陸地棉SRO基因家族的鑒定及表達(dá)分析

呂有軍楊衛(wèi)軍趙蘭杰姚金波陳 偉李 燕張永山,*安陽(yáng)工學(xué)院, 河南安陽(yáng) 455000;中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所, 河南安陽(yáng) 455000;棉花生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 河南安陽(yáng) 455000

陸地棉SRO基因家族的鑒定及表達(dá)分析

呂有軍1,2,3楊衛(wèi)軍1趙蘭杰2姚金波2陳 偉2李 燕2張永山2,*
1安陽(yáng)工學(xué)院, 河南安陽(yáng) 455000;2中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所, 河南安陽(yáng) 455000;3棉花生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 河南安陽(yáng) 455000

SRO是植物特有的類(lèi)RCD-ONE蛋白家族, 在植物抵御各種生物和非生物脅迫過(guò)程中具有重要的作用。本研究利用生物信息學(xué)方法從陸地棉遺傳標(biāo)準(zhǔn)系TM-1 (Gossypium hirsutum L. acc. TM-1)基因組中鑒定到12個(gè)SRO基因家族成員。多重序列比對(duì)及進(jìn)化樹(shù)分析表明, 12個(gè)陸地棉SRO均含有PARP和RST結(jié)構(gòu)域, 聚為3類(lèi), 即A、B和C亞家族。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析表明, TM-1全基因組中的Gh_D12G1442在莖中優(yōu)勢(shì)表達(dá), Gh_D05G2064在萼片和雄蕊中優(yōu)勢(shì)表達(dá); Gh_A05G3788在雄蕊中優(yōu)勢(shì)表達(dá), Gh_A12G1318在雄蕊和纖維中優(yōu)勢(shì)表達(dá); Gh_A12G2480、Gh_D12G2608、Gh_A05G2257和Gh_D05G2516在纖維中優(yōu)勢(shì)表達(dá); Gh_A08G1390、Gh_D08G1685、Gh_A12G2663和Gh_D12G2054具有較為廣泛的組織表達(dá)。逆境脅迫處理試驗(yàn)表明, Gh_A08G1390明顯受冷處理和鹽處理的誘導(dǎo), Gh_D12G2054、Gh_D08G1685、Gh_A12G2663基因在不同的脅迫處理下受到不同程度的誘導(dǎo)。

陸地棉; 逆境脅迫; SRO; 基因組

植物適應(yīng)外界高溫、干旱等環(huán)境的變化是由自身特有的一些轉(zhuǎn)錄因子所調(diào)控, 一些轉(zhuǎn)錄因子在基因組水平上已經(jīng)被分離, 例如NAC (NAM、ATAF和CUC), AP2 (APETALA2)/ERF (ethylene-responsive element binding factor), WRKY, Dof (DNA-binding with one finger)和ARF (auxin response factor)[1]。許多植物特有的轉(zhuǎn)錄因子家族成員參與植物特殊的發(fā)育過(guò)程, 參與并調(diào)控植物對(duì)外界環(huán)境的應(yīng)激反應(yīng)[2-4]。在這些植物特有的轉(zhuǎn)錄因子家族中, SRO (SIMILARTO-RCD-ONE)是最近被鑒定出的一類(lèi)小蛋白家族,在植物逆境反應(yīng)中具有重要的作用。它包含植物所特有的PARP (Poly ADP-ribose polymerase)催化中心和 C末端的 RST [RCD-SRO-TAF4 (TATA-boxbinding protein-associated factor 4)]結(jié)構(gòu)域[5-6]。

在擬南芥中, 共鑒定出SRO家族的6個(gè)同源基因, 分別為 AtCEO1、AtSRO1、AtSRO2、AtSRO3、AtSRO4 和 AtSRO5。AtCEO1能提高野生型酵母和Yap1突變酵母對(duì)氧化脅迫的抵抗能力[7]。其功能缺失能夠引起擬南芥中超過(guò)500個(gè)基因的表達(dá)受到不同程度的調(diào)控, 其突變能夠引起植物細(xì)胞的快速死亡, 所以又被稱(chēng)之為 RCD1 (Radical-induce cell death 1), 其突變體表現(xiàn)出提前開(kāi)花, 能夠引起葉綠體ROS抗性、鹽敏感性、改變NO、激素反應(yīng)等多種發(fā)育及脅迫反應(yīng)表型[8-10]。因此, AtCEO1在擬南芥生長(zhǎng)發(fā)育和對(duì)環(huán)境脅迫應(yīng)答機(jī)制中發(fā)揮著重要的作用。研究表明, AtSRO1與 AtRCD1之間存在功能上的部分冗余, AtSRO1也參與到非生物脅迫反應(yīng)當(dāng)中, 但相應(yīng)的突變 sro1-1對(duì)滲透、氧化等脅迫具有較野生型強(qiáng)的抵抗能力[11-13], AtSRO5的表達(dá)受到鹽脅迫的誘導(dǎo), 為氧化脅迫反應(yīng)所需, AtSRO5之前被報(bào)道作為公共的脅迫反應(yīng)因子發(fā)揮作用[14], AtSRO2、AtSRO3和AtSRO5也顯示出在強(qiáng)光、鹽處理及O3脅迫下轉(zhuǎn)錄子水平的變化, AtSRO4沒(méi)有明確的類(lèi)似功能[15]。

對(duì)于 SRO的功能研究除了模式植物擬南芥外,水稻、小麥、番茄等植物上也有報(bào)道[16]。水稻RCD1在一定的條件下有助于蛋白質(zhì)DREB2A的穩(wěn)定, 敲除 RCD1基因或缺失 RCD1結(jié)構(gòu)域的一部分, DREB2A蛋白功能將缺失[17]。在水稻中, SRO水稻蛋白 OsSRO1c, 與水稻干旱轉(zhuǎn)錄因子 SNAC1 和DST直接作用[18], 在干旱和氧化應(yīng)激反應(yīng)中通過(guò)氣孔作用扮演雙重身份。AtSRO其他成員在研究中較少涉及。上述研究顯示, SRO家族可能是一類(lèi)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子參與了植物對(duì)多種脅迫的應(yīng)答[19-21]。

棉花是重要的纖維作物, 迄今, 陸地棉中已克隆到了2個(gè)SRO基因, 分別為GhSRO04 (GenBank登錄號(hào)為KR534896)和GhSRO08 (GenBank登錄號(hào)為 KR534895), 這 2個(gè)基因受高鹽、干旱和黃萎病菌處理后誘導(dǎo)表達(dá), 表明SRO在棉花生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中應(yīng)對(duì)病菌、鹽和干旱脅迫起著重要的調(diào)節(jié)作用, 對(duì)棉花種質(zhì)的抗逆性遺傳改良具有潛在的利用價(jià)值[22]。棉花中對(duì)SRO家族的系統(tǒng)研究還未見(jiàn)報(bào)道, 為了探究棉花SRO在陸地棉中纖維發(fā)育及抵御逆境過(guò)程中扮演的角色, 本研究利用6個(gè)擬南芥SRO蛋白為查詢(xún)序列, 鑒定編碼棉花 SRO蛋白基因, 并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)和表達(dá)模式分析, 為進(jìn)一步明確SRO蛋白基因在棉花抗逆生長(zhǎng)發(fā)育中的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料及處理

陸地棉(Gossypium hirsutum L.)遺傳標(biāo)準(zhǔn)系TM-1由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所中熟課題提供。種植在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所東場(chǎng)試驗(yàn)站。在盛花期掛牌標(biāo)記當(dāng)日花, 采集當(dāng)日胚珠(0 DPA)及3、6、9、12、15、18、21、24、27和30 DPA (days post-anthesis)纖維, 迅速置液氮中冷凍并保存在–80℃冰箱, 取 TM-1種子, 剝?nèi)シN皮后用 0.1% HgCl2浸泡10 min, 滅菌水沖洗3～4次, 播種于1/2MS培養(yǎng)基上, 28℃暗培養(yǎng)4 d, 水培2周后取幼苗的根、莖、葉, 液氮處理后–80℃保存。選取生長(zhǎng)一致15 d苗齡的棉苗, 將根部的蛭石經(jīng)流水小心沖干凈, 快速置吸水紙上吸干, 分別進(jìn)行各種處理, 以正常生長(zhǎng)的幼苗為對(duì)照。高鹽處理是將根部浸在400 mmol L–1NaCl溶液中; 干旱脅迫是將苗置 20%PEG-600溶液中, 在相對(duì)濕度45%、連續(xù)光照條件下處理; 冷處理是將棉苗置于盛有水(已預(yù)冷到 4℃)的大燒杯中, 于 4℃培養(yǎng)箱, 持續(xù)光照; 熱處理是將棉苗置盛有水(已預(yù)冷到38℃)的大燒杯中, 于38℃培養(yǎng)箱, 持續(xù)光照; PEG、NaCl處理在25±2℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行[23]。分別于0、1、3、6和12 h采集各處理真葉葉片, 迅速置于液氮, –80℃保存, 用于總RNA提取。

大腸桿菌(Escherichia coli) Trans1-T1 Phage Resistant Chemically Competent Cell、DNase I、Reverse Transcriptase M-MLV (RNase H-)反轉(zhuǎn)錄酶等購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司; SYBR Premix Ex Taq試劑盒購(gòu)于TaKaRa公司, 其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純

1.2 陸地棉SRO的鑒定及序列分析

以 TAIR 數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.arabidopsis.org/ index.jsp)中6個(gè)擬南芥SRO蛋白序列為探針, 與四倍體陸地棉的基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.cottongen. org/)進(jìn)行 Blast比對(duì), 鑒定獲得陸地棉全基因組中SRO家族的所有成員及其CDS和氨基酸序列。運(yùn)用EBL-EBI (http://www.ebi.ac.uk/interpro/search/sequence-search)和NCBI的Blast P分析氨基酸序列的蛋白質(zhì)保守區(qū); 以IBS 2.0軟件繪制蛋白結(jié)構(gòu)域圖。

1.3 亞基因組定位

利用四倍體陸地棉的基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www. cottongen.org/)獲得染色體長(zhǎng)度及棉花 SRO家族成員在亞基因組上的位置分布; 用MapInspect軟件繪制SRO基因家族的染色體物理分布圖。

1.4 跨膜結(jié)構(gòu)及亞細(xì)胞定位

利 用 WOLF PSORT (http://psort.hgc.jp/)和TMHMM (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)軟件進(jìn)行信號(hào)肽、跨膜區(qū)及亞細(xì)胞定位分析。

1.5 多重序列比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析

利用Clustal W軟件對(duì)擬南芥和陸地棉SRO蛋白序列進(jìn)行多重序列比對(duì), 參數(shù)選為默認(rèn)值。利用MEGA 6.0軟件鄰接法(Neighbor-Join, NJ)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù), BootStrap值設(shè)定為1000。

1.6 棉花總RNA的提取及cDNA第1鏈的合成

用EASYspin Plus植物RNA快速提取試劑盒提取棉花總RNA, 經(jīng)DNase I處理后, 以ND1000紫外分光光度計(jì)測(cè)OD260/OD280值, 計(jì)算RNA的濃度與純度。用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性,保存于–80℃?zhèn)溆?。按照大連寶生物工程有限公司Reverse Transcriptase M-MLV (RNase H-)的說(shuō)明書(shū)合成cDNA第1鏈。

1.7 陸地棉SRO基因家族表達(dá)分析

采用 Tophat和 Cufflinks軟件包分析陸地棉(TM-1)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù), 檢索SRO家族不同組織及不同脅迫處理的RNA-Seq數(shù)據(jù)庫(kù), 獲得SRO基因表達(dá)量的FPKM (fragments per kilobase of exon per millon fragments mapped, FPKM)值。用層次聚類(lèi)算法[24]分析SRO在陸地棉不同組織及不同脅迫處理的表達(dá)數(shù)據(jù), 用HemI軟件繪制SRO基因不同組織及不同脅迫處理下的表達(dá)模式圖。用HemI 1.0軟件分析數(shù)據(jù), 獲得SRO在不同組織及不同逆境處理下的數(shù)據(jù)信息, 明確SRO基因在不同組織及不同逆境中的表達(dá)情況。

為驗(yàn)證并進(jìn)一步了解棉花SRO基因家族在棉花不同組織中的表達(dá)模式, 參照 RNA-Seq數(shù)據(jù)庫(kù), 選取 Gh_A05G2257和 Gh_D05G2516基因作為探究SRO基因家族在棉花纖維不同時(shí)期的表達(dá)模式的研究對(duì)象, 選取 Gh_A05G3788、Gh_D12G2054和Gh_D12G1442基因作為探究 SRO基因家族在棉花不同組織中的表達(dá)模式的研究對(duì)象, 分別設(shè)計(jì) 5對(duì)特異性實(shí)時(shí)熒光定量引物(表1), 以棉花根、莖、葉、花和不同發(fā)育時(shí)期的棉纖維 cDNA為模板進(jìn)行qPCR擴(kuò)增。

為明確棉花SRO基因家族在棉花中對(duì)逆境脅迫的應(yīng)答機(jī)制, 參照 RNA-Seq數(shù)據(jù)庫(kù), 選取 Gh_ A12G2663、Gh_D12G2054、Gh_A08G1390和 Gh_ D08G1685基因?yàn)檠芯繉?duì)象, 分別設(shè)計(jì)4對(duì)特異性實(shí)時(shí)熒光定量引物(表1), 以棉花根、莖、葉、花和不同發(fā)育時(shí)期的棉纖維cDNA為模板進(jìn)行qPCR擴(kuò)增。在羅氏Light Cycler 480實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行 qPCR, 反應(yīng)體系含 SYBR Premix Ex Taq (2×) (Tli RNaseH Plus) 5 μL、10 μmol L–1上下游引物各0.4 μL, cDNA模板1 μL, 補(bǔ)dd H2O至10 μL。反應(yīng)程序?yàn)?94℃1 min; 95℃ 15 s, 52～56℃ 20 s, 72℃30 s, 45個(gè)循環(huán)。3次重復(fù), 每次試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)重復(fù),按照2–ΔΔCt法分析結(jié)果。以上實(shí)時(shí)熒光定量部分都以Action作為內(nèi)參引物。

表1 本研究所用的引物Table 1 Primers used in the study

2 結(jié)果與分析

2.1 陸地棉SRO基因家族的鑒定及序列分析

以6個(gè)擬南芥SRO蛋白(AtRCD1及AtSRO1-5)為探針, 從陸地棉基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www. cottongen.org/)中鑒定出 12個(gè) SRO家族基因, 其編碼區(qū)長(zhǎng)度為 993～1890 bp, 編碼蛋白序列長(zhǎng)度為330～629個(gè)氨基酸(表2)。

表2 陸地棉SRO基因家族序列信息Table 2 Sequence information of GhSRO family genes

2.2 陸地棉SRO基因家族的物理定位

在陸地棉A和D亞基因組分別分布有6個(gè)SRO家族基因, 分別位于A05、DO5、A08、D08、A12和D12上。在A亞組和D亞組有GhSRO基因分布的對(duì)應(yīng)亞組間, 都存在成對(duì)的平行進(jìn)化同源基因, 在 A12和D12這1對(duì)亞基因組中有3對(duì)平行進(jìn)化同源基因,在A05和D05有2對(duì)平行進(jìn)化同源基因, 在A08和D08亞基因組中只有1對(duì)平行進(jìn)化同源基因(圖1)。

圖1 陸地棉亞基因組上的SRO基因家族的分布Fig. 1 Mapping of GhSRO family genes on cotton subgenomes

2.3 陸地棉SRO蛋白功能結(jié)構(gòu)域分析

利用EBL-EBI在線分析, 結(jié)合NCBI中Blast P比對(duì), 發(fā)現(xiàn) 12個(gè)棉花 SRO蛋白成員均具有 PARP (Poly ADP-ribose polymerase)催化中心和C-末端的RST [RCD-SRO-TAF4 (TATA-box-binding proteinassociated factor 4)]結(jié)構(gòu)域, 有的成員還含有WWE結(jié)構(gòu)域(圖 2)。根據(jù)SRO蛋白序列中所包含的保守功能區(qū)域, 將SRO分為3種亞家族, A類(lèi)SRO亞家族包含PARP和RST結(jié)構(gòu)域, 分別位于第259～477氨基酸之間和第532～587氨基酸之間; B類(lèi)SRO亞家族包含WWE、PARP和RST 3個(gè)結(jié)構(gòu)域, 分別位于第38～173氨基酸之間、第178～400氨基酸之間和第330～517氨基酸之間; C類(lèi)SRO亞家族包含PARP和RST結(jié)構(gòu)域, 分別位于第25～222氨基酸之間和第240～332氨基酸。PARP和RST結(jié)構(gòu)域是植物特有的, 由于棉花 SRO蛋白質(zhì)氨基酸序列的長(zhǎng)度不同,棉花SRO蛋白中PARP和RST結(jié)構(gòu)域出現(xiàn)的位置和長(zhǎng)度也不同, 推測(cè)其功能也不相同。

圖2 陸地棉SRO蛋白結(jié)構(gòu)Fig. 2 Structure of GhSRO proteins

2.4 陸地棉SRO蛋白進(jìn)化關(guān)系

陸地棉SRO蛋白與擬南芥SRO蛋白的多重序列比較表明, 其同源區(qū)域主要集中在 PARP-RST結(jié)構(gòu)域(圖3)。

系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)表明, 12個(gè)陸地棉SRO蛋白中Gh_ D08G1685、Gh_D12G2054、Gh_D12G1442、Gh_ A08G1390、Gh_A12G2663聚為一類(lèi), 屬于A類(lèi)SRO亞家族; Gh_A05G3788、Gh_A05G2257、Gh_ D05G2064、Gh_D05G2516聚為一類(lèi), 屬于 B類(lèi)類(lèi)SRO亞家族、Gh_A12G2480、Gh_D12G2608、Gh_ A12G1318聚為一類(lèi), 屬于C類(lèi)SRO亞家族(圖4)。

2.5 陸地棉SRO蛋白跨膜結(jié)構(gòu)及亞細(xì)胞定位

12個(gè)陸地棉 SRO家族蛋白均沒(méi)有跨膜區(qū)和信號(hào)肽存在; 其細(xì)胞功能定位并不相同, Gh_ D08G1685、Gh_D12G2054、Gh_D12G1442、Gh_ A08G1390、Gh_A12G2663和Gh_D05G2516定位于細(xì)胞核, 其他成員除了定位于細(xì)胞核外, 還定位于細(xì)胞質(zhì)、微體(過(guò)氧化氫酶體)和葉綠體(表3)。因此,推測(cè)SRO蛋白具有不同的功能。

2.6 陸地棉不同組織中 SRO基因家族的表達(dá)模式分析

圖5表明, 12個(gè)GhSRO基因在不同組織中均有表達(dá)。根據(jù)其表達(dá)模式, 可分為5種類(lèi)型: (1)組成型表達(dá)的包 Gh_A08G1390、Gh_D08G1685、Gh_ A12G2663和 Gh_D12G2054; (2)莖中優(yōu)勢(shì)表達(dá)的是Gh_D12G1442; (3)萼片和雄蕊中優(yōu)勢(shì)表達(dá)的是 Gh_ D05G2064; (4)在雄蕊中優(yōu)勢(shì)表達(dá)的是 Gh_ A05G3788; (5)在雄蕊和纖維中優(yōu)勢(shì)表達(dá)的是 Gh_ A12G1318。其中 Gh_A12G2480、Gh_D12G2608、Gh_A05G2257、Gh_D05G2516在纖維中優(yōu)勢(shì)表達(dá)。

為了驗(yàn)證并進(jìn)一步了解棉花SRO基因家族在棉花不同組織中的表達(dá)模式, 參照陸地棉(TM-1)不同組織及不同發(fā)育階段纖維的 RNA-Seq數(shù)據(jù)(圖 5), Gh_A05G3788、Gh_D12G2054、Gh_A05G2257、Gh_D05G2516和Gh_D12G1442基因?qū)崟r(shí)熒光定量分析表明, 這 5個(gè)基因在棉花不同組織及纖維各個(gè)發(fā)育時(shí)期均有表達(dá), 其中, Gh_D12G2054的相對(duì)表達(dá)量在根、莖、葉、花中均高于在纖維中, 且在雄蕊中優(yōu)勢(shì)表達(dá), 在纖維中各個(gè)時(shí)期均有表達(dá), 但0DPA 表達(dá)量高于其他纖維時(shí)期, 說(shuō)明 Gh_ D12G2054可能參與纖維起始階段的發(fā)育。Gh_ A05G3788在雄蕊中優(yōu)勢(shì)表達(dá), 與 RNA-Seq數(shù)據(jù)分析結(jié)果一致(圖 6)。Gh_D12G1442在纖維中優(yōu)勢(shì)表達(dá), Gh_A05G2257和Gh_D05G2516在纖維中特異表達(dá), 這 3個(gè)基因具有進(jìn)一步研究的價(jià)值, 可將分子生物學(xué)和遺傳學(xué)方法運(yùn)用到解析棉花纖維生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控機(jī)制研究中, 并可將其選為目標(biāo)基因轉(zhuǎn)化棉花改良棉花纖維的品質(zhì)。

2.7 逆境脅迫處理下陸地棉SRO表達(dá)分析

12個(gè)陸地棉 SRO對(duì)逆境脅迫均存在應(yīng)答響應(yīng);隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng), Gh_D08G1685、Gh_ D12G2054、Gh_A12G2663和Gh_A08G1390基因的表達(dá)趨勢(shì)都不相同, 表達(dá)量發(fā)生了明顯的變化(圖7)。qPCR的結(jié)果表明, Gh_D08G1685、Gh_D12G2054、Gh_A12G2663和 Gh_A08G1390對(duì)于 4種脅迫都存在明顯的響應(yīng), 變化趨勢(shì)不盡相同(圖8)。

圖3 陸地棉SRO蛋白與擬南芥SRO蛋白多重序列比對(duì)Fig. 3 Amino acid sequences alignment of GhSRO and AtSRO proteins

表3 陸地棉SRO基因家族蛋白信號(hào)肽、跨膜區(qū)及亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)Table 3 Prediction of signal peptide, transmembrane structure, and subcellular localization for SRO proteins

圖4 陸地棉SRO蛋白與擬南芥SRO蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig. 4 Phylogenic relationship of GhSRO and AtSRO proteins

如圖8所示, Gh_A08G1390在正常生長(zhǎng)狀況下, 0 h表達(dá)量很低, 其表達(dá)模式在0～1 h之間沒(méi)有明顯變化, 在1 h后, 表達(dá)量急劇增加, 在3 h達(dá)最高值,從3～6 h表達(dá)量又迅速下降, 在6 h時(shí)RNA轉(zhuǎn)錄水平和1 h時(shí)基本一致, 12 h時(shí)RNA轉(zhuǎn)錄水恢復(fù)到0 h。而在不同逆境處理后, Gh_A08G1390表達(dá)模式發(fā)生了明顯的變化, 特別是熱處理和 PEG處理后, 在處理期間表達(dá)量基本沒(méi)有變化, 而在NaCl和冷處理后,表達(dá)模式和CK基本一致, 不同的是, NaCl處理后1 h時(shí)達(dá)到高峰, 且此時(shí)RNA轉(zhuǎn)錄水平遠(yuǎn)高于CK 3 h時(shí)的最高值, NaCl處理后1～3 h表達(dá)量迅速下降, 12 h RNA轉(zhuǎn)錄水恢復(fù)到0 h。Gh_A08G1390在冷處理后的表達(dá)模式和NaCl處理一致, 但在1 h的轉(zhuǎn)錄水平遠(yuǎn)低于NaCl處理后的最高值。陸地棉Gh_A08G1390在不同逆境環(huán)境下的應(yīng)答反應(yīng)說(shuō)明該基因很可能在參與植物響應(yīng)逆境脅迫過(guò)程, 并起重要作用。

Gh_D12G2054在正常生長(zhǎng)條件下呈現(xiàn)先升高后降低且在3 h達(dá)到最大值的表達(dá)模式, NaCl處理和熱處理后的表達(dá)模式與CK一致, 不同的是NaCl處理后1 h達(dá)到最高值, 熱處理后6 h達(dá)到最高值。而在PEG處理后其表達(dá)量在1 h達(dá)到最高值, 1～6 h之間先降低后升高, 在3 h達(dá)到最小值, 6～12 h表達(dá)量緩慢下降。在冷處理后, 表達(dá)量先降低后升高, 然后再3 h后又開(kāi)始下降, 在1 h后表達(dá)模式與CK一致。Gh_D12G2054基因在不同的脅迫處理下表現(xiàn)出的表達(dá)模式,可能參與不同的脅迫調(diào)控途徑, 與RNA-Seq數(shù)據(jù)庫(kù)中基因響應(yīng)脅迫應(yīng)答相一致。

Gh_D08G1685在四種脅迫下與CK相比, 其表達(dá)模式也存在一定的差異, 在 PEG, 熱處理及冷處理情況下, 表達(dá)模式和CK相同, 呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì), 不同的是該基因在不同處理下轉(zhuǎn)錄水平達(dá)到最高值的時(shí)間不同, CK在3 h達(dá)到最高值, PEG處理后在6 h達(dá)到最高值。熱處理后在6 h達(dá)到最高值。在冷處理后1 h就達(dá)到了最高值。而在NaCl處理情況下, 表達(dá)模式為先升高后降低, 再升高再降低,表達(dá)量1 h達(dá)到最高值。

圖5 GhSRO基因家族在陸地棉中的表達(dá)模式Fig. 5 Expression patterns of GhSRO genes family in Gossypium hirsutum L.

圖6 GhSRO家族基因在棉花不同組織中的qRT-PCR分析Fig. 6 Quantitative real-time PCR analyses of expression levels of GhSRO family genes in different tissues in cotton

Gh_A12G2663在4種脅迫下與CK相比, 其表達(dá)模式基本一致, 即先升高后降低, 但RNA的轉(zhuǎn)錄水平達(dá)到最高值的時(shí)間不同, CK在6 h, PEG、NaCl和熱處理在3 h達(dá)到最高值, 而冷處理和CK一樣,在6 h時(shí)達(dá)到最高, 且在1～6 h之間表達(dá)量有一個(gè)緩慢的上升過(guò)程。

圖7 GhSRO基因家族不同逆境處理下RNA-Seq表達(dá)分析Fig. 7 GhSRO family genetic RNA-seq expression analysis under various abiotic stresses

圖8 GhSRO基因家族各種非生物脅迫下基因的表達(dá)Fig. 8 Expression profiles of GhSRO family genes under various abiotic stresses

3 討論

由于全球氣候變化和土壤鹽漬化, 使得非生物脅迫成為限制棉花生長(zhǎng)和產(chǎn)量的主要環(huán)境因子[23],挖掘一些重要的抗逆基因顯得十分重要, 而陸地棉全基因組數(shù)據(jù)庫(kù)完成為我們提供了有利的工具。SRO是植物中特有的一類(lèi)小蛋白家族, 在植物逆境反應(yīng)中具有重要的作用。擬南芥中共有6個(gè)SRO家族成員, 以擬南芥6個(gè)SRO家族成員蛋白序列為探針, 共鑒定出12個(gè)陸地棉SRO家族成員。這12個(gè)SRO蛋白成員和馬駿駿等[22]從抗枯萎病耐黃萎病的棉花品種魯棉32中克隆獲得的 2個(gè) SRO基因GhSRO04和GhSRO08不同, 這可能是因?yàn)椴煌薹N之間序列存在多態(tài)性。蛋白質(zhì)進(jìn)化關(guān)系表明, 12個(gè)陸地棉SRO蛋白中Gh_D08G1685、Gh_D12G2054、Gh_D12G1442、Gh_A08G1390和Gh_A12G2663聚為一類(lèi), 屬于 A類(lèi) SRO亞家族; Gh_A05G3788、Gh_A05G2257、Gh_D05G2064和Gh_D05G2516聚為一類(lèi), 屬于 B類(lèi) SRO亞家族, Gh_A12G2480、Gh_D12G2608和 Gh_A12G1318聚為一類(lèi), 屬于 C類(lèi)SRO亞家族。B類(lèi)SRO亞家族具有WWE、PARP和RST 3個(gè)結(jié)構(gòu)域, WWE結(jié)構(gòu)域與酵母 Yap1中的WW 基序具有一定的同源性[13,24], 目前該區(qū)域被認(rèn)為是介導(dǎo)蛋白與蛋白之間相互作用的特異功能區(qū)域[25-27]。這些研究進(jìn)一步明確了陸地棉SRO家族在植物SRO家族中的類(lèi)別。

四倍體陸地棉基因組屬于AADD型, 研究發(fā)現(xiàn)A亞組和D亞組的基因存在很高的共線性[28], 本研究鑒定出的陸地棉12個(gè)SRO基因在A亞組和D亞組中的分布就很好地體現(xiàn)了這一特性, 通過(guò)對(duì)陸地棉12個(gè)SRO家族成員的物理定位分析表明, 12個(gè)SRO基因家族在陸地棉 A和D亞基因組對(duì)稱(chēng)分布,分別位于A05、D05、A08、D08和A12、D12, 且都存在成對(duì)的平行進(jìn)化同源基因。蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)域及信號(hào)肽分析表明陸地棉SRO蛋白屬于定點(diǎn)蛋白,在一些固定位置如細(xì)胞核和葉綠體、微體上與其他蛋白相互作用, 參與棉花的發(fā)育及各種脅迫反應(yīng)。

轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析表明, 部分家族成員存在組織特異性表達(dá)。定量 RT-PCR結(jié)果也驗(yàn)證了部分基因的特異表達(dá)模式。特別對(duì) Gh_A05G3788、Gh_ D12G2054、Gh_A05G2257、Gh_D05G2516和 Gh_ D12G144在棉花不同組織中的表達(dá)模式分析表明, Gh_A05G3788在雄蕊中優(yōu)勢(shì)表達(dá), 與RNA-Seq數(shù)據(jù)分析結(jié)果一致。Gh_D12G1442在纖維中優(yōu)勢(shì)表達(dá), Gh_A05G2257和Gh_D05G2516在纖維中特異表達(dá),這 3個(gè)基因具有進(jìn)一步研究的價(jià)值, 可將分子生物學(xué)和遺傳學(xué)方法運(yùn)用到解析棉花纖維生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控機(jī)制研究中, 并可將其選為目標(biāo)基因轉(zhuǎn)化棉花改良棉花纖維的品質(zhì)。

馬駿駿等[22]實(shí)時(shí)熒光定量 PCR (qRT-PCR)分析基因表達(dá)顯示, GhSRO04和GhSRO08基因均受黃萎病菌侵染、干旱和高鹽誘導(dǎo)表達(dá), 表明 GhSRO04和GhSRO08在棉花應(yīng)對(duì)鹽、旱和病菌脅迫中可能起著重要的調(diào)節(jié)作用[17]。參照不同逆境處理RNA-Seq表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù), 挖掘 4個(gè)基因 Gh_D08G1685、Gh_ D12G2054、Gh_A12G2663、Gh_A08G1390, 實(shí)時(shí)熒光定量分析表明, 這 4個(gè)基因在一定程度上參與棉花的脅迫反應(yīng), 特別是基因 Gh_A08G1390, 對(duì)各種脅迫特別是干旱脅迫, 熱脅迫反應(yīng)比較敏感, 在處理的12 h之間基本不表達(dá), 可能是植物自身調(diào)節(jié)以對(duì)抗外界環(huán)境的改變, 更說(shuō)明Gh_A08G1390受干旱脅迫的誘導(dǎo)。而在冷處理和鹽處理的情況下, 在1 h表達(dá)量達(dá)到最大值, 而后急劇下降, 在6 h RNA反轉(zhuǎn)錄水平和未處理前一樣, 說(shuō)明Gh_A08G1390受冷處理和鹽處理的誘導(dǎo)。Gh_A08G1390屬于A類(lèi)SRO亞家族, 而在擬南芥中, RCD1和SRO1同屬于A類(lèi) SRO亞家族, 擬南芥RCD1的功能缺失突變體導(dǎo)致對(duì)鹽、葡萄糖、非原生質(zhì)體活性氧的敏感性增加[10], RCD1和SRO1的雙突變體, 在不同生長(zhǎng)發(fā)育階段的生物脅迫應(yīng)答均受到嚴(yán)重影響[7,9], 這些影響都與調(diào)節(jié)氧化還原平衡的改變有關(guān)[29]。小麥的SRO1對(duì)于提高非生物脅迫抗性和調(diào)節(jié)體內(nèi)的氧化還原平衡具有重要的作用[30], 可以顯著提高植株對(duì)鹽害的耐受性。所以推測(cè)Gh_A08G1390是棉花脅迫反應(yīng)過(guò)程中的一個(gè)重要基因, 可能承擔(dān)著RCD1和SRO1相似的作用, 有必要對(duì) Gh_A08G1390進(jìn)行深入的研究,探索其在棉花生物脅迫過(guò)程中的作用。

本試驗(yàn)全面分析了SRO基因家族在陸地棉基因組的存在情況, 并找到了棉花發(fā)育過(guò)程中不同組織特異和優(yōu)勢(shì)表達(dá)的基因和棉花生物脅迫過(guò)程中可能的關(guān)鍵基因。有必要克隆并深入研究這些基因。本文為研究這些基因的分子生物學(xué)功能提供了基礎(chǔ)理論依據(jù), 同時(shí)也為棉花及其他植物中SRO家族的鑒定和功能研究奠定了數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

從陸地棉中鑒定到12個(gè)SRO家族基因, 均含有PARP和 RST結(jié)構(gòu)域, 聚為 3類(lèi), A 類(lèi)含 Gh_ D08G1685、Gh_D12G2054、Gh_D12G1442、Gh_ A08G1390 和 Gh_A12G2663; B 類(lèi) 含 Gh_ A05G3788、Gh_A05G2257、Gh_D05G2064和 Gh_ D05G2516; C類(lèi)含 Gh_A12G2480、Gh_D12G2608和 Gh_A12G1318。它們編碼的蛋白在 330～629氨基酸之間, TM-1全基因組中的Gh_D12G1442在莖中優(yōu)勢(shì)表達(dá), Gh_D05G2064在萼片和雄蕊中優(yōu)勢(shì)表達(dá); Gh_A05G3788在雄蕊中優(yōu)勢(shì)表達(dá), Gh_A12G1318在雄蕊和纖維中優(yōu)勢(shì)表達(dá); Gh_A12G2480、Gh_D12G2608、Gh_A05G2257和Gh_D05G2516在纖維中優(yōu)勢(shì)表達(dá); Gh_A08G1390、Gh_D08G1685、Gh_A12G2663和Gh_D12G2054具有較為廣泛的組織表達(dá)。Gh_A08G1390明顯受冷處理和鹽處理的誘導(dǎo), Gh_D12G2054、Gh_D08G1685、Gh_A12G2663基因在不同的脅迫處理下受到不同程度的誘導(dǎo)。

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Genome-wide Identification and Expression Analysis of SRO Genes Family in Gossypium hirsutum L.

LYU You-Jun1,2,3, YANG Wei-Jun1, ZHAO Lan-Jie2, YAO Jin-Bo2, CHEN Wei2, LI Yan2, and ZHANG Yong-Shan2,*

1Anyang Institute of Technology, Anyang 455000, China;2Institute of Cotton Research, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Anyang 455000, China;3State Key Laboratory of Cotton Biology, Anyang 455000, China

RCD-ONE proteins family (SRO) is a kind of plant-specific proteins, which plays an important role in plants in response to different abiotic stress. In this study, 12 SRO genes were preliminary identified in Gossypium hirsutum L. standard line TM-1 by bioinformatics analysis. Multiple sequence alignment and phylogenetic tree analysis showed that these SROs contain PARP and RST domains, and could be divided into A, B, and C subfamilies. Transcriptome data analysis showed that in the whole genome of TM-1, Gh_D12G1442 advantageously expressed in the stem, Gh_D05G2064 in the sepals and stamens, Gh_A05G3788 advantage expression in stamens, Gh_A12G1318 in stamens and fiber, Gh_A12G2480, Gh_D12G2608, Gh_A05G2257, Gh_D05G2516 advantage expression in fiber; Gh_A08G1390, Gh_D08G1685, Gh_A12G2663, and Gh_D12G2054 in wider organs. In stress treatment showed that Gh_A08G1390 was obviously induced by cold and salt treatments, Gh_D12G2054, Gh_D08G1685, Gh_A12G2663 gene were induced try different stresses to a different degrees.

Upland cotton; Abiotic stress; SRO; Genomics

(

): 2017-01-05; Accepted(接受日期): 2017-05-10; Published online(網(wǎng)絡(luò)出版日期): 2017-06-05.

10.3724/SP.J.1006.2017.01468

本研究由河南省科技廳基礎(chǔ)與前沿項(xiàng)目(112300410019)和棉花生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放課題(CB2014A10)共同資助。

This study was support by the Basic and Cutting-edge Research Project for the Science and Technology Agency of Henan Province (112300410019) and the Open Projects for State Key Laboratory of Cotton Biology (CB2014A10).

*通訊作者(Corresponding author): 張永山, E-mail: 13938698299@163.com, Tel: 13938698299

聯(lián)系方式: E-mail: 781692734@qq.com, Tel: 17698308361

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