液。轉(zhuǎn)流開始逐漸加大引流量至 100 ml/(min·kg)，轉(zhuǎn)流中根據(jù)血?dú)饨Y(jié)果適當(dāng)補(bǔ)充葡萄糖酸鈣、潘南金(門冬氨酸鉀鎂注射液)和碳酸氫鈉調(diào)整血?dú)庵笜?biāo)，維持K+5.5～6.5 mmol/L、Ca2+1.5～2.5 mmol/L、pH 7.3～7.4、紅細(xì)胞比容(Hct)> 0.25。去甲腎上腺素泵注維持平均動脈壓(MAP) 60～90 mm Hg。CPB 60 min后停機(jī)，根據(jù)出入量回輸CPB血液以補(bǔ)足循環(huán)容量后，改為1 ml/h持續(xù)輸注。按1∶1給予魚精蛋白對抗肝素。根據(jù)大鼠血壓調(diào)整血管活性藥，待大鼠體征平穩(wěn)后停藥、拔出穿刺針套管、縫合，頸靜脈穿刺處充分按壓止血。CPB過程用全自動溫血儀血液加溫、CPB開始后至手術(shù)結(jié)束應(yīng)用加熱燈為大鼠保溫，手術(shù)過程維持大鼠肛溫在35.5～36.5℃之間。

1.2.4術(shù)后 待大鼠自主呼吸恢復(fù)，間斷脫機(jī)觀察其呼吸情況，吸氧時血氧飽和度可維持在99%～100%并有體動征兆后，將大鼠解綁放入動物飼養(yǎng)箱復(fù)溫，保留氧飽和度監(jiān)測，繼續(xù)觀察。間隔5～10 min或出現(xiàn)氧飽和度降低情況時，可適度牽拉大鼠四肢以刺激大鼠正常呼吸。術(shù)后2～3 h，麻醉藥殘余作用減弱并消失，大鼠呼吸趨于穩(wěn)定后拔除氣管導(dǎo)管。繼續(xù)觀察至大鼠自主活動后，自由食水。未進(jìn)行水迷宮訓(xùn)練大鼠和1號大鼠術(shù)后1 d，2號大鼠術(shù)后7 d行水迷宮檢測。需要注意的是，CPB術(shù)后脫離呼吸機(jī)至拔除氣管導(dǎo)管前，偶見大鼠因手術(shù)、插管等刺激生成痰液， 在氣管導(dǎo)管內(nèi)形成痰栓將氣管導(dǎo)管堵塞，用套管針針心可將痰栓吸出。

1.3數(shù)據(jù)采集 大鼠血壓、心率、血氧飽和度和肛溫每5 min記錄一次。分別在隱動脈穿刺后、CPB開始后5 min、30 min，CPB結(jié)束時和結(jié)束后30 min行血?dú)夥治?，記錄CPB后水迷宮測試結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1大鼠CPB后生命體征的變化 20只大鼠術(shù)后成功存活16只，存活率80%。與CPB前比較，CPB 30 min和停CPB時點(diǎn)的MAP、心率(HR)、氧分壓(PO2)明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；Hct在CPB 5 min、CPB 30 min和停CPB三個時點(diǎn)均明顯降低(P<0.05)，見表1。存活大鼠中隨機(jī)取兩只1 d后處死，解剖后可見靜脈穿刺處按壓止血效果確切，詳見圖1a-c所示。

2.2大鼠CPB后水迷宮檢測結(jié)果 14只未訓(xùn)練大鼠CPB后1 d均可在水迷宮中游泳1 min，休息15 s，完成循環(huán)四次的強(qiáng)度訓(xùn)練，運(yùn)動軌跡見圖2a-d。1號、2號大鼠術(shù)前可迅速找到平臺位置，訓(xùn)練軌跡見圖3。1號大鼠CPB術(shù)后1 d和2號大鼠術(shù)后7 d均可找到平臺，但1號鼠術(shù)后1 d總時間、平均速度、爬上物體時間較術(shù)前均延長，四個象限平均速度降低明顯。與1號大鼠術(shù)后1 d相比，2號大鼠術(shù)后7 d的總時間、爬上物體時間和總路程明顯延長，而平均速度有所提高，每個象限平均速度的降低程度減少，運(yùn)動軌跡見圖4，運(yùn)動數(shù)據(jù)見表2。

表1 CPB前后生命體征及血?dú)夥治龅淖兓?/p>

注：與CPB前比較，*P<0.05；PCO2:二氧化碳分壓；TEM:肛溫。

注:1a：皮下可見穿刺出血點(diǎn)，周圍組織無血染；1b：剝離淺筋膜及淺層肌肉，可見穿刺出血點(diǎn)，周圍無血染；1c：剝離深層肌肉，可見陳舊出血。圖1 CPB后靜脈穿刺的解剖示意圖

大鼠信息總路程(mm)總時間(s)平均速度(mm/s)靜止時間(s)潛伏期(s)接近時間(s)爬上物體時間(s)1號術(shù)前1443.714.95291.780.004.953.090.86990.083.45286.900.253.453.121.382219.878.03276.380.008.035.311.171053.024.27246.550.254.273.122.031號術(shù)后1d2766.485.22230.490.005.224.051.083062.4412.01255.030.2513.957.801.851229.435.13239.800.2511.134.072.122077.949.96208.711.009.967.142.842號術(shù)后7d6350.3319.37327.780.0019.379.321.068869.5429.41301.570.0033.0516.631.818302.8133.93244.710.2535.4915.363.154466.9414.91299.650.0021.3813.773.20

注:紅色為起點(diǎn)，藍(lán)色為終點(diǎn)，綠色實(shí)線為運(yùn)動軌跡，黃色圓形區(qū)域為平臺圖2 CPB前未訓(xùn)練大鼠術(shù)后1 d水迷宮的運(yùn)動軌跡

圖3 1、2號大鼠術(shù)前水迷宮運(yùn)動軌跡

注:4a、4b、4c、4d為1號大鼠術(shù)后1 d運(yùn)動軌跡，4e、4f、4g、4h為2號大鼠術(shù)后7 d運(yùn)動軌跡。圖4 術(shù)后1 d和7 d水迷宮測試運(yùn)動軌跡

3 討 論

良好的CPB動物模型是模擬、研究臨床CPB過程必不可少的工具。灌注和引流血液通路是建立CPB動物模型所必須的步驟。本實(shí)驗采用的是右側(cè)鎖骨上入路，盲探右頸靜脈穿刺置管的方法，可避開大鼠右頸靜脈跨過鎖骨和繞行第一肋的兩次轉(zhuǎn)彎，最大程度簡化了手術(shù)操作、降低手術(shù)難度。由于大鼠分別有左右兩條上腔靜脈匯入右心房，不同于人體解剖結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，本方法不需要結(jié)扎右側(cè)頸靜脈，故不會引起對側(cè)腔靜脈血液回流的代償，降低血供和回流障礙而對顱腦產(chǎn)生影響，這種改良穿刺建立的模型對中樞神經(jīng)系統(tǒng)尤其是腦功能的研究有重要意義。此種置管引流方法可減少頸部肌肉損傷，既保護(hù)了大鼠術(shù)后運(yùn)動能力，也減輕了由于手術(shù)刺激引起機(jī)體反應(yīng)，為單純進(jìn)行CPB研究減少了混雜因素。

從術(shù)后康復(fù)角度來說，本實(shí)驗建立的CPB模型沒有選擇開胸的方式，大鼠術(shù)后能夠迅速恢復(fù)。本實(shí)驗選擇股動脈向下延續(xù)分支的隱動脈作為有創(chuàng)動脈壓監(jiān)測血管，可大大減少下肢缺血區(qū)域，同樣提高了大鼠術(shù)后恢復(fù)速度。尾動脈較隱動脈粗大，可置入22 G套管針，作為灌注血管可獲得更大灌注速度。在穿刺操作時，套管針進(jìn)入尾動脈非暴露段后推送套管時的阻尼感可以幫助判斷套管是否在動脈內(nèi)。

本實(shí)驗通過上述改良穿刺法，成功建立了大鼠CPB模型，存活率80%。CPB期間大鼠血壓、平均動脈壓、心率、動脈氧分壓明顯降低，通過調(diào)整血管活性藥、引流量及轉(zhuǎn)流速度將以上指標(biāo)維持在大鼠可以耐受范圍。術(shù)后30 min，大鼠血流動力學(xué)指標(biāo)較體外循環(huán)結(jié)束時明顯好轉(zhuǎn)。Hct經(jīng)過預(yù)充液稀釋明顯降低，體外循環(huán)時繼續(xù)補(bǔ)充離子和液體使Hct在CPB結(jié)束時降到最低約30%左右，術(shù)后30 min通過排尿和回輸自體血，使得Hct有所回升。

大鼠血容量為70 ml/kg，由于體重較小，預(yù)充液對大鼠血液直接稀釋作用在轉(zhuǎn)流開始便可體現(xiàn)，因此，減少整個手術(shù)過程失血和降低預(yù)充液的稀釋作用對大鼠體液系統(tǒng)的影響成為模型建立成功的關(guān)鍵。將液體管道用醫(yī)用延長管和輸血器進(jìn)行改進(jìn)，使管道和膜肺中的預(yù)充液在10～11 ml之間，以求預(yù)充液最小用量。配置15 ml剩余的預(yù)充液可以在CPB過程中適當(dāng)補(bǔ)液用。成年大鼠平均心排血量為160 ～ 180 m l /(kg·min)[3],以往建立大鼠CPB模型的文獻(xiàn)報道中[4-7]，CPB過程中對于引流和灌注速度選擇也不盡相同，因此，本實(shí)驗選擇將引流灌注量保持在100 ml/(min·kg)，并根據(jù)大鼠血壓、血氧飽和度和血?dú)庵笜?biāo)適當(dāng)調(diào)節(jié)。大鼠呼吸頻率和心率較快，體溫、血壓和血?dú)馍碇笜?biāo)與人類似[8]，在CPB過程中，K+、Ca2+等離子根據(jù)血?dú)庵笜?biāo)調(diào)節(jié)在正常范圍內(nèi)。手術(shù)過程中通過對氣體、血管活性藥物、液體等方面細(xì)致嚴(yán)格計算和輸入才能使大鼠得以良好存活。

本實(shí)驗共死亡大鼠4只，其中2只在轉(zhuǎn)流開始后幾分鐘內(nèi)引流量驟減，血壓下降，隨后死亡。將其解剖后發(fā)現(xiàn)導(dǎo)管尖端穿破心房壁導(dǎo)致心包充血壓塞，致大鼠死亡。為防止這種事故發(fā)生，在置入導(dǎo)絲、導(dǎo)管或調(diào)整導(dǎo)管位置時盡可能輕柔，耐心體會導(dǎo)絲和導(dǎo)管在血管中移動的感覺，遇到阻力不可強(qiáng)行推進(jìn)，適當(dāng)退出導(dǎo)絲或?qū)Ч?，調(diào)整大鼠右上肢位置進(jìn)行輔助。另外兩只由于頸靜脈穿刺時沒能準(zhǔn)確刺入血管，調(diào)整時刺破胸膜，可有明顯突破感后回抽見大量氣體，穿刺置管失敗后解剖發(fā)現(xiàn)大鼠血胸形成。熟悉解剖結(jié)構(gòu)，謹(jǐn)慎操作、穿刺熟練的情況下，可以減少這種情況發(fā)生。且靜脈穿刺創(chuàng)傷小，免去了切皮、游離靜脈、縫合等繁瑣的手術(shù)操作步驟，縮短了手術(shù)時間，方便可行。

為檢驗這種方法建立的大鼠CPB模型是否適合術(shù)后行為學(xué)檢測，分別在術(shù)前和術(shù)后1 d、7 d進(jìn)行水迷宮訓(xùn)練測試。術(shù)前未經(jīng)水迷宮訓(xùn)練12只存活大鼠，因?qū)λ詫m環(huán)境陌生，可以認(rèn)為首次訓(xùn)練強(qiáng)度最大，大鼠術(shù)后1 d全部完成訓(xùn)練。因此這種改良穿刺方法建立的大鼠CPB模型，在大鼠CPB后檢測動物行為學(xué)改變是可行的。術(shù)前進(jìn)行水迷宮訓(xùn)練的兩只大鼠也分別在1 d、7 d完成水迷宮檢測。結(jié)果顯示，1號鼠術(shù)后1 d總時間、平均速度、爬上物體時間較術(shù)前延長，四個象限平均速度降低明顯，1號大鼠較2號大鼠游泳距離短，對逃生平臺定位更準(zhǔn)確。提示CPB對大鼠認(rèn)知功能可能產(chǎn)生影響，但是，由于樣本數(shù)目過少，兩只大鼠運(yùn)動數(shù)據(jù)無法做統(tǒng)計學(xué)分析，因此尚不能準(zhǔn)確判斷兩只大鼠是否出現(xiàn)POCD，以及造成兩只大鼠術(shù)前、術(shù)后和兩只大鼠之間差異的原因。

總之，實(shí)驗研究目的不同，對模型有不同要求，大鼠CPB模型建立方法有很多種[9-10]。本實(shí)驗選擇大鼠為實(shí)驗動物，品系純，個體差異小，雖然手術(shù)操作要求高，但大鼠比大型動物實(shí)驗成本低、操作方便。此種改良穿刺方法建立的CPB模型，創(chuàng)傷小，可縮短手術(shù)操作時間、降低手術(shù)難度，簡便易行，為研究CPB后POCD機(jī)制研究提供良好的實(shí)驗平臺。

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Establishmentofrats'cardiopulmonarybypassPOCDmodelbymelioratedpuncturemethod

Duan Ming-jie, Sun Ying-jie, Zheng Xiang, Li Si-qin, Qu Peng-xia

DepartmentofAnaesthesiology,GeneralHospitalofShenyangMilitaryRegion,Shenyang110016,China

SunYing-jie,Email:sunyingjie9@hotmail.com

ObjectiveTo explore a convenient method of cardiopulmonary bypass POCD model in rats.MethodsTwenty Sprague Dawley rats were anesthetized with Pelltobarbitalum Natricum i.p. Right upper vena cava was punctured for the drainage of blood and caudal artery for perfusion. Heart rate, anal temperature and blood oxygen saturation were monitored. Meanwhile, the blood gas indexes were measured and adjusted during the operation. The flow of CPB was maintained 100 ml/(min·kg)and time interval of CPB lasted for 60 mins.Results16 models were established successfully and all of which were able to complete the water maze training the day after operation.ConclusionThe CPB model established by the improved puncture method can shorten the operation time and reduce the difficulty of operation with more convenience and less trauma.

Vein puncture; Pocd; Cardiopulmonary bypass; Water maze

2017-03-09)

2017-05-05)

10.13498/j.cnki.chin.j.ecc.2017.03.14

國家自然科學(xué)基金資助項目(81471121)

10016 沈陽，原沈陽軍區(qū)總醫(yī)院麻醉科[段銘杰(研究生)、孫瑩杰、鄭翔(研究生)、李思沁(研究生)、曲鵬霞(研究生)]；250014 濟(jì)南，山東省千佛山醫(yī)院(段銘杰)

孫瑩杰，Email：sunyingjie9@hotmail.com