電針對慢性束縛應激抑郁模型大鼠不同時段血清ACTH、CORT表達的影響

梁星辰 孫 嵐 王 瑜 姜會梨 李 晶 楊昕婧 趙冰驄 俞秋云 李 想 馮世醒 盧 峻 圖 婭

(1 北京中醫(yī)藥大學針灸推拿學院,北京，100029; 2 北京大學心理與認知科學學院,北京，100871)

電針對慢性束縛應激抑郁模型大鼠不同時段血清ACTH、CORT表達的影響

梁星辰1孫 嵐2王 瑜1姜會梨1李 晶1楊昕婧1趙冰驄1俞秋云1李 想1馮世醒1盧 峻1圖 婭1

(1 北京中醫(yī)藥大學針灸推拿學院,北京，100029; 2 北京大學心理與認知科學學院,北京，100871)

目的:觀察電針對慢性束縛應激(CRS)抑郁模型大鼠干預期及恢復期血清促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)和腎上腺皮質(zhì)酮(CORT)表達的影響,探究電針抗抑郁效應及其可能機制。方法:將60只5周齡SD大鼠平均隨機分為對照組、模型組和電針組。除對照組外,其余大鼠均采用慢性束縛應激結(jié)合孤養(yǎng)處理;電針組選取“百會”“印堂”穴在每日應激之前1 h進行電針干預20 min,1次/d,共28 d。在實驗day7、day28、day35(末次干預結(jié)束后第7天)采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)分別檢測3組大鼠血清ACTH與CORT激素表達水平。結(jié)果:ELISA結(jié)果顯示,實驗day7,3組之間血清ACTH和CORT表達水平差異無統(tǒng)計學意義。與對照組比較,模型組血清ACTH及CORT表達在實驗day28和day35顯著增加(P<0.01;P<0.01;P<0.01;P<0.01);與模型組比較,電針組血清ACTH及CORT表達在實驗day28和day35顯著降低(P<0.05;P<0.05;P<0.01;P<0.01),電針對慢性束縛應激誘導的大鼠血清ACTH及CORT高表達水平表現(xiàn)出逆轉(zhuǎn)效應。結(jié)論:慢性束縛應激誘導的大鼠表現(xiàn)為應激狀態(tài)下的下丘腦-垂體-腎上腺軸(HPA軸)功能亢進,其血清ACTH和CORT呈高水平表達。電針干預可顯著逆轉(zhuǎn)這種效應,說明電針可對亢進的HPA軸進行調(diào)控。在停止干預后的第7天,電針組血清ACTH、CORT表達水平仍顯著低于模型組,說明電針干預可對亢進的HPA軸進行持續(xù)且有效的調(diào)控,這可能是電針抗抑郁的長效機制之一。

抑郁癥;電針;慢性束縛應激;促腎上腺皮質(zhì)激素;腎上腺皮質(zhì)酮

抑郁癥是常見精神障礙之一,指各種原因引起的以顯著而持久的心境低落為主要臨床特征的一類精神疾病。癥狀主要為心境低落、興趣喪失以及精力缺乏[1]。世界衛(wèi)生組織預測,到2030年抑郁癥造成的疾病負擔將會增加到總疾病負擔的6.2%,成為傷殘調(diào)整生命年減少的主要原因[2]。抗抑郁藥物治療是當前的主要療法,但是抗抑郁藥物治療存在著涉及心血管系統(tǒng)、消化系統(tǒng)等多種系統(tǒng)的不良反應[3]。因此,深入研究抑郁癥病理機制并尋求安全有效的治療方法具有重要意義。

1984年[4]以來,30余年的臨床觀察和實驗研究已經(jīng)證明了電針治療抑郁癥具有確切療效[5],可以顯著緩解患者臨床癥狀,改善生命質(zhì)量[6-7]。還有研究發(fā)現(xiàn)針藥結(jié)合治療比單純西藥治療在臨床療效、起效時間以及治療周期后的生命質(zhì)量改善方面效果更好[8],復發(fā)率更低[9]。因此電針抗抑郁的長效機制值得我們進一步深入研究。電針治療抑郁癥與多種內(nèi)分泌激素密切相關。實驗研究表明電針療法可下調(diào)慢性應激抑郁模型大鼠血清促腎上腺皮質(zhì)激素(Adrenocorticotrophic Hormone,ACTH)、腎上腺皮質(zhì)酮(Corticosterone,CORT)表達[10-11],從不同程度逆轉(zhuǎn)下丘腦-垂體-腎上腺(Hypothalamic-Pituitary-Adrenal,HPA)軸的亢進。本研究延續(xù)前期研究,從內(nèi)分泌激素角度探究電針治療抑郁癥機制的思路,觀察慢性束縛應激(Chronic Restraint Stress,CRS)模型大鼠血清ACTH與CORT水平,對慢性應激所致的抑郁癥病理機制及電針干預機制進行初步探討。同時,通過觀察大鼠干預期及恢復期血清ACTH與CORT水平,探究電針干預的持續(xù)效應。

1材料與方法

1.1 動物 SPF級雄性5周齡Sprague-Dawley(SD)大鼠60只,體重(120±10)g。由北京維通利華實驗動物有限公司提供[動物許可證號:NO.SCXK(京)2012-0001]。適應性飼養(yǎng)3 d,動物飼養(yǎng)于溫度(18～26 ℃)、濕度(55%)相對恒定的環(huán)境中,自然晝夜節(jié)律。對動物各項處理方式均按照北京中醫(yī)藥大學動物管理委員會相關倫理學規(guī)定進行。

1.2 試劑 ACTH酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ELISA)試劑盒(Usbiological,USA;023173),Micro plate Reader(MR-96,Mindray,USA),CORT ELISA試劑盒(ENZO,USA;ADI-900-097),水合氯醛(上海國藥集團化學試劑有限公司,生產(chǎn)批號30037517)。

1.3 分組及模型制備 適應性飼養(yǎng)后,根據(jù)隨機數(shù)字表將60只大鼠隨機分為對照組、模型組和電針組,每組20只。依據(jù)文獻[12],采用CRS結(jié)合孤養(yǎng)方法進行造模。具體方法:將大鼠放入特制細鐵絲網(wǎng)內(nèi),固定兩端,調(diào)節(jié)鐵絲網(wǎng)內(nèi)空間大小,僅使大鼠活動受限而不壓迫大鼠,每日束縛時間為9:00-15:00,持續(xù)28 d,束縛期間禁食禁水,造模結(jié)束后放回鼠籠,自由攝食攝水。對照組群養(yǎng)且不接受束縛應激,僅在模型組束縛期間斷食斷水,其余時間自由攝食攝水。電針組動物的飼養(yǎng)條件和束縛應激方法與模型組相同,在每日應激之前1 h給予電針干預,1次/d,共28 d。29～35 d期間,各組正常飼養(yǎng),不作任何處理。1～28 d為干預期,29～35 d為恢復期。

1.4 電針干預方法 穴位選取參照《實驗針灸學》[13]選取“百會”和“印堂”穴,用30號1寸毫針(2.5 cm)平刺進針,深度為0.5～1 cm,接華佗牌SDZ-2型電針針療儀,強度為1 mA,頻率為2 Hz,每次電針20 min,1次/d,共28 d。

2結(jié)果

2.1 各組大鼠血清ACTH在7、28和35 d表達水平 ELISA結(jié)果顯示,實驗day7,3組大鼠血清ACTH表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);實驗day28,與對照組比較,模型組血清ACTH表達顯著增加(P<0.01);與模型組比較,電針組血清ACTH表達顯著下降(P<0.05);實驗day35,與對照組比較,模型組血清ACTH表達顯著增加(P<0.01);與模型組比較,電針組血清ACTH表達顯著下降(P<0.05)。見表1與圖1。

表1 各組大鼠在7、28、35 d血清ACTH表達的比較

注:與對照組比較**P<0.01;與模型組比較△P<0.05

圖1 各組大鼠血清ACTH表達的比較

注:與對照組比較**P<0.01;與模型組比較#P<0.05

2.2 各組大鼠血清CORT在7、28和35天表達水平 結(jié)果顯示,實驗day7,3組大鼠血清CORT表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);實驗day28,與對照組比較,模型組CORT表達顯著增加(P<0.01);與模型組比較,電針組CORT表達顯著下降(P<0.01);實驗day35,與對照組比較,模型組CORT表達顯著增加(P<0.01);與模型組比較,電針組CORT表達顯著下降(P<0.01)。見表2與圖2。

表2 各組大鼠在7、28、35 d血清CORT表達的比較

注:與對照組比較**P<0.01;與模型組比較△△P<0.01

圖2 各組大鼠血清CORT表達的比較

注：與對照組比較**P<0.01;與模型組比較##P<0.01

3討論

CRS模型是一種可以避免對動物造成軀體損害,由壓力性空間誘導的心理應激模型[14],可以模擬人類抑郁癥病理過程的心理應激狀態(tài),作為抑郁癥的可靠造模方式[15]。中醫(yī)認為抑郁癥病位在腦,腦為元神之府,為精氣神匯聚之處。督脈不通則腦髓失養(yǎng),本課題組根據(jù)中醫(yī)經(jīng)典理論,經(jīng)多次研究[16-17]發(fā)現(xiàn)電針干預督脈的“百會”“印堂”穴位可有效緩解抑郁癥狀,因此本實驗選取以上穴位進行研究。

3.1 CRS對大鼠的影響

3.1.1 干預期內(nèi)大鼠血清ACTH和CORT表達 HPA軸是經(jīng)典的神經(jīng)內(nèi)分泌閉合環(huán)路,是神經(jīng)內(nèi)分泌免疫網(wǎng)絡的關鍵,機體通過改變HPA軸各水平層面激素表達,對外界應激刺激做出及時反應:下丘腦的室旁核刺激垂體前葉釋放ACTH,ACTH通過體循環(huán)到達腎上腺,刺激腎上腺皮質(zhì)合成糖皮質(zhì)激素(GC)并釋放GC,GC在嚙齒類動物體內(nèi)主要為皮質(zhì)酮(CORT)[18]。GC通過活化糖皮質(zhì)激素受體(GR)對HPA軸進行負反饋調(diào)節(jié)[19]。但是抑郁癥患者或慢性應激導致機體內(nèi)的應激系統(tǒng)處于過度激活狀態(tài),HPA軸調(diào)節(jié)異常?？哼M的HPA軸導致ACTH及CORT水平顯著升高,出現(xiàn)內(nèi)分泌紊亂的現(xiàn)象[20]。而海馬等腦區(qū)的GR功能下降,不能完成負反饋調(diào)節(jié),導致HPA軸功能持續(xù)亢進成為惡性循環(huán)。CORT的表達對恐懼、緊張焦慮等不良情緒的作用極其顯著[21],也有研究者發(fā)現(xiàn)皮質(zhì)醇可能作為預測或診斷抑郁癥的有效生物標志物[22]。有研究[23]采用放免法檢測慢性應激抑郁模型大鼠血清促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素、ACTH、CORT濃度,發(fā)現(xiàn)三者含量均明顯升高。有研究[24]同樣發(fā)現(xiàn)模型組大鼠血清ACTH、CORT含量明顯升高。本研究結(jié)果與以往研究相符,慢性束縛應激抑郁模型大鼠血清ACTH和CORT表達顯著增加,表現(xiàn)出HPA軸亢進現(xiàn)象,符合抑郁癥的HPA軸調(diào)節(jié)異常假說。

3.1.2 恢復期內(nèi)大鼠血清ACTH和CORT表達 應激的刺激強度及持續(xù)時間的不同可能會對機體內(nèi)分泌系統(tǒng)產(chǎn)生不同的影響[25],有學者[26]認為外在應激刺激結(jié)束以后,慢性束縛應激大鼠血清激素分泌處在較高水平,這主要與下丘腦激素過度分泌,HPA軸持續(xù)亢進有關。在本實驗中未作任何處理的恢復期(Day28～35),3組大鼠血清ACTH表達呈現(xiàn)降低趨勢,血清CORT表達呈現(xiàn)增加趨勢。我們推測可能是由于血清CORT的表達受到多種因素調(diào)控,其變化相對滯后。在恢復期的第7天(Day35),模型組血清ACTH與CORT含量仍分別顯著高于對照組,表明慢性束縛應激引起的神經(jīng)內(nèi)分泌激素的異常表達可能是持久的,恢復至基礎水平仍需要一定時間,與文獻中的研究結(jié)果一致[27]。

3.2 針刺對CRS大鼠的影響

3.2.1 干預期內(nèi)電針對大鼠血清ACTH與CORT表達的影響 本實驗結(jié)果顯示,在干預期的最后一天(Day28),與模型組比較,電針組血清ACTH、CORT表達顯著下降。推測電針干預可能通過調(diào)控亢進的HPA軸下調(diào)其表達,從而改善抑郁癥狀。前期研究[28-29]發(fā)現(xiàn)慢性應激抑郁模型大鼠ACTH、CORT水平顯著上升,電針干預可從不同程度下調(diào)其表達。表明電針在下調(diào)ACTH及CORT表達上,作用穩(wěn)定確切。電針干預對抑郁模型HPA軸的具體調(diào)節(jié)機制尚不清楚,有研究[30]表明電針對糖皮質(zhì)激素的過度分泌有直接的調(diào)控作用,并可以通過增強糖皮質(zhì)激素受體mRNA的表達改善HPA軸負反饋中樞的功能障礙,并且當HPA軸負反饋通路被阻斷后,電針作用減弱。至于電針干預具體是在哪些環(huán)節(jié)發(fā)揮了作用,有待進一步深入探究。

3.2.2 恢復期內(nèi)電針對大鼠血清ACTH與CORT表達的影響 在Day29至Day35的恢復期,3組大鼠激素的變化趨勢相同。在恢復期的第7天(Day35),與模型組比較,電針組血清ACTH與CORT表達顯著下降,表明停止干預后,電針的干預效果仍然存在,電針對上述兩指標具有相對持續(xù)的調(diào)控效應,這可能是電針抗抑郁的長效機制之一。有臨床研究[9]發(fā)現(xiàn)針藥結(jié)合治療難治性抑郁癥比單純西藥治療復發(fā)率更低?？梢酝茰y電針對抑郁癥的治療具有長效作用,而這種機制可能與電針對HPA軸的調(diào)節(jié)作用有關。

綜上所述，CRS模型誘導的大鼠表現(xiàn)為應激狀態(tài)下的HPA軸功能亢進,其血清ACTH和CORT呈高水平表達。電針干預可顯著逆轉(zhuǎn)這種效應,說明電針可對亢進的HPA軸進行調(diào)控。在停止干預后的第7天,電針組血清ACTH、CORT表達水平仍顯著低于模型組,說明電針干預可對亢進的HPA軸進行持續(xù)且有效的調(diào)控,這可能是電針抗抑郁的長效機制之一。

電針干預對應激模型大鼠HPA軸的具體調(diào)節(jié)機制及其持續(xù)效應機制有待進行深入探究。本研究還存在一些不足,可以增加中樞系統(tǒng)內(nèi)HPA軸的指標,以期探究電針抗抑郁在HPA軸上更確切的作用機制。此外,神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡系統(tǒng)在維持人體正常生命活動中發(fā)揮重要作用,三者之間又存在復雜分子學相互影響作用。神經(jīng)免疫和神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)在抑郁癥中有著密不可分的聯(lián)系[31]。在今后的研究中,將充分利用該網(wǎng)絡系統(tǒng)的整體生物學功能,對抑郁癥的病理機制作出全面探討。

[1]李凌江,馬辛.中國抑郁障礙防治指南[M].2版.北京:中華醫(yī)學電子音像出版社,2015:1-2.

[2]World Health Organization.Pharmacological treatment of mental disorders in primary health care[M].Geneva:World Health Organization,2009.[3]郭文情.抗抑郁藥物不良反應觀察與分析[J].吉林醫(yī)學,2013,34(2):274-275.

[4]羅和春,賈云奎,詹麗,等.電針治療情感性精神病(抑郁狀態(tài))療效觀察[J].中國針灸,1984,4(1):1-4.

[5]王旭東,喬明琦,張樟進,等.中醫(yī)藥治療抑郁癥的研究進展[J].南京中醫(yī)藥大學學報,2016,32(1):93-96.

[6]吳遷,王思涵,馬學紅,等.電針抗抑郁臨床療效與中醫(yī)癥狀改善的相關性研究[J].針灸臨床雜志,2015,31(9):4-7.

[7]馬學紅,楊秀巖,許珂,等.針刺聯(lián)合西藥治療輕中度抑郁癥患者88例臨床觀察[J].中醫(yī)雜志,2014,55(6):493-496.

[8]汪崇琦,彭玲梅,黃泳.電針合并帕羅西汀對抑郁癥患者生命質(zhì)量的影響[J].中國全科醫(yī)學,2010,13(13):1440-1443.

[9]劉新發(fā),封俊,石芝艷,等.針刺輔助治療難治性抑郁癥的療效與安全性臨床研究[J].甘肅科技,2015,31(14):134-137.

[10]喬瑞瑞,燕平,劉明菲,等.電針“百會”“神門”“太沖”穴對慢性應激抑郁模型大鼠血清ACTH、CORT的影響[J].世界中西醫(yī)結(jié)合雜志,2014,9(2):156-158.

[11]陳華德,金靈青,婁冉,等.電針對慢性應激抑郁模型大鼠的影響(英文)[J].針灸推拿醫(yī)學：英文版,2012,10(1):9-13.

[12]Tianwei G,Zhuo G,Xinjing Y,et al.The Alterations of IL-1Beta,IL-6 and TGF-Beta Levels in Hippocampal CA3 Region of Chronic Restraint Stress Rats after Electroacupuncture(EA)Pretreatment[J].Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine Volume 2014,Article ID 369158.

[13]張露芬.實驗針灸學[M].北京:化學工業(yè)出版社,2010:219.

[14]王逸,盧聰,宋廣青,等.慢性束縛應激對SD和Wistar大鼠學習記憶能力的影響[J].中國實驗動物學報,2014,22(2):40-44.

[15]Zhuo G,Tianwei G,Xinjing Y,et al.The Alterations of Damage-Repair Related Signals in Hippocampal CA3 Region of Chronic Stress Rats after Electric-Acupuncture(EA)Treatment[J].Journal of Alternative & Complementary Medicine,2014,20(5):5-6.

[16]許明敏,張丹妹,史榕荇,等.電針對慢性應激抑郁大鼠海馬轉(zhuǎn)化生長因子β3和堿性成纖維細胞生長因子表達的影響[J].針刺研究,2016,41(2):138-143.

[17]郭郁,許珂,包伍葉,等.針刺對強迫游泳應激大鼠海馬c-jun氨基末端激酶信號通路的影響[J].針刺研究,2016,41(1):18-23.

[18]Pariante CM,Lightman SL.The HPA axis in major depression:classical theories and new developments[J].Trends Neurosci,2008,31(9):464-468.

[19]Thiagarajah AS,Eades LE,Thomas PR,et al.GILZ:Glitzing up our understanding of the glucocorticoid receptor in psychopathology[J].Brain Res,2014,1574:60-69.

[20]Pariante CM,Miller AH.Glucocorticoid receptors in major depression:relevance to pathophysiology and treatment[J].Biol Psychiatry,2001,49(5):391-404.

[21]Müller M,Holsboer F,Keck ME.Genetic modification of corticosteroid receptor signalling:novel insights into pathophysiology and treatment strategies of human affective disorders[J].Neuropeptides,2002,36(2-3):117-131.

[22]Owens M,Herbert J,Jones PB,et al.Elevated morning cortisol is a stratified population-level biomarker for major depression in boys only with high depressive symptoms[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2014,111(9):3638-3643.

[23]劉曉萌,張榮,董世芬,等.烏靈菌粉貫葉連翹復方制劑干預對慢性不可預知應激大鼠模型抗抑郁作用及機制的研究[J].中國比較醫(yī)學雜志,2016,26(5):81-86.

[24]胡霖霖,張永華.百合逍遙散對抑郁模型大鼠行為學及HPA-HPT-HPG軸的影響[J].中醫(yī)雜志,2014,55(19):1676-1680.

[25]Sengupta JN,Saha JK,Goyal RK.Stimulus response function studies of esophogeal mechano sensitive nociceptors in sympathetic afferents of possum[J].J Neurop hsiol,1990,64:796-810.

[26]孫燕,柳鋒霖,宋耿青,等.急性和慢性束縛應激對大鼠內(nèi)臟敏感性和神經(jīng)內(nèi)分泌的影響[J].中華消化雜志,2006,26(1):38-41.

[27]RomeoRD.Pubertal maturation and programming of Hypothalamicp-ituitary-adrenal reactivity[J].Front.Neuroendocrinol,2010,31:232-240.

[28]梁佳,盧峻,王俊仁,等.不同針刺方法對慢性應激抑郁大鼠下丘腦CRH基因表達及血清ACTH、CORT的影響[J].北京中醫(yī)藥大學學報,2012,35(4):265-268.

[29]賈寶輝,李志剛,時宇靜,等.電針對慢性應激模型大鼠行為學及HPA軸相關激素的影響[J].針刺研究,2004,29(4):252-256.

[30]游偉,時宇靜,韓焱晶,等.電針對慢性應激抑郁模型大鼠糖皮質(zhì)激素及其受體基因表達的影響[J].針刺研究,2010,35(4):261-266.

[31]Horowitz MA,Zunszain PA.Neuroimmune and neuroendocrine abnormalities in depression:two sides of the same coin[J].Ann N Y Acad Sci,2015,1351(1):68-79.

(2017-01-18收稿 責任編輯：王明)

EffectsofElectro-acupunctureontheExpressionofSerumACTHandCORTatDifferentTimeinRatsExposedtoChronicRestraintStress

Liang Xingchen1, Sun Lan2, Wang Yu1, Jiang Huili1, Li Jing1, Yang Xinjing1, Zhao Bingcong1, Yu Qiuyun1, Li Xiang1, Feng Shixing1, Lu Jun1, Tu Ya1

(1SchoolofAcupunctureandMoxibustion,BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100020,China; 2SchoolofPsychologicalandCognitiveSciences,PekingUniversity,Beijing100871,China)

Objective: We observed the effects of electro-acupuncture on the expression of serum ACTH and CORT in rats exposed to chronic restraint stress (CRS), to explore the antidepressive effects and possible mechanisms of electro-acupuncture in the treatment of depression.Methods: Sixty SD rats were equally divided into three groups: control group, model group and electro-acupuncture group. Except the control group, all rats were in the condition of chronic restraint stress and separation. The EA group was stimulated at GV 20 and EX-HN 3 for 20 min before daily bound. ACTH and CORT levels were detected by ELISA respectively on the 7th, 28th, 35th day (the 7th day after the last intervention).Results: Effects on Serum ACTH and CORT: After 7 days, there was no difference among three groups. On the 28th and the 35th day, compared with the control group, the model group significantly increased (P<0.01;P<0.01;P<0.01;P<0.01); Compared with the model group, EA group significantly decreased (P<0.05;P<0.05;P<0.01;P<0.01). The electro-acupuncture had a reversal effect on the expression of serum ACTH and CORT in rats exposed to chronic restraint stress.Conclusion: The hypothalamic-pituitary-adrenal (HPA) axis hyperactivity is observed in rats exposed to chronic restraint stress, and its level of serum ACTH and CORT are significantly higher. The level of serum ACTH and CORT are reversed by EA intervention, which suggests that EA intervention can regulate HPA axis hyperactivity. The 7th day after the last intervention, the level of ACTH and CORT of EA group are still significantly lower than the model group, which suggests that EA intervention has continuous regulatory effect on the HPA axis hyperactivity, and it may be one of the persistent effect mechanisms of antidepressive effects of EA.

Depression; Electro-acupuncture; Chronic restraint stress; ACTH; CORT

R285.5

：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2017.09.040

國家自然科學基金項目(81173334，81373729)；北京市優(yōu)秀博士學位論文指導教師科研項目(YB20091002601)

梁星辰(1992.06—)，女，在讀碩士，研究方向:針刺抗抑郁臨床與機制研究,E-mail：xingchen9268@163.com

圖婭(1955.08—)，女，醫(yī)學博士，教授，主任醫(yī)師，博士研究生導師,研究方向:針刺抗抑郁臨床與機制研究，E-mail:tuyab@263.net