試析微生物分類鑒定技術(shù)在白酒釀造領(lǐng)域的應(yīng)用

王毅

摘 要：很多現(xiàn)代微生物技術(shù)都已經(jīng)被用在白酒釀造之中，本文對幾種當前廣泛應(yīng)用的方式進行了介紹，尤其對以PCR為基礎(chǔ)的DNA指紋圖譜分類鑒定技術(shù)做了重點的介紹和說明，并且說明了幾種鑒定技術(shù)在當前白酒釀造領(lǐng)域方面的應(yīng)用情況，希望可以有助于以后對于微生物群落進行研究奠定基礎(chǔ)，進而推動我國白酒釀造技術(shù)的進一步發(fā)展。

關(guān)鍵詞：基因；微生物；多樣性；菌株；分離

我國釀造白酒的歷史由來已久了，其釀造環(huán)境有很多外在的影響因素可能會影響到白酒生產(chǎn)的質(zhì)量，其中最空氣、水源和土壤等等都會影響到環(huán)境微生物的構(gòu)成，而在發(fā)酵過程中，窖泥和微生物環(huán)境共同決定了微生物多樣化的情況，進而對傳統(tǒng)白酒的產(chǎn)品風(fēng)格帶來了一定程度的影響。把現(xiàn)代微生物技術(shù)和傳統(tǒng)的白酒釀造技術(shù)結(jié)合起來，并且在發(fā)酵工藝中進行推廣應(yīng)用，就能夠進一步推動我國白酒釀造技術(shù)的發(fā)展，彌補技術(shù)和理論方面的空白。

1 傳統(tǒng)的微生物鑒定分類的方法

傳統(tǒng)的微生物分類堅定方式就是用最直接的方式來鑒定白酒中的微生物。過程按照先后順序分為5個步驟，分別是采樣、計數(shù)、培養(yǎng)和分離以及最后的鑒定。首先在采集步驟們對于不同部分都采集一部分樣品，包括酒曲、酒醪、窖泥以及周圍的水和空氣。對樣品中的微生物進行計數(shù)就是第二個階段了。這個階段主要有三種方式可以進行。第一種最為簡便快捷的就是顯微鏡法，但是這種方式無法區(qū)分死菌和活菌。第二種是活菌計數(shù)方式，可以直接顯示活菌的數(shù)量，即有繁殖能力的微生物群，第三種是最大可能計數(shù)法，這種計數(shù)方式可以用來測定具有特殊功能的菌群。第三個步驟是富集培養(yǎng)，富集培養(yǎng)階段起到的作用是擴大微生物的數(shù)量，增加可以研究的樣本，為接下來的研究打好基礎(chǔ)。第四個步驟是把菌群分離，其方式是進行平板劃線，采用的是梯度稀釋的方法，這樣就可以實現(xiàn)分離菌群的效果，更加方便研究。最后一個步驟是生化實驗，按照相應(yīng)的手冊和規(guī)范，對菌落進行生化試驗，然后將試驗的結(jié)果運用顯微鏡來進行觀察，最后堅定菌株，這樣就完成了微生物鑒定的工作

2 基于PCR的DNA指紋圖譜分類鑒定技術(shù)

生物技術(shù)在近年已經(jīng)在分子水平方面得到了完善，其中PCR技術(shù)進步最為明顯，這樣一來，就可以用分子來鑒定微生物了。和舊有的堅定方式相比，方式更為快速、結(jié)果更為簡便，并且也可以直接將未知的微微生物檢測出來。

2.1 PCR-DGGE克隆分析技術(shù)

這種技術(shù)也可以稱之為聚合酶鏈式反應(yīng)和變性梯度凝膠電泳技術(shù)。其中聚合酶鏈式反應(yīng)的用處是對體外特異性目的片段進行擴增。而變形梯度凝膠電泳技術(shù)的原理是在聚丙烯酰胺凝膠里加入尿素添加劑和變性劑甲酰胺，這樣就會直接形成一個線性梯度，其排列方式是從低到高。在相同的溫度下，DNA的解鏈速率不同就會產(chǎn)生不同的電泳遷移率。通過電泳區(qū)別率方面的區(qū)別，就可以分離出DNA片段。之后把條帶中的DNA通過PCR的形式進行擴增，就可以進行微生物分類方面的鑒定了。

2.2 SSCP技術(shù)

這種技術(shù)是根據(jù)DNA具有多態(tài)性這一特點，并且結(jié)合上文提到的PCR技術(shù)，就可以分析遺傳學(xué)方面的特征。霉菌全長的ITS區(qū)序列包含了不同的序列，以及中間的ITSI和ITS2區(qū)的完整序列，信息是很豐富的，所以全場序列的分析技術(shù)經(jīng)常被用來鑒定霉菌分子生物。

2.3 末端限制性片段長度分析（T-RFLP）技術(shù)

T-RFLP是一種分析生物群落的指紋技術(shù)，用于鑒定分析不同微生物群落結(jié)構(gòu)以及它們的多樣性。方法是將真菌或細菌設(shè)計一對合適的引物，并用熒光物質(zhì)對引物的一端進行標記，經(jīng)PCR擴增和酶切后用特定的自動測序儀進行測序。根據(jù)檢測到的帶有熒光標記的DNA片段與相應(yīng)數(shù)據(jù)庫進行比對判斷微生物區(qū)系多樣性，可以鑒定到微生物種和屬；根據(jù)熒光強度的強弱可以確定該種的豐度。

2.4 擴增片段長度多態(tài)性（AFLP）分子標記技術(shù)

擴增片段長度多態(tài)性標記技術(shù)是建立在RFLP基礎(chǔ)上的選擇性聚合酶鏈反應(yīng)，利用可產(chǎn)生粘性末端的限制性內(nèi)切酶酶切研究對象的基因組序列，產(chǎn)生不同長度的酶切片段。將這些酶切片段與含有與其有共同粘性末段的人工接頭連接，形成模板，再在模板末段添加具有選擇性核苷酸（1～3個）的不同引物，然后PCR擴增，結(jié)果只有那些兩端序列與選擇性核苷酸配對的酶切片段被擴增。

3 磷脂脂肪酸法分類

這種方式最早在上個世紀七十年代后期開始研究了，在用途上用來分析微生物的定量。這種分析方式對于舊有的方式存在的缺點都有所彌補，可以直接對微生物中的復(fù)雜群落進行研究，總體上來說，檢測存在著快捷和可靠的優(yōu)勢。在進行測定的時候可以通過磷脂脂肪酸的種類的不同，對于不同菌類繁殖能力進行研究。通過相關(guān)的圖譜分析還可以定性和定量分析微生物種類群，就可以確定類群的數(shù)量和種類。此外這種方式還經(jīng)常用來對活體微生物群落進行標記，一般認為生物體細胞內(nèi)是恒定的，所以對于微生物變化的過程，這種方式可以直接進行揭示。

4 Biolog微平板

Biolog技術(shù)由美國Biolog公司于1989年開發(fā)成功，最初應(yīng)用于純種微生物的鑒定，至今已經(jīng)能夠鑒定包括細菌、酵母、霉菌在內(nèi)的近2000多種病原微生物和環(huán)境微生物。Biolog微平板可以用于估價微生物群落代謝多樣性和功能多樣性的研究，與其他鑒定系統(tǒng)相比，Biolog方法在用于環(huán)境微生物的研究時，靈敏度高，分辨力強，并且數(shù)據(jù)的讀取和記錄可以由計算機輔助完成，自動化和標準化程度增高，簡化了鑒定程序，提高了鑒定效率。

5 基因序列的同源性分析技術(shù)

5.1 16SrRNA/rDNA序列分析1

6SrRNA/rDNA序列分析已經(jīng)成為了細菌種屬鑒定和分類的標準方法。通過將待測菌株的16SrDNA序列進行擴增、測序并進行數(shù)據(jù)的同源性比對分析。然后按照一定的標準，把測序結(jié)果分成若干個操作分類單元。然后將OTU所代表的序列提交到GenBankBLAST數(shù)據(jù)庫中，通過尋找相似度最高的16SrDNA序列，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，就可以對菌株進行準確、迅速而科學(xué)的定位。

5.2 18SrRNA/rDNA序列分析原核生物細胞中的16SrDNA和真核生物細胞中的18SrDNA的堿基序列都是十分保守的，并且不受微生物所處環(huán)境條件的影響。因此，通過分析比較微生物種之間16SrDNA和18SrDNA的同源性，可以真實的揭示它們的親緣關(guān)系和系統(tǒng)發(fā)育地位。對于真核生物而言，18SrRNA可以鑒定其系統(tǒng)發(fā)育地位。

結(jié)束語

如果想要了解白酒釀造中的微生物的多樣性和數(shù)量以及其變化規(guī)律，就少不了對制曲工藝和釀造環(huán)境等因素進行分析，進而對不同窖齡的白酒都進行有效的分類和堅定。本文介紹了幾種鑒定白酒中微生物的方式，并且對發(fā)酵過程中微生物的演變情況做了研究，希望可以讓白酒發(fā)酵方面的理論更為完善。進而為未來的微生物變化差異的研究奠定了基礎(chǔ)，也有利于研究霉菌和細菌的變化差異，有助于釀制出不同風(fēng)格、不同品味的白酒。

參考文獻

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