基于不同精神心理應(yīng)激建立IBS-D大鼠模型的比較研究

張北華 王 微 王鳳云 唐旭東

(1 中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院，北京，100091； 2 北京市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，北京，100039)

實(shí)驗(yàn)研究

基于不同精神心理應(yīng)激建立IBS-D大鼠模型的比較研究

張北華1王 微2王鳳云1唐旭東1

(1 中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院，北京，100091； 2 北京市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，北京，100039)

目的：比較基于母子分離、慢性束縛等不同精神心理應(yīng)激建立IBS-D大鼠模型的特征差異，探索建立IBS-D大鼠模型的理想方法。方法：將40只新生期SD大鼠隨機(jī)分為母子分離組和非母子分離組，每組20只，母子分離組大鼠第2～14天每天與母鼠分離3 h，其余大鼠不分離。第9周，將非母子分離組隨機(jī)分為正常組(N組)、慢性束縛組(R組)，將母子分離組隨機(jī)分為單一母子分離組(S組)和聯(lián)合應(yīng)激組(SR組)，每組10只。R組和SR組大鼠采用自制束縛架進(jìn)行制動(dòng)束縛應(yīng)激，3 h/d，連續(xù)3周，其余2組不予束縛。在束縛期的最后1周，N組大鼠予生理鹽水灌胃，其余3組大鼠均予番瀉葉煎劑(0.45 g/mL)灌胃(4.5 g/kg)，連續(xù)7 d。檢測(cè)評(píng)價(jià)4組大鼠成年期束縛應(yīng)激前后內(nèi)臟敏感性、大便積分、曠場(chǎng)行為學(xué)，以及造模后血清5羥色胺水平、近端結(jié)腸常規(guī)病理、肥大細(xì)胞及嗜鉻細(xì)胞數(shù)量。結(jié)果：1)內(nèi)臟敏感性：束縛應(yīng)激前，經(jīng)歷母子分離應(yīng)激組(S組、SR組)大鼠痛覺(jué)閾值明顯低于非母子分離應(yīng)激組(N組、R組)(P<0.05)；束縛應(yīng)激后，S組和SR組大鼠痛覺(jué)閾值顯著低于N組(P<0.05)，R組與N組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。2)大便積分：S組、R組及SR組大便積分均明顯高于正常組(P<0.05)，SR組明顯高于R組和S組(P<0.05)。3)曠場(chǎng)行為學(xué)特征：束縛應(yīng)激前，S和SR組大鼠曠場(chǎng)穿格數(shù)有低于N和R組的趨勢(shì)，但站立數(shù)均明顯低于N和R組(P<0.05)；束縛應(yīng)激后，R組、S組、R組大鼠曠場(chǎng)穿格數(shù)及站立數(shù)均明顯低于N組(P<0.05)，SR組穿格數(shù)明顯低于S組(P<0.05)。4)血清5-HT水平：S組和SR組大鼠血清5-HT水平明顯高于N組(P<0.05)，R組與N組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，SR組明顯高于S組和R組(P<0.05)。5)近端結(jié)腸病理及MC、EC數(shù)目：4組大鼠結(jié)腸病理未見(jiàn)異常。SR組大鼠近端結(jié)腸MC數(shù)目明顯多于N組(P<0.05)，其余各組與N組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。S組、R組及SR組結(jié)腸嗜鉻細(xì)胞數(shù)目均明顯高于N組(P<0.05)，SR組與S組和R組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論：基于母子分離聯(lián)合慢性束縛應(yīng)激及番瀉葉灌胃可復(fù)制IBS-D大鼠模型，該模型具有內(nèi)臟敏感性增高、排便異常和抑郁樣行為特征。

腹瀉型腸易激綜合征；造模方法；精神心理應(yīng)激；比較研究

腸易激綜合征(Irritable Bowel Syndrome，IBS)是一種以反復(fù)發(fā)作的腹痛，與排便相關(guān)或伴排便習(xí)慣改變的功能性腸病[1]。根據(jù)排便習(xí)慣改變的主要表現(xiàn)將IBS分為IBS腹瀉型(IBS-D)、IBS便秘型(IBS-C)、IBS混合型(IBS-M)和IBS不定型(IBS-U)。我國(guó)以IBS-D最多見(jiàn)，一項(xiàng)多中心的調(diào)查研究顯示符合羅馬Ⅲ標(biāo)準(zhǔn)的IBS-D患者約占66.3%[2]。IBS-D的病因復(fù)雜，發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，大量的研究表明早期不良生活事件和精神疾病與IBS的發(fā)病具有密切的關(guān)系[3-4]。母子分離和束縛應(yīng)激作為2種不同的精神心理因素早已被用于建立IBS動(dòng)物模型研究[5-6]，這2種方法均可導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)大鼠內(nèi)臟敏感性增高，排便異常。目前尚無(wú)公認(rèn)的IBS-D動(dòng)物模型，有研究采用病原體灌胃和化學(xué)物質(zhì)灌腸法造模模擬IBS-D[7-8]，也有研究基于內(nèi)臟高敏感動(dòng)物模型疊加致瀉因素造模[9]。本研究擬采用精神心理應(yīng)激疊加致瀉因素建立IBS-D大鼠模型，并比較分析不同精神心理應(yīng)激造模方法的特征和差異。

1材料與方法

1.1 材料

1.1 動(dòng)物 SPF級(jí)SD孕鼠8只，孕期(18±2)d，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，合格證編號(hào)：SCXK(京)2012-0001，選用新生雄性大鼠造模，全部飼養(yǎng)于中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(室溫22～25 ℃，相對(duì)濕度45% ～60%，光照周期12 h/12 h，自由進(jìn)食、飲水)。

1.1.2 藥物 番瀉葉水煎劑(0.45 g生藥/mL)，由中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院制劑室統(tǒng)一制作。

1.1.3 試劑與儀器 5-HT ELISA試劑盒，購(gòu)至Abnova公司(貨號(hào)：KA1894)；肥大細(xì)胞試劑盒，購(gòu)至廈門(mén)邁威生物科技有限公司(貨號(hào)：MT-022)；5-HT即用型抗體，購(gòu)至北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司(貨號(hào)：ZA-0231)；通用型二步法免疫組化檢測(cè)試劑盒，購(gòu)至北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司(貨號(hào)：PV-6000)。參照文獻(xiàn)[10]自制直腸測(cè)壓計(jì)，參照文獻(xiàn)[11]自制T型大鼠束縛架和木質(zhì)曠場(chǎng)箱(長(zhǎng)和寬各100 cm、高40 cm，每列每行各畫(huà)5個(gè)方格，中央9個(gè)為中央格，外周16個(gè)格稱外周格)。Multiskan MK3酶標(biāo)儀由Thermo公司生產(chǎn)。BX51光學(xué)顯微鏡和BX41圖像采集系統(tǒng)均由日本Olympus公司生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 將新生期SD大鼠隨機(jī)分為非母子分離組和母子分離組，每組20只。母子分離組大鼠從出生后第2～14天，每天與母鼠分離3 h。非母子分離組不予分離。第9周，將非母子分離組隨機(jī)分為正常組(N組)和慢性束縛組(R組)，將母子分離組隨機(jī)分為單一母子分離組(S組)和聯(lián)合應(yīng)激組(SR組)，每組10只。參照文獻(xiàn)[11]采用自制束縛架將R組和SR組大鼠每天制動(dòng)束縛3 h，連續(xù)3周，其余2組不予束縛。在束縛期第3周，正常組給予生理鹽水灌胃，其余各組給予番瀉葉水煎劑(0.45 g/mL)灌胃(1 mL/100 g)，連續(xù)1周。

1.2.2 內(nèi)臟敏感性的評(píng)價(jià) 參照文獻(xiàn)[10]，將AWR評(píng)分=3時(shí)的壓力數(shù)作為疼痛閾值，于束縛應(yīng)激前后分別采用自制直腸測(cè)壓計(jì)檢測(cè)4組大鼠的疼痛閾值，評(píng)價(jià)其內(nèi)臟敏感性。

1.2.3 大便評(píng)分 參照文獻(xiàn)[12]制定大便評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：硬便1分，軟便2分，不成形便3分，觀察造模結(jié)束后4組大鼠每天6 h內(nèi)的大便情況，連續(xù)觀察5 d。

1.2.4 曠場(chǎng)行為學(xué)評(píng)價(jià) 在束縛應(yīng)激前后采用自制木質(zhì)曠場(chǎng)箱觀察4組大鼠的行為學(xué)特征。實(shí)驗(yàn)在安靜、四周無(wú)外界干擾并杜絕參照物的環(huán)境條件下進(jìn)行，曠場(chǎng)箱上方安置攝像頭，操作者輕輕將大鼠放入曠場(chǎng)箱的正中格內(nèi)，開(kāi)始同步錄像，觀察5 min內(nèi)大鼠活動(dòng)情況。觀察總穿格數(shù)(三爪以上跨入同一格的次數(shù))和站立次數(shù)(兩前肢向上抬起離開(kāi)箱底面或攀伏在側(cè)壁上以后腿支撐使身體豎立的次數(shù))。

1.2.5 檢測(cè)指標(biāo)與方法 采用水合氯醛麻醉大鼠，腹主動(dòng)脈取血，于4 ℃ 2 500 r/min離心15 min，取上清液分裝至2 mL EP管中，-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆茫捎肊LISA法檢測(cè)4組大鼠血清中5-HT含量。處死大鼠后，截取距盲腸3 cm處的結(jié)腸組織，放入10%的中性甲醛溶液中固定，采用石蠟包埋切片，采用蘇木精伊紅(HE)染色觀察4組結(jié)腸組織中的常規(guī)病理特征，采用甲苯胺藍(lán)改良染色法觀察肥大細(xì)胞(MC)數(shù)目，采用5-HT免疫組化法觀察嗜鉻細(xì)胞(EC)數(shù)目，每組10個(gè)樣本，每個(gè)樣本切片隨機(jī)選3個(gè)視野觀察。

2結(jié)果

2.1 內(nèi)臟敏感性 在束縛應(yīng)激前，與非母子分離應(yīng)激組(N組、R組)比較，母子分離組(S組、SR組)痛覺(jué)閾值顯著降低(P<0.05)。在束縛應(yīng)激后，與N組比較，S組、SR2組痛覺(jué)閾值均顯著降低(P<0.05)；R組痛覺(jué)閾值有下降趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。SR組痛覺(jué)閾值均顯著低于R組、S組(P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.2 大便積分 造模期間，經(jīng)母子分離應(yīng)激大鼠成年后大便頻次和性狀無(wú)明顯變化，短期束縛應(yīng)激可使正常大鼠和母子分離大鼠的排便頻次均明顯增加，束縛一周后大便頻次逐漸減少至正常，但大便含水量明顯增加。經(jīng)番瀉葉灌胃可使4組大鼠出現(xiàn)急性腹瀉，出現(xiàn)水樣便或不成形便，但隨著藥物作用的消失，大便逐漸成形，含水量仍有增加。造模結(jié)束后，與N組比較，R組、S組、SR組3組大鼠大便積分均顯著增高(P<0.05)。SR組大便積分顯著高于R組、S組(P<0.05)。見(jiàn)表2。

2.3 曠場(chǎng)行為學(xué) 在束縛應(yīng)激前，母子分離應(yīng)激組(S組、SR組)的穿格數(shù)較非母子分離應(yīng)激組(N組、R組)有減少趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；母子分離應(yīng)激組(S組、SR組)的站立數(shù)明顯低于非母子分離應(yīng)激組(N、R組)(P<0.05)，SR組的站立數(shù)明顯低于R組(P<0.05)，與S組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。在束縛應(yīng)激結(jié)束后，與N組比較，R組、S組、SR3組的站立數(shù)及穿格數(shù)均顯著降低(P<0.05)，SR組的穿格數(shù)明顯低于S組(P<0.05)，與R組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。SR組的站立數(shù)與R組、S組差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表3。

2.4 血清5-HT水平 與N組比較，S組及SR組血清5-HT水平顯著升高(P<0.05)，R組與之差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。SR組與R組、S組比較，血清5-HT水平均顯著升高(P<0.05)。見(jiàn)表4。

表1 4組大鼠束縛應(yīng)激前后的痛覺(jué)閾值(mmHg，n=10)

注:與正常組比較，*P<0.05；與慢性束縛組比較，△P<0.05；與母子分離組比較，▲P<0.05

表2 4組大鼠造模后每天6 h內(nèi)的大便積分(分，n=10)

注:與正常組比較，*P<0.05；與慢性束縛組比較，△P<0.05；與母子分離組比較，▲P<0.05

表3 4組大鼠束縛應(yīng)激前后曠場(chǎng)行為學(xué)結(jié)果

注:與正常組比較，*P<0.05；與慢性束縛組比較，△P<0.05；與母子分離組比較，▲P<0.05

表4 4組大鼠血清5-HT水平

注:與正常組比較，*P<0.05；與慢性束縛組比較，△P<0.05；與母子分離組比較，▲P<0.05

圖1 近端結(jié)腸組織病理(HE染色，×200)

注：N為正常組；R為慢性束縛組；S為母子分離組；SR為聯(lián)合應(yīng)激組

圖2 近端結(jié)腸MC細(xì)胞甲苯胺藍(lán)染色(×400)

注：N正常組；R慢性束縛組；S母子分離組；SR聯(lián)合應(yīng)激組

圖3 近端結(jié)腸組織5-HT免疫組化染色(×200)

注：N為正常組；R為慢性束縛組；S為母子分離組；SR為聯(lián)合應(yīng)激組

2.5 近端結(jié)腸病理及MC、EC計(jì)數(shù) 結(jié)腸常規(guī)病理顯示：N組結(jié)腸無(wú)異常，R組、S組、SR組3組結(jié)腸均有輕微充血，未見(jiàn)明顯中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)和間質(zhì)水腫。見(jiàn)圖1。甲苯胺藍(lán)改良染色結(jié)果顯示：光鏡下MC胞質(zhì)被染成紫紅色，胞核呈藍(lán)色，散布于黏膜固有層、黏膜下層。見(jiàn)圖2。與N組比較，SR組大鼠近端結(jié)腸MC數(shù)目增多(P<0.05)，與S組比較，差異無(wú)顯著性意義。免疫組化染色顯示：EC分布于腸黏膜層，主要分布于腸腺腔內(nèi)，細(xì)胞呈橢圓形、星狀、楔形或不規(guī)則形，細(xì)胞質(zhì)著色。見(jiàn)圖3。與N組比較，R組、S組、SR組3組近端結(jié)腸EC數(shù)目顯著增多(P<0.05)，SR組與R組、S組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表5。

表5 4組大鼠近端結(jié)腸肥大細(xì)胞、嗜鉻細(xì)胞計(jì)數(shù)

注:與正常組比較，*P<0.05

3討論

羅馬Ⅳ標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定IBS-D除具有腹痛癥狀外，超過(guò)25%的排便為Bristol糞便性狀6型或7型，且少于25%的排便Bristol糞便性狀1型或2型。其病理生理機(jī)制主要包括內(nèi)臟敏感性增高、結(jié)腸動(dòng)力增強(qiáng)、腸上皮通透性增加、腦-腸軸功能異常等等[13-14]。所以理想的IBS-D大鼠模型應(yīng)具備上述病理生理特征。

本研究結(jié)果顯示長(zhǎng)期單一束縛應(yīng)激(制動(dòng)束縛，每天3 h，連續(xù)21 d)并不能提高實(shí)驗(yàn)大鼠的敏感性，與文獻(xiàn)報(bào)道慢性不可預(yù)知應(yīng)激(7種刺激因素，隨機(jī)安排不重復(fù)，連續(xù)21 d)可導(dǎo)致成年大鼠內(nèi)臟敏感性增高結(jié)果不同[15]，可能與長(zhǎng)期單一束縛應(yīng)激導(dǎo)致大鼠適應(yīng)有關(guān)。早在1988年Williams等[5]采用限制部分活動(dòng)的急性束縛應(yīng)激誘發(fā)排便異常的大鼠模型模擬IBS，該方法可促進(jìn)結(jié)腸運(yùn)動(dòng)，增加排便粒數(shù)，這種急性束縛應(yīng)激同樣可使實(shí)驗(yàn)大鼠內(nèi)臟敏感性增高[16]。有研究比較了急性和慢性束縛應(yīng)激的差異，結(jié)果顯示連續(xù)4 d的慢性束縛應(yīng)激也可提高大鼠的內(nèi)臟敏感性，但低于急性束縛應(yīng)激[17]。另有研究顯示急性和慢性束縛應(yīng)激對(duì)大鼠內(nèi)臟敏感性的影響是暫時(shí)的，急性束縛應(yīng)激短暫提高大鼠血漿促腎上腺皮質(zhì)激素及皮質(zhì)酮水平，而慢性束縛應(yīng)激可長(zhǎng)期提高這些激素水平[18]。

本研究結(jié)果顯示母子分離應(yīng)激可顯著降低實(shí)驗(yàn)大鼠的痛覺(jué)閾值，說(shuō)明母子分離應(yīng)激可提高大鼠的內(nèi)臟敏感性，與既往報(bào)道一致[6，19]。本研究發(fā)現(xiàn)間隔3周時(shí)間重復(fù)檢測(cè)痛覺(jué)閾值，母子分離應(yīng)激所致大鼠內(nèi)臟高敏感性依然存在，說(shuō)明母子分離應(yīng)激所致內(nèi)臟高敏感性大鼠模型持久穩(wěn)定，重復(fù)性好。另有研究[10]報(bào)道新生期大鼠給予結(jié)直腸擴(kuò)張或芥末油灌腸，成年后內(nèi)臟敏感性增高，較成年期給予相同的應(yīng)激所致內(nèi)臟敏感性增高更明顯。這與臨床報(bào)道早期不良事件與IBS發(fā)病密切相關(guān)結(jié)果一致[3]。

本研究結(jié)果顯示，新生期母子分離應(yīng)激聯(lián)合成年期慢性束縛應(yīng)激組大鼠痛覺(jué)閾值顯著降低，低于單一因素應(yīng)激，說(shuō)明精神心理因素聯(lián)合應(yīng)激可進(jìn)一步提高實(shí)驗(yàn)大鼠的內(nèi)臟敏感性，該方法尚無(wú)研究報(bào)道。

IBS-D腹瀉具有慢性、反復(fù)發(fā)作的特點(diǎn)，本研究采用番瀉葉灌胃可使大鼠出現(xiàn)急性腹瀉，藥效消失后則大便轉(zhuǎn)實(shí)，尚不能模擬理想的IBS-D大便特征。本研究結(jié)果顯示基于不同的精神心理應(yīng)激因素，采用同樣劑量的番瀉葉灌胃也會(huì)使大鼠出現(xiàn)不同程度的腹瀉，聯(lián)合應(yīng)激組大鼠經(jīng)番瀉葉灌胃后，腹瀉時(shí)間延長(zhǎng)、大便粒數(shù)增多，大便積分明顯高于其他各組，考慮可能與其內(nèi)臟高敏感性增高和結(jié)腸轉(zhuǎn)運(yùn)速度加快有關(guān)。

曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)是評(píng)價(jià)嚙齒類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物運(yùn)動(dòng)功能和狀態(tài)焦慮的經(jīng)典方法，其中水平運(yùn)動(dòng)(穿格數(shù))反映了動(dòng)物的運(yùn)動(dòng)活性，垂直運(yùn)動(dòng)(站立數(shù))反映了動(dòng)物對(duì)新鮮環(huán)境的好奇程度[20]。本研究結(jié)果顯示：慢性束縛組、母子分離組及聯(lián)合應(yīng)激組大鼠曠場(chǎng)穿格數(shù)和站立數(shù)均有不同程度的減少，說(shuō)明精神心理應(yīng)激導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)大鼠運(yùn)動(dòng)活性降低，對(duì)新鮮事物的好奇程度也降低，符合焦慮抑郁樣行為，與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[21-22]。其中以慢性束縛應(yīng)激對(duì)大鼠焦慮抑郁樣行為影響最大。

從結(jié)腸病理來(lái)看，各組結(jié)腸均未出現(xiàn)炎性反應(yīng)細(xì)胞浸潤(rùn)和間質(zhì)水腫，符合功能性腸病的表現(xiàn)，說(shuō)明基于精神心理應(yīng)激聯(lián)合番瀉葉灌胃所致大鼠腹瀉符合功能性腸病腹瀉特征。

臨床研究[23-26]顯示5-HT與內(nèi)臟敏感性具有密切的關(guān)系，IBS-D患者的血清和腸黏膜5-HT水平升高。本研究結(jié)果顯示單一母子分離應(yīng)激或母子分離聯(lián)合束縛應(yīng)激均可提高大鼠血清5-HT水平，與臨床研究報(bào)道一致。5-HT作為自體活性物質(zhì)，約90%合成和分布于腸嗜鉻細(xì)胞。本研究結(jié)果顯示，母子分離組及聯(lián)合應(yīng)激組大鼠近端結(jié)腸組織中EC數(shù)目高于正常組，與臨床研究報(bào)道一致。

多個(gè)研究[27-30]表明IBS-D患者結(jié)腸組織中肥大細(xì)胞數(shù)目高于正常人，IBS內(nèi)臟敏感性增高與肥大細(xì)胞脫顆粒具有密切的關(guān)系。本研究顯示慢性束縛應(yīng)激、母子分離應(yīng)激具有使大鼠結(jié)腸肥大細(xì)胞增加的趨勢(shì)，而兩者聯(lián)合可顯著增加結(jié)腸肥大細(xì)胞數(shù)目，與上述臨床報(bào)道一致。

綜上所述，新生期母子分離應(yīng)激可使大鼠出現(xiàn)持久穩(wěn)定的內(nèi)臟高敏感性和抑郁樣行為；慢性束縛應(yīng)激對(duì)大鼠內(nèi)臟敏感性無(wú)明顯影響，但可使大鼠出現(xiàn)明顯的抑郁樣行為，兩者聯(lián)合具有協(xié)同效應(yīng)?；诰裥睦響?yīng)激聯(lián)合番瀉葉灌胃可模擬IBS-D的部分病理生理特征，基于母子分離+慢性束縛聯(lián)合應(yīng)激法建立IBS-D大鼠模型優(yōu)于單一應(yīng)激法。

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(2017-03-05收稿 責(zé)任編輯：楊覺(jué)雄)

ComparativeStudyofEstablishmentofaRatModelofIBS-DBasedonDifferentPsychologicalStress

Zhang Beihua1，Wang Wei2，Wang Fengyun1，Tang Xudong1

(1XiyuanHospitalofChinaAcademyofChineseMedicalSciences，Beijing100091，China; 2BeijingHospitalofIntegratedTraditionalChineseandWesternMedicine,Beijing100039，China)

Objective:To explore a reliable rat model of IBS-D by comparing the differences of different psychological stress.Methods:A total of 40 neonatal rats were randomly divided into 2 groups:normal group and maternal separation group. The pups in the maternal separation group were exposed to 3 h period daily maternal separation from postnatal day 2～14, and then they were randomly divided into single maternal separation group(S) and combined stress group (SR) in the 9th week. The pups it the other group were left untreated and then were randomly divided into normal group (N) and chronic restraint stress group(R) in the 9th week. The group R and SR underwent chronic restraint stress by specially designed restraint frame 3 h daily for 3 weeks. The group N and S were left untreated. In the 12th week, the group N was given normal saline by gavage, the group R, S and SR were given Senna decoction (0.45 g/mL) by gavage(4.5 g/kg)for 7 days. The visceral sensitivity was tested and the animal behavior was evaluated by open field test before and after the chronic restraint stress. The fecal scores were calculated. The level of serum 5-HT, the number of mast cells (MC) and enterochromaffin cell (EC) of the proximal colon colon were tested after the modeling.Results:1) Visceral sensitivity:Before the restraint stress, the pain threshold of the maternal separation group(S、SR) were lower compared to the other group(N、R) (P<0.05). After the modeling, the pain threshold of the group S and SR were lower than group N (P<0.05), and there was no significant difference between the group R and N. 2) Fecal score:The fecal scores of group S, R, SR were significantly higher than the group N (P<0.05), the fecal score of group SR was significantly higher than the group S and R (P<0.05). 3) Open field test:Before the restraint stress, the horizontal motion of the group S and SR tend to decrease compared to the group N、R, while the vertical motion of the group S and SR were significantly lower compared to the group N、R(P<0.05). After the modeling, the horizontal and vertical motion of the group S and SR significantly decreased compared to group N (P<0.05). The horizontal motion of group SR was significantly decreased compared to the group S (P<0.05). 4) Serum 5-HT:The level of serum 5-HT increased in the group S and SR compared to the group N (P<0.05).There was no significant difference between the group R and N. And the level of serum 5-HT increased in the group SR compared to the group N (P<0.05). 5) Pathological features, the number of MC and EC in the proximal colon：There were no obvious abnormality in the Pathological features.The number of the MC in group SR increased significantly compared to the group N (P<0.05)，but there was no significant difference in the other groups. The number of EC in group R,S and SR increased significantly compared to group N (P<0.05).There were no significant difference among the group R, S and SR.Conclusion:The maternal separation stress, combined with chronic restraint stress and senna decoction by gavage could duplicate the IBS-D rat model, which is characterized with visceral hypersensitivity, abnormal defecation and depression.

Diarrhea-predominant rritable bowel syndrome; Modeling methods; Psychological stress; Comparative study

R282；R-332

：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2017.09.035

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81403393，81173209，81373580)

張北華(1983.09—)，男，博士，主治醫(yī)師，研究方向：中醫(yī)藥防治功能性胃腸病的基礎(chǔ)與臨床研究，E-mail：zhangbeihua888@163.com

唐旭東(1963.03—)，男，博士，博士研究生導(dǎo)師，主任醫(yī)師，研究方向：中醫(yī)藥防治消化系統(tǒng)疾病研究，E-mail：txdly@sina.com