一個(gè)水稻溫敏黃化突變體的表型分析和基因定位

張?zhí)煊曛艽豪讋?喜孫愛伶曹鵬輝Thanhliem NGUYEN田云錄翟虎渠,江 玲,* 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 / 農(nóng)業(yè)部長(zhǎng)江中下游粳稻生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 / 江蘇省植物基因工程技術(shù)研究中心, 江蘇南京 0095;中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院, 北京 0008

一個(gè)水稻溫敏黃化突變體的表型分析和基因定位

張?zhí)煊?周春雷1劉 喜1孫愛伶1曹鵬輝1Thanhliem NGUYEN1田云錄1翟虎渠1,2江 玲1,*1南京農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 / 農(nóng)業(yè)部長(zhǎng)江中下游粳稻生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 / 江蘇省植物基因工程技術(shù)研究中心, 江蘇南京 210095;2中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院, 北京 100081

對(duì)水稻葉色進(jìn)行表型分析與基因定位, 可為圖位克隆該類基因和研究水稻光合系統(tǒng)功能奠定基礎(chǔ)。利用甲基磺酸乙酯(ethyl methanesulfonate, EMS)誘變的方法, 從秈稻品種“南京11”(簡(jiǎn)稱NJ11)中獲得溫敏黃化突變體dy1;與野生型相比, dy1在自然環(huán)境下, 從苗期至成熟期始終表現(xiàn)葉片黃化, 透射電鏡顯示 dy1類囊體結(jié)構(gòu)異常; 同時(shí)株高、分蘗數(shù)、結(jié)實(shí)率等農(nóng)藝性狀也表現(xiàn)出極顯著的差異; 實(shí)驗(yàn)室光照培養(yǎng)箱條件下, dy1苗期在20℃下表現(xiàn)白化, 在25℃表現(xiàn)黃化, 在30℃下為淺綠的表型; 遺傳分析表明水稻溫敏黃化突變體dy1的表型是由1對(duì)隱性基因控制; 將突變體與粳稻廣親和品“02428”雜交, 構(gòu)建 F2群體, 從中選出隱性極端個(gè)體, 通過(guò)基因定位, 將控制黃化的基因限定在第1染色體長(zhǎng)臂上標(biāo)記Y-4和Y-35之間的115 kb的區(qū)間內(nèi), 含有16個(gè)開放閱讀框(ORF), 測(cè)序發(fā)現(xiàn), dy1中編碼尿嘧啶核苷酸激酶的基因LOC_Os01g73450的第4個(gè)內(nèi)含子與第5個(gè)外顯子交界處存在單堿基替換, 擬作為候選基因;且葉綠體合成相關(guān)基因表達(dá)量顯著降低, 猜測(cè)該基因可能參與了葉綠素合成途徑。

水稻; 溫度敏感型; 遺傳分析; 葉色; 基因定位

水稻葉色突變多發(fā)生在苗期, 包含白化、黃化、淺綠、綠白、白翠、黃綠、綠黃、條紋8種表現(xiàn)類型[1-2]。水稻葉色突變經(jīng)常表現(xiàn)為葉綠素合成或者降解過(guò)程受阻, 進(jìn)而影響光合作用, 最終造成植株長(zhǎng)勢(shì)減弱、減產(chǎn)甚至死亡。隨著功能基因組學(xué)的不斷發(fā)展, 葉色突變體在研究植物光合作用機(jī)制、明確葉綠體的結(jié)構(gòu)功能和闡明遺傳調(diào)控機(jī)制上, 以及作為標(biāo)記性狀在簡(jiǎn)化良種繁育和雜交制種過(guò)程中均有重要應(yīng)用價(jià)值[3-4]。迄今為止, 利用水稻葉色突變體已成功定位到約100個(gè)水稻葉色相關(guān)基因, 其中, 大部分是與葉綠素代謝和葉綠體發(fā)育相關(guān)的。例如,從水稻黃綠葉突變體中圖位克隆到 OsYGL1基因,編碼葉綠素合成酶, 該基因突變后, 葉綠素合成酶活性降低, 葉綠素合成受抑制, 導(dǎo)致葉片黃化[5]。編碼葉綠素a氧化酶的OsPGL基因突變影響葉綠素合成和葉綠體超微結(jié)構(gòu), 使葉片早衰, 間接影響水稻產(chǎn)量和品質(zhì)[6]。Chl1和Chl9基因分別編碼鎂螯合酶的ChlD和ChlI亞基, 在葉綠體發(fā)育與質(zhì)-核信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中發(fā)揮重要作用, 在 chl1和 chl9突變體中,葉片表現(xiàn)出淺黃綠色表型[7]。水稻葉色白化突變體Oschr4, 葉綠體的結(jié)構(gòu)異常, 導(dǎo)致葉片近軸一側(cè)出現(xiàn)白化表型, OsCHR4編碼一類染色質(zhì)重組因子, 主要調(diào)節(jié)水稻幼葉早期葉綠體的合成[8]。此外, 多個(gè)白化轉(zhuǎn)綠基因的功能也被發(fā)掘出來(lái)。V3基因編碼一個(gè)核苷酸還原酶, 調(diào)控 DNA的合成和修復(fù)[9]?；騍GR的過(guò)量表達(dá)能夠促進(jìn)葉綠素的分解, 減少葉片當(dāng)中類囊體片層數(shù)目, sgr突變后導(dǎo)致類囊體膜上的捕光葉綠素結(jié)合蛋白(LHCP)復(fù)合體穩(wěn)定性降低, 造成葉片的滯綠[10]。雖然水稻全基因組測(cè)序完成, 越來(lái)越多調(diào)控水稻葉色的基因逐漸被發(fā)掘出來(lái), 但是葉綠素的合成和降解機(jī)制仍未全面揭示。

本研究利用化學(xué)誘變的方法, 得到了一個(gè)溫敏黃葉突變體 dy1, 該突變體在自然條件下從苗期至成熟期一直表現(xiàn)出黃葉的表型, 實(shí)驗(yàn)室光照培養(yǎng)箱條件下表現(xiàn)出低溫白化的表型。與野生型NJ11相比,突變體株高變矮, 單株產(chǎn)量降低, 分蘗數(shù)減少, 每穗粒數(shù)減少, 且抽穗期延遲。透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)突變體 dy1的葉綠體結(jié)構(gòu)明顯受損, 類囊體片層排列疏松無(wú)序。遺傳分析表明黃化葉色表型是受隱性單基因控制。選取與突變體表型一致的 800個(gè)極端個(gè)體, 利用SSR和InDel多態(tài)性標(biāo)記, 最終將其定位在第1染色體標(biāo)記Y-4與Y-5之間的115 kb區(qū)間內(nèi), 包含16個(gè)ORF, 測(cè)序發(fā)現(xiàn), 突變體中一個(gè)編碼尿嘧啶核苷酸激酶的基因LOC_Os01g73450存在單堿基替換, 初步確定為候選基因。

1 材料與方法

1.1 材料與群體構(gòu)建

溫敏黃葉突變體dy1是從秈稻品種“南京11”(簡(jiǎn)稱NJ11)通過(guò)化學(xué)試劑EMS誘變獲得的, 經(jīng)過(guò)南京和海南陵水試驗(yàn)基地多代自交繁殖, dy1的表型和其他農(nóng)藝性狀均已穩(wěn)定遺傳。在海南陵水試驗(yàn)基地,將突變體dy1和野生型NJ11正反交配組, 用于構(gòu)建遺傳分析群體, 將突變體dy1和“02428”(江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院選育的廣親和粳型種質(zhì))雜交, 用于構(gòu)建基因定位群體, 所得 F1均種植于南京土橋試驗(yàn)基地, 得到F2種子。

1.2 dy1主要農(nóng)藝性狀調(diào)查

將突變體dy1和野生型NJ11室溫浸種48 h、催芽12 h之后播種于南京農(nóng)業(yè)大學(xué)土橋試驗(yàn)基地, 自然條件下生長(zhǎng)。在成熟期, 調(diào)查野生型和突變體的株高、千粒重和結(jié)實(shí)率等主要農(nóng)藝性狀。利用萬(wàn)深SC-G自動(dòng)考種分析儀測(cè)定千粒重, 重復(fù)3次, 隨機(jī)取20株測(cè)定株高等農(nóng)藝性狀, 利用t測(cè)驗(yàn)分析統(tǒng)計(jì)結(jié)果差異的顯著性。

1.3 光合色素含量的測(cè)定

突變體和野生型種子室溫下浸種 48 h, 30℃催芽12 h, 分別播種于為20℃、25℃、30℃的GXZ智能光照培養(yǎng)箱內(nèi), 每天光照12 h, 培養(yǎng)2周后取第2葉0.05 g, 剪成0.5 cm長(zhǎng)的小塊, 黑暗條件下浸泡在5 mL 96%乙醇溶液的離心管中48 h, 期間多次輕柔搖晃, 吸取上清液 100 μL, 利用多功能酶標(biāo)儀Sp470ectra MaxM3 microplate reader, 測(cè)定波長(zhǎng)在665、649和470 nm下的吸光值。根據(jù)Lichtenthaler[11]的方法, 計(jì)算單位質(zhì)量葉綠素 a (Chl a)、葉綠素 b (Chl b)含量。在自然條件下, 用同樣方法, 測(cè)定抽穗期突變體和野生型劍葉的葉綠素含量。

1.4 透射電鏡觀察

自然環(huán)境下, 在抽穗期選取野生型和突變體劍葉, 將其切成長(zhǎng)寬為5 mm × 2 mm的條狀小塊, 浸泡在 2%的戊二醛和 0.2 mol L–1pH 7.2 Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液中, 固定 24 h。隨后用不同梯度(30%、50%、70%、80%、90%、100%)的乙醇溶液逐級(jí)脫水, 用環(huán)氧樹脂包埋, LKB-V型切片機(jī)制片,最后用醋酸鈾染色, 在Hitachi H-7650 (日立)透射電鏡下觀察并照相。

1.5 dy1基因定位

將定位群體播種在南京土橋試驗(yàn)基地, 2周后選取與突變體表型一致的極端個(gè)體 800株。利用稍加修改的CTAB法提取葉片DNA, 首先取新鮮葉片1 g,剪成0.5 cm的小段于2.0 mL離心管中, 于液氮中冷凍 15 min, 用高速打樣器研磨至粉末狀; 隨后加入65℃水浴過(guò)的DNA提取液(100 mL Tris-HCl, pH 8.0, 40 mL EDTA, pH 8.0, 20 g CTAB, 81.9 g NaCl溶解到1 L水中) 600 μL, 65℃水浴30 min; 之后加入三氯甲烷與異戊醇混合液(24∶1) 600 μL, 輕微混勻, 變?yōu)槿榘咨? 4℃下13 800×g離心, 吸取上清液200 μL于新的1.5 mL離心管中, 向其中加入120 μL異丙醇, -20℃冷凍30 min, 出現(xiàn)白色絮狀物, 13 800×g離心,倒掉離心管中液體; 加入 400 μL 70%的酒精溶液,輕微搖晃, 4℃下13 800×g離心, 倒掉離心管中液體,自然吹干, 殘留固體即為所需 DNA; 最后加入適量的TE溶液溶解, 測(cè)定DNA濃度(NanoDrop2000分光光度計(jì), Thermo公司), 儲(chǔ)存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

利用實(shí)驗(yàn)室已有的分子標(biāo)記篩選突變體與雜交親本之間多態(tài)性, 選出均勻分布于12條染色體且多態(tài)性良好的分子標(biāo)記150對(duì), 利用F2群體中10株極端個(gè)體進(jìn)行初步連鎖分析。根據(jù)定位區(qū)間, 利用Primer 5.0加密區(qū)間內(nèi)的標(biāo)記, 同時(shí)增加極端單株800株用于精細(xì)定位。精細(xì)定位引物序列見表1。

表1 用于精細(xì)定位的多態(tài)性標(biāo)記Table 1 Molecular markers used in fine-mapping of the dy1 locus

1.6 葉綠素合成相關(guān)基因定量分析

分別取 20℃和 30℃GXZ智能培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 2周的突變體和野生型的幼苗第2葉, 使用RNA Prep Pure Plant Kit試劑盒(天根生化有限公司)提取RNA。取2 μg RNA作為模板, 經(jīng)SuperScript II Kit試劑盒(TaKaRa公司)反轉(zhuǎn)錄為 cDNA。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析上述樣品中葉綠素合成相關(guān)基因的表達(dá)水平。本文中涉及的基因有谷氨酰-tRNA還原酶(HEMA)、谷氨酰-1-半醛轉(zhuǎn)氨酶(HEML)、膽色素原合酶(HEMB)、羥甲基后膽色素原合酶(HEMC)、尿卟啉原脫羧酶(HEME)、糞卟啉原脫羧酶(URO-D)、糞卟啉原 III氧化酶(HEMF)、鎂螯合酶 D亞基(CHLD)、鎂螯合酶H亞基(CHLH)、鎂螯合酶I亞基(CHLI)、鎂原卟啉IX甲基轉(zhuǎn)移酶(CHLM)、鎂原卟啉IX單甲酯環(huán)化酶(CRD)、二乙烯還原酶(DVR)、NADPH原葉綠素酸酯氧化還原酶(POR)和葉綠素合成酶(CHLG), 內(nèi)參基因?yàn)樗?Actin基因[12-14]。按照95℃ 30 s、95℃ 5 s、60℃ 30 s, 40個(gè)循環(huán)的程序在7500 Real-time PCR儀(Applied Biosystems公司)上擴(kuò)增, 利用自帶軟件分析 CT值, 計(jì)算出目的基因的表達(dá)量。參照劉喜等[12]葉綠素合成相關(guān)基因定量引物。

2 結(jié)果與分析

2.1 dy1表型分析

調(diào)查南京正季自然環(huán)境下的表型, 發(fā)現(xiàn)突變體dy1在自然環(huán)境下苗期和成熟期均為黃化表型, 且突變體株高顯著降低, 第1、第2、第3節(jié)間均比野生型顯著縮短, 分別只為野生型的67.4%、56.6%和53.8% (圖1)。同時(shí)突變體分蘗數(shù)減少, 穗長(zhǎng)變短, 只為野生型的 77.8%, 單株產(chǎn)量顯著降低, 但在籽粒大小和千粒重方面, 野生型和突變體無(wú)顯著差異(表2)。

2.2 dy1對(duì)溫度的敏感性及其光合色素的含量

溫度處理表明, 突變體對(duì)溫度敏感, 在 20℃低溫環(huán)境下表現(xiàn)白化, 在25℃下表現(xiàn)黃化, 在30℃下表現(xiàn)為淡綠(圖 2)。對(duì)三葉期葉綠素含量測(cè)定發(fā)現(xiàn),不同溫度下dy1幼苗葉片中葉綠素a、葉綠素b含量均極顯著低于野生型, 葉綠素 a分別為野生型的81.3%、53.1%和 30.8%, 葉綠素 b分別為野生型的76.6%、55.8%和31.5% (表3)。

圖1 自然條件下NJ11和dy1在苗期和灌漿期的表型Fig. 1 Phenotypes of NJ11 and dy1 at seedling and mature stages under natural condition

表2 野生型NJ11和突變體dy1的農(nóng)藝性狀Table 2 Agronomic traits of the wild type NJ11 and dy1 mutant

圖2 3種溫度下野生型NJ11和突變體dy1表型Fig. 2 Phenotypes of NJ11 and dy1 under three temperature conditions

表3 3種溫度下野生型NJ11和dy1三葉期幼苗葉片中葉綠素含量Table 3 Chlorophyll contents in leaves of dy1 and NJ11 seedlings at 3-leaf stage under the three temperature conditions

2.3 dy1抽穗期葉綠體超微結(jié)構(gòu)和葉綠素含量

對(duì)自然條件下生長(zhǎng)至抽穗期的NJ11和dy1劍葉中葉綠體超微結(jié)構(gòu)的觀察表明, 野生型中葉綠體發(fā)育正常, 結(jié)構(gòu)完整, 類囊體片層清晰(圖3-A, B), 突變體葉片中葉綠體的發(fā)育受到明顯影響, 類囊體結(jié)構(gòu)異常(圖3-C, D)。同時(shí)該時(shí)期突變體中葉綠素含量顯著低于野生型(圖3-E, F)。

2.4 dy1基因的遺傳分析

圖3 NJ11和dy1劍葉葉綠體超微結(jié)構(gòu)和葉綠素含量Fig. 3 TEM images of chloroplast structure and the chlorophyll contents of the flag leaf in NJ11 and dy1

表4 dy1基因的遺傳分析Table 4 Genetic analysis of the dy1 gene

突變體dy1與親本NJ11正反交, 后代F1在自然條件下生長(zhǎng), 葉片顏色正常, 說(shuō)明該表型受到隱性核基因控制。在南京土橋試驗(yàn)基地自然田間條件下播種, 并統(tǒng)計(jì)F2群體中正常葉色幼苗與黃葉幼苗數(shù),分析表明, 綠葉幼苗∶黃葉幼苗的株數(shù)分離比符合3∶1, 說(shuō)明該表型受到1對(duì)隱性基因控制(表4)。

2.5 基因定位

從dy1和“02428”雜交得到的F2群體中, 隨機(jī)選10株極端個(gè)體, 提取DNA, 并選取150個(gè)在兩親本間多態(tài)性良好且均勻分布于12條染色體的SSR和InDel標(biāo)記, 進(jìn)行連鎖分析, 將突變基因初步定位在第 1染色體標(biāo)記N1-48與N1-50之間, 物理距離約為1876 kb,進(jìn)一步增加極端個(gè)體數(shù)量至 800株, 同時(shí)加密區(qū)間內(nèi)的標(biāo)記, 最終精確定位在標(biāo)記Y-4與Y-35之間, 物理距離約為115 kb, 且與Y-20標(biāo)記共分離。區(qū)間內(nèi)共包含16個(gè)開放閱讀框(ORF, 圖4), 測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)突變體dy1中, 一個(gè)編碼尿嘧啶核苷酸激酶的基因 LOC_ Os01g73450, 在第4個(gè)內(nèi)含子與第5個(gè)外顯子連接處存在單堿基差異(圖4), 推測(cè)其內(nèi)含子在剪切的時(shí)候發(fā)生錯(cuò)誤, 造成突變體的表型, 擬將其作為候選基因。

2.6 葉綠素合成相關(guān)基因定量分析

突變體dy1在20℃時(shí)葉片表現(xiàn)白化, 葉綠素含量顯著降低, 30℃時(shí)表現(xiàn)淡綠, 因此, 對(duì) 20℃和 30℃條件下dy1及其野生型幼苗的第2葉(在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2周)中葉綠素合成相關(guān)基因的表達(dá)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析。結(jié)果表明, 與野生型相比, 在20℃時(shí) dy1幼苗中葉綠素合成相關(guān)基因的表達(dá)水平普遍降低, 尤其是羥甲基后膽色素原合酶(HEMC)、鎂離子螯合酶H亞基(CHLH)、原葉綠素酸酯氧化還原酶A(POR)、谷氨酰-1-半醛轉(zhuǎn)氨酶(HEML)等基因(圖5-A)。30℃時(shí), dy1幼苗中大部分基因表達(dá)量與野生型差異并不明顯, 但鎂離子螯合酶 H亞基(CHLH),聯(lián)乙烯還原酶(DVR), 原葉綠素酸酯氧化還原酶 A (POR)基因的表達(dá)量仍明顯低于野生型(圖5-B)。

圖4 水稻葉色基因在第1染色體的精細(xì)定位及候選基因Fig. 4 Fine mapping of the putative gene controlling leaf color on chromosome 1 in rice

3 討論

為解決愈發(fā)嚴(yán)峻的糧食安全問(wèn)題, 作為主要產(chǎn)量來(lái)源的光合作用成為科研的重點(diǎn), 葉色突變體的作用也越來(lái)越重要, 通過(guò)不斷深入研究, 發(fā)現(xiàn)葉色突變體可以應(yīng)用于多個(gè)方面, 如作為標(biāo)記性狀應(yīng)用于雜交水稻制種; 常綠突變體可延緩葉片衰老, 最終提高產(chǎn)量, 為高產(chǎn)育種提供基因資源; 葉色突變發(fā)生較為頻繁, 目前在玉米、高粱、大豆等很多作物上均已報(bào)道過(guò)葉色基因, 可作為研究光合作用機(jī)制、葉綠素相關(guān)基因的調(diào)控作用模式的良好材料[14-15]。葉色突變體包含一類溫敏型突變體。迄今, 低溫敏感葉色突變體已有5個(gè)基因被克隆, 即virescent-1 V1 (V1virescent1)[16]、virescent-2 (v2)[17]、OsV4[18]、TCD9[19]和WLP1[20]。V1 (virescent1)基因編碼一個(gè)定位在葉綠體的假定蛋白, C端結(jié)構(gòu)與細(xì)菌中的抗終止子NusB (N utilization substance protein B)高度相似, 命名為NUS1蛋白, NUS1蛋白在新葉中特異表達(dá), 且低溫下積累增多, 突變體v1在20℃時(shí)為黃化表型, 在 30℃時(shí)為正常綠葉表型, 是因?yàn)?NUS1蛋白參與調(diào)控葉綠體RNA的代謝, 葉綠體內(nèi)的蛋白翻譯機(jī)制遭到破壞時(shí)無(wú)法正常形成葉綠體, 從而形成白化的葉片[17,21-22]。OsV4編碼一個(gè)定位在葉綠體內(nèi)部的三角狀五肽重復(fù)區(qū)蛋白(PPR), 參與植物細(xì)胞器中轉(zhuǎn)錄本的修飾[18], 突變體在低溫下白化表型一直持續(xù)到四葉期, 之后逐漸轉(zhuǎn)綠, 而在高溫環(huán)境下突變體并無(wú)白化表型, 可見 OsV4在水稻早期葉綠體發(fā)育中起重要作用。TCD9編碼一個(gè)葉綠體伴侶蛋白α亞基, 在葉片發(fā)育早期促進(jìn)葉綠體的發(fā)育。在擬南芥中伴侶蛋白有很多報(bào)道, 但在水稻中并不多見,在低溫下tcd9突變體幼苗的葉綠素含量降低, 葉綠體結(jié)構(gòu)異常, 類囊體片層減少, 但是在高溫下突變體呈現(xiàn)正常的綠色[23]。WLP1編碼葉綠體核糖體大亞基(50S)蛋白, 是合成蛋白質(zhì)的細(xì)胞器的組成部件,在低溫環(huán)境下, wlp1為白葉白穗表型, 而且開花延遲, 株高變高[20]。通過(guò)對(duì)溫敏型葉色突變體基因的定位可以更好地闡釋溫度對(duì)葉色的影響機(jī)制, 為實(shí)現(xiàn)更高效的光合效率提供重要幫助。

本研究通過(guò)EMS誘變得到溫敏黃化突變體dy1,在低溫下表現(xiàn)白化, 高溫下表現(xiàn)淡綠, 與野生型相比在株高、分蘗數(shù)等農(nóng)藝性狀上差異顯著。利用dy1/“02428”的F2群體, 將突變基因定位在第1染色體長(zhǎng)臂標(biāo)記Y-4和Y-35之間, 擬作為候選基因進(jìn)一步研究, 該基因編碼一個(gè)尿嘧啶核苷酸激酶, 催化尿嘧啶(UMP)形成二磷酸尿核苷(UDP), 在嘧啶合成中起到重要作用, 該基因的突變引起葉綠素合成相關(guān)基因表達(dá)的顯著下調(diào), 推測(cè)該基因有可能參與葉綠素的合成途徑(圖 5)。在擬南芥中, 發(fā)現(xiàn)一個(gè)UMP激酶缺失型突變體dpt1 (defect in psaA/B transcript accumulation 1), 表現(xiàn)幼苗葉片黃化, 該基因可以調(diào)節(jié)擬南芥光合效率, 并參與光合系統(tǒng) I葉綠素脫輔基蛋白A/B (psaA/B)的轉(zhuǎn)錄過(guò)程[24-25], 而本研究的突變體表型與擬南芥 dpt1表型不同, 在不同溫度下, 呈現(xiàn)不同的葉色, 暗示該基因在水稻中的作用機(jī)制更為復(fù)雜。本文突變體dy1將為揭示UMP激酶功能和葉綠素合成機(jī)理之間的關(guān)系提供寶貴材料。

圖5 兩種溫度下NJ11和dy1幼苗中第2葉葉綠素合成相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)水平Fig. 5 Relative expression levels of genes involved in chlorophyll biosynthesis in the second leaf of NJ11 and dy1 seedlings under two temperature conditions

4 結(jié)論

通過(guò)化學(xué)誘變的方法得到一個(gè)溫敏黃化突變體dy1, 與野生型相比, dy1株高和分蘗數(shù)明顯降低, 抽穗期推遲1周。dy1在水稻生長(zhǎng)的整個(gè)生育期均表現(xiàn)黃化, 且葉片葉綠體結(jié)構(gòu)異常, 葉綠素含量顯著降低。dy1突變是由1對(duì)隱性基因控制, 被定位在第1染色體Y-4與Y-35之間, 共包含16個(gè)ORF, dy1突變體中基因 LOC_Os01g73450存在單堿基差異, 擬作為候選基因, 有待進(jìn)一步分析。

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Phenotypes and Gene Mapping of a Thermo-sensitive Yellow Leaf Mutant of Rice

ZHANG Tian-Yu1, ZHOU Chun-Lei1, LIU Xi1, SUN Ai-Ling1, CAO Peng-Hui1, Thanhliem NGUYEN1, TIAN Yun-Lu1, ZHAI Hu-Qu1,2, and JIANG Ling1,*

1State Key Laboratory of Crop Genetics and Germplasm Enhancement / Key Laboratory of Biology, Genetics and Breeding of Japonica Rice in Mid-lower Yangtze River, Ministry of Agriculture / Research Center of Jiangsu Plant Gene Engineering, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China;2Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China

Phenotypic analysis and gene mapping of rice leaf color could lay a foundation for map-based cloning of related genes and the function research of rice photosynthetic system. Leaf yellow mutant dy1 was obtained from rice cultivar “Nanjing 11”(abbreviated as NJ11) mutated by ethyl methanesulfonate (EMS). The mutant dy1 showed leaf yellowing at seedling stage and maturity stage in natural environment, with an abnormal structure of thylakoids under TEM, and significant differences in plant height, tiller number, seed setting rate and so on. The mutant dy1 showed albinism in 20°C, etiolation in 25°C and virescence in 30°C. The rice leaf yellow mutant dy1 was controlled by a single recessive gene. F2population was constructed by crossing the mutant with “02428”, and the mutant phenotypes of extreme individuals were selected to map gene dy1. The gene was located in the 115 kb region of the long arm of chromosome 1, and contained 16 ORFs. Sequencing analysis showed that LOC_Os01g73450 controlling a uracil nucleotide kinase, with a single base substitution in the junction of the fourth intron and the fifth exon in dy1, might be a candidate gene. And the expression of genes related to chloroplast synthesis was significantly decreased, indicating dy1 may involve in the chloroplast synthesis

Rice; Thermo-sensitive; Genetic analysis; Leaf color; Gene mapping

(

): 2017-03-02; Accepted(接受日期): 2017-05-10; Published online(網(wǎng)絡(luò)出版日期): 2017-05-23.

10.3724/SP.J.1006.2017.01426

本研究由國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(2016YFD0100101-08), 江蘇省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(BE2015363), 江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新項(xiàng)目[CX(16)1029]和安徽省科技重大專項(xiàng)(16030701068)資助。

This study was supported by the National Key Research and Development Program of China (2016YFD0100101-08), the Science and Technology Support Project of Jiangsu Province (BE2015363), the Independent Innovation Project for Agricultural Science and Technology of Jiangsu Province [CX(16)1029], and the Science and Technology Major Projects of Anhui Province (16030701068).

*通訊作者(Corresponding author): 江玲, E-mail: jiangling@njau.edu.cn

聯(lián)系方式: E-mail: olytianyu@163.com

URL: http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20170523.1856.004.html